Zeida Camacho, Ari F.. 2015 12 11 "Estructura y mecanismo de acción de peroxirredoxinas: e

185 Pages·2016·2.01 MB·Spanish

Tesis Doctoral
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Zeida Camacho, Ari F.
2015-12-11
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Zeida Camacho, Ari F.. (2015-12-11). Estructura y mecanismo de acción de peroxirredoxinas:
estudio teórico y experimental. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de
Buenos Aires.
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Zeida Camacho, Ari F.. "Estructura y mecanismo de acción de peroxirredoxinas: estudio teórico
y experimental". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2015-
12-11.
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Estructura y mecanismo de acción de
peroxirredoxinas: estudio teórico y
experimental
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el
área Química Inorgánica, Química Analítica y Química Física

Autor
Ari F. Zeida Camacho

Directores de Tesis:
Dr. Darío Ariel Estrin
Dra. Madia Trujillo

Consejero de Estudios:
Dr. José Antonio Olabe

Lugar de trabajo:
Grupo de Modelado Molecular.
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física.
Instituto de Química Física de los Materiales, Medio Ambiente y Energía (INQUIMAE-
CONICET).
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2015.
Fecha de defensa: 11 de diciembre de 2015.

Estructura y mecanismo de acción de peroxirredoxinas: estudio teórico y
experimental
RESUMEN
Las peroxirredoxinas (Prxs) constituyen una familia de proteínas encargadas de
catalizar la reducción de peróxidos, con función antioxidante y de señalización redox,
entre otras. Estas enzimas se encuentran ampliamente distribuidas entre los organismos
procariotas y eucariotas, y están usualmente presentes en altas concentraciones. Todas
ellas comparten el mismo primer paso en su mecanismo catalítico básico, en el cual la
cisteína del sitio activo se oxida a ácido sulfénico por sustratos peróxidos tales como
peróxido de hidrógeno (H O ), peroxinitrito, y una gran variedad de hidroperóxidos
2 2
orgánicos, lo que ocurre con constantes de velocidad varios órdenes de magnitud
mayores que para cisteína libre. Particularmente, la alquil hidroperóxido reductasa E
(AhpE) de Mycobacterium tuberculosis es una Prx que reacciona más rápido con
peroxinitrito que con H O y que presenta una reactividad particularmente alta frente a
2 2
hidroperóxidos derivados de ácidos grasos.
El presente trabajo de tesis aporta información microscópica acerca de los
mecanismos de reducción de peróxidos mediada por tioles, tanto en solución acuosa
como en el contexto de la reacción catalizada por Prxs. Para tal fin se emplearon una
combinación de técnicas de simulaciones computacionales clásicas, cuánticas e híbridas
cuántico-clásicas, en combinación con estudios experimentales de cinética rápida de
flujo detenido y de equilibrio.
En primer lugar se estudiaron las reacciones de oxidación de tioles de bajo peso
molecular por H O y peroxinitrito en solución acuosa, determinando los parámetros
2 2
termodinámicos de activación y describiendo a nivel molecular el proceso reactivo.
Posteriormente se investigaron los determinantes moleculares de la capacidad catalítica
de Prxs, utilizando como modelo de trabajo la MtAhpE. En último lugar se analizó la
especificidad por el sustrato oxidante para el caso particular de la MtAhpE, comparando
la interacción y reactividad con H O y diferentes hidroperóxidos orgánicos.
2 2

Palabras clave: tioles, peróxidos, cisteína, peroxirredoxinas, dinámica molecular,
QM/MM, estado de transición, parámetros de activación, cinética a flujo detenido.

Structure and reaction mechanism of peroxiredoxins: a theoretical and
experimental study
ABSTRACT
Peroxiredoxins (Prxs) constitute a protein family that catalyzes the reduction of
peroxides, with antioxidant and redox signaling functions, among others. These
enzymes are ubiquitous and widely distributed in prokaryote and eukaryote organisms,
and are usually found at high concentrations. They all share the same first step of their
basic catalytic mechanism; the cysteine residue in the active-site gets oxidized by
peroxides such as hydrogen peroxide (H O ), peroxynitrite and a variety of organic
2 2
hydroperoxides, which occurs several orders of magnitude faster than in the case of free
cysteine. In particular, alkyl hydroperoxide reductase (AhpE) from Mycobacterium
tuberculosis is a Prx that reacts faster with peroxynitrite than with H O and shows a
2 2
particularly high reactivity versus fatty acid derived hydroperoxides.
The present thesis work is focused in providing molecular insights about peroxide
reduction mechanisms by thiols, both in aqueous solution and in the context of the
catalyzed reaction by Prxs. For this purpose, a combination of classical, quantum and
hybrid quantum-classical simulations, together with fast stopped-flow kinetics and
equilibrium experiments was performed.
First, we studied the reactions of low molecular weight thiols with H O and
2 2
peroxynitrite in aqueous solution, determining the thermodynamic activation parameters
and describing the reactive process at the molecular level. Afterwards, we investigated
the molecular basis of Prxs catalytic ability, using MtAhpE as a model. Finally, the
substrate specificity of MtAhpE was analyzed via the comparison of the interaction and
reactivity with H O and different organic hydroperoxides.
2 2

Keywords: thiols, peroxides, cysteine, peroxiredoxins, molecular dynamics, QM/MM,
transition state, activation parameters, stopped-flow kinetics.

A Ire.
A mi familia, toda.
Al abuelo Palo, siempre.
“Creo que el conocimiento científico tiene propiedades fractales: que por mucho que
aprendamos, lo que queda, por pequeño que parezca, es tan infinitamente complejo
como el todo por el que empezamos. Ese, creo yo, es el secreto del universo.”
Isaac Asimov - autobiografía
ÍNDICE GENERAL
Resumen
Abstract
I Introducción general 1
I.1 Fisicoquímica de proteínas: un espacio de convergencia disciplinar 1
I.2 Cisteína: un aminoácido peculiar 3
I.2.1 Bioquímica redox del grupo tiol 5
I.2.2 Oxidación de tioles por peróxidos: una reacción central 9
I.3 Peroxirredoxinas 12
I.3.1 Historia y clasificación actual 12
I.3.2 Estructura y función 14
I.3.3 Modelo de peroxirredoxina: la alquil-hidroperóxido reductasa E de
Mycobacterium tuberculosis 23
I.4 Objetivos y lineamientos de esta Tesis 29
I.5 Referencias 30
II Métodos 38
II.1 Métodos computacionales 38
II.1.1 Acerca de simular 38
II.1.2 Métodos basados en la Mecánica Cuántica 40
II.1.2.1 Principios básicos 40
II.1.2.2 Teoría del funcional de la densidad 53
II.1.3 Métodos basados en la Mecánica Clásica 59
II.1.3.1 Campos de fuerza clásicos 59
II.1.4 Métodos híbridos cuántico-clásicos (QM/MM) 64
II.1.5 Exploración de la superficie de energía potencial 68
II.1.5.1 Optimizaciones de geometría 69
II.1.5.2 Dinámica Molecular 72
II.1.5.3 Cálculos de energía libre: dinámica molecular dirigida, muestreo
sesgado (umbrella sampling) y unión de ligandos 79
II.2 Métodos experimentales 84
II.2.1 Cinética rápida a flujo detenido 84