VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta chemická DIZERTAČNÍ PRÁCE

149 Pages·2017·2.66 MB·English

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ
Fakulta chemická
DIZERTAČNÍ PRÁCE
Brno, 2017 Ing. Pavla Benešová
VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ
BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ
FACULTY OF CHEMISTRY
ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ
INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
BIOPRODUKCE, CHARAKTERIZACE A APLIKACE
VYBRANÝCH BIOPOLYMERŮ
BIOPRODUCTION, CHARACTERIZATION AND APPLICATION OF SELECTED BIOPOLYMERS
DIZERTAČNÍ PRÁCE
DOCTORAL THESIS
AUTOR PRÁCE Ing. Pavla Benešová
AUTHOR
ŠKOLITEL prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.
SUPERVISOR
BRNO 2017
Zadání dizertační práce
Ústav: Ústav chemie potravin a biotechnologií

Studentka: Ing. Pavla Benešová

Studijní program: Chemie a technologie potravin

Studijní obor: Potravinářská chemie

Vedoucí práce: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.

Akademický rok: 2016/17

Název dizertační práce:
Bioprodukce, charakterizace a aplikace vybraných biopolymerů
Zadání dizertační práce:
V průběhu dizertační práce budou řešeny následující dílčí kroky:
1) Zpracování literární rešerše zaměřené na biotechnologickou produkci a charakterizaci přírodních
polymerů - PHA, pullulanu, PMLA
2) Vývoj a optimalizaci metod zaměřených na:
- řízenou kultivaci mikrobiálních producentů PHA, pullulanu a PMLA za účelem dosažení maximální
produkce
- optimalizaci kultivačních podmínek a typů substrátů
- přípravu a charakterizaci biomateriálů na bázi přírodních polymerů
- přípravu nanovláken
3) Aplikace mikrobiálních biopolymerů:
- optimalizace biotechnologického procesu za účelem dosažení vysokého výtěžku polymerů
s charakteristickými vlastnostmi,
- příprava funkcionalizovaných částic a nanovláken, testování vlastností
- stabilita a biodegradabilita polymerů a aplikačních forem v modelových i reálných podmínkách
Termín odevzdání dizertační práce: 31.3.2017
Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně / Purkyňova 464/118 / 612 00 / Brno
Ing. Pavla Benešová prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.

student(ka) vedoucí práce vedoucí ústavu

prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc.
V Brně dne 12.6.2012
děkan
Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně / Purkyňova 464/118 / 612 00 / Brno
ABSTRAKT
Předložená dizertační práce je zaměřena na mikrobiální produkci biopolymerů s využitím
obnovitelných zdrojů, jako zdroje uhlíku a dusíku. Mikrobiálně byly produkovány
polysacharidy a polyestery. S využitím především odpadních substrátů byl produkován
pullulan a polymer kyseliny jablečné jako extracelulární metabolity polymorfního
mikroorganismu Aureobasidium pullulans. Další část práce je věnována biotechnologické
produkci bakteriálních plastů – polyhydroxyakanoátů (PHA), které jsou bakteriemi
produkovány ve formě intracelulárních granulí. Produkce biodegradabilních PHA je zaměřena
jak na produkci poly(3-hydroxybutyrátu), tak také na biosyntézu technologicky významného
kopolymeru poly(3-hydroxybutyrát-co-3-hydroxyvalerátu), s důrazem na možnost využití
odpadních substrátů v rámci konceptu biorafinerie. Do konceptu biorafinerie zapadá zejména
využití kávové sedliny pro produkci PHA. Hydrolyzát kávové sedliny byl využit jako substrát
pro Burkholderia cepacia, akumulován byl P(3HB-co-3HV) bez nutnosti přídavku
prekurzoru. Další kávový odpad představoval olej extrahovaný z kávové sedliny, který byl
taktéž využit pro produkci PHA bakterií Cupriavidus necator. Optimalizován byl proces
hydrolýzy odpadních materiálů, které byly využity pro produkci biopolymerů, s důrazem na
finální obsah sacharidů a polyfenolů. Odpadní materiály nebyly využity pouze jako zdroje
uhlíku, ale také jako komplexní zdroj dusíku. Hydrolyzáty syrovátky a kuřecího peří byly
použity, jako komplexní zdroj dusíku pro produkci PHA C. necator, pro kultivaci byl jako
zdroj uhlíku využit odpadní fritovací olej.
V rámci předložené dizertační práce byla snaha využít zejména PHA pro přípravu různých
aplikačních forem. Připraveny byly lipozomy s přídavkem PHB a odpadním kávovým olejem,
které vykazovaly antioxidační a antimikrobiální efekt. Nano- (mikro)vlákenné materiály
z PHB byly připraveny za účelem filtrace mikrobiálních suspenzí. Pro zlepšení filtračních
schopností byly připraveny kompozitní PHB vlákenné materiály s přídavkem aktivního uhlí a
oxidů kovů. Součástí této práce je také studium degradace polyhydroxyalkanoátů, kdy byla
studována produkce PHA depolymeráz u vybraných mikroorganismů. Testována byla také
biodegradabilita různých PHA forem standardním kompostovacím testem IS/ISO 20200.
Tento test byl také použit pro studium mechanických vlastností polyuretanu s parciálním
obsahem PHB v závislosti na délce působení kompostovacích podmínek.

Klíčová slova: Biopolymery, odpadní substráty, polyhydroxyalkanoáty, pullulan, polymer
kyseliny jablečné, degradace

3
ABSTRACT
Proposed doctoral thesis deals with microbial production of biopolymers (polysaccharides and
polyesters) using renewableble inexpensive resources as carbon and nitrogen source. At first,
production of extracellular metabolites, mainly pullulan and poly-L-malic acid, by
polymorphic microorganism Aureobasisium pullulans was studied. Further part of thesis was
focused on production of bacterial biopolyesters polyhydroxyalkanoates (PHA). PHA are
produced in the form of intracellular granules by various bacteria species. During the study of
PHA production, sythesis of poly(3-hydroxybutyrate) and technologically significant
copolymer poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) was investigated as well with
regard to waste substrate utilization in biorafinery concept. Spent coffee ground seemed to be
applicable waste in biorefinery proces. One of the coffee wastes used for PHA production was
spent coffee ground hydrolysate which was converted to PHA by Burkholderia cepacia.
Moreover, copolymer of 3HB and 3HV was accumulated when SCGH was used as a sole
carbon source, no precursor had to be added. Another coffee waste, which was utillized by
Cupriavidus necator H16, is represented by oil extracted from spent coffee grounds.
Hydrolysis proces of waste substrates had to be optimized, to reach the highest possible
saccharide concentration. Due to the hydrolysis process several toxic compounds can be
formed, hence, influence of hydrolysis procesings on polyphenols content in hydrolysates was
monitored. Waste substrates were also tested as potentional complex nitrogen source for PHA
production. Hydrolysates of cheese whey and chicken feather were used as inexpensive
complex nitrogen source for PHA production by C. necator, when waste frying oil was used
as a carbon substrate.
The finnal part of the thesis is dealing with possibilities how the PHA can be processed into
atractive aplication forms. Liposomes with partial content of PHB had been prepared,
moreover, for improving of antioxidant activity and antimicrobial effect the waste coffee oil
was added. Micro-fibrous PHB materials were prepared for the purposes of water filtration.
Higher filtration effectivity was observed when composite PHB fibrous material containing
active charcoal or metal oxides was used. Important part of thesis is represented by study of
degradation processes of prepared PHA-based aplication forms. Various microorganisms
were tested on PHA depolymerases production. Biodegradability of PHA materials was tested
in of composting conditions by standard composting test IS/ISO 20200. Changes in
mechanical properties of polyurethan, where polyol was partialy replaced by PHB, were
tested depending on the exposure of composting condition.

Key words: Biopolymers, waste substrates, polyhydroxyalkanoates, pullulan, polymalic acid,
degradation

4
BENEŠOVÁ, P. Bioprodukce, charakterizace a aplikace vybraných biopolymerů. Brno:
Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2017. 147 s. Vedoucí dizertační práce
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc..

PROHLÁŠENÍ: Prohlašuji, že jsem dizertační práci vypracovala samostatně a že všechny
použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Dizertační práce je z hlediska obsahu
majetkem fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se
souhlasem školitele dizertační práce a děkana FCH VUT.

……………………………..podpis studentky

PODĚKOVÁNÍ:
Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí mé dizertační práce prof. RNDr. Ivaně
Márové, CSc. za všestrannou pomoc a podporu během celé doby studia. Dále pak mé velké
díky patří doc. Ing. Stanislavu Obručovi Ph.D. za veškerou pomoc a ochotu, ráda bych také
poděkovala kolegům a spolužákům se kterými jsme sdíleli nejen laboratoře a kancelář.
V neposlední řadě patří velké díky mé rodině, která mi byla vždy oporou.

5
OBSAH
ÚVOD ................................................................................................................................................................ 9
1 TEORETICKÁ ČÁST ........................................................................................................................... 10
BIOPOLYMERY ..................................................................................................................................... 10
1.1.1 Rozdělení biopolymerů ............................................................................................................... 10
1.1.2 Mikrobiální produkce biopolymerů ............................................................................................ 14
VYBRANÉ VLASTNOSTI BIOPOLYMERŮ ................................................................................................. 16
1.2.1 Biodegradabilita ........................................................................................................................ 16
1.2.2 Biokompatibilita ........................................................................................................................ 18
PULLULAN ........................................................................................................................................... 19
1.3.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti .................................................................................................... 19
1.3.2 Produkce ................................................................................................................................... 20
1.3.3 Degradace pullulanu ................................................................................................................. 22
1.3.4 Aplikace ..................................................................................................................................... 22
POLYMER KYSELINY JABLEČNÉ ............................................................................................................ 24
1.4.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti .................................................................................................... 24
1.4.2 Produkce ................................................................................................................................... 25
1.4.3 Degradace polymeru kyseliny jablečné ...................................................................................... 26
1.4.4 Aplikace ..................................................................................................................................... 26
POLYHYDROXYALKANOÁTY ................................................................................................................ 27
1.5.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti .................................................................................................... 27
1.5.2 Produkce PHA ........................................................................................................................... 29
1.5.3 Biodegradace PHA .................................................................................................................... 46
1.5.4 Izolace PHA ............................................................................................................................... 47
1.5.5 Aplikace PHA ............................................................................................................................ 49
2 CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE ............................................................................................................... 53
3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................................................. 54
POUŽITÉ PŘÍSTROJE A CHEMIKÁLIE ....................................................................................................... 54
3.1.1 Použité chemikálie ..................................................................................................................... 54
3.1.2 Použité přístroje ........................................................................................................................ 55
POUŽITÉ MIKROORGANISMY................................................................................................................. 56
METODY POUŽITÉ KE STANOVENÍ SKUPINOVÝCH PARAMETRŮ .............................................................. 57

6
3.3.1 Metody předúpravy substrátů ..................................................................................................... 57
3.3.2 Celkové polyfenoly ..................................................................................................................... 58
3.3.3 Flavonoidy ................................................................................................................................. 58
3.3.4 Celkové sacharidy dle Duboise .................................................................................................. 59
3.3.5 Redukující sacharidy .................................................................................................................. 59
3.3.6 Celkové proteiny ........................................................................................................................ 59
ANALÝZA JEDNOTLIVÝCH LÁTEK ......................................................................................................... 60
3.4.1 Stanovení mono- a oligosacharidů metodou HPLC .................................................................... 60
3.4.2 Stanovení profilu aminokyselin .................................................................................................. 60
3.4.3 Stanovení profilu mastných kyselin............................................................................................. 60
KULTIVACE MIKROORGANISMŮ ............................................................................................................ 60
3.5.1 Mikroorganismy produkující EPS, PMLA .................................................................................. 60
3.5.2 PHA produkující mikroorganismy .............................................................................................. 61
METODY ANALÝZY MIKROBIÁLNÍCH PRODUKTŮ ................................................................................... 63
3.6.1 Analýza extracelulárních polymerů ............................................................................................ 63
3.6.2 Analýza polyhydroxyalkanoátů .................................................................................................. 64
PŘÍPRAVA A CHARAKTERIZACE ČÁSTIC ................................................................................................ 65
3.7.1 Příprava lipozomů (s PHB) ........................................................................................................ 65
3.7.2 Příprava PHB částic .................................................................................................................. 65
3.7.3 Charakterizace částic z hlediska stability a velikosti .................................................................. 65
3.7.4 Stanovení antioxidační aktivity ................................................................................................... 65
3.7.5 Stanovení amntimikrobiální aktivity ........................................................................................... 65
PŘÍPRAVA PHB FILTRAČNÍCH MATERIÁLŮ............................................................................................ 66
3.8.1 Filtrační PHB vlákna ................................................................................................................. 66
3.8.2 Stanovení filtrační účinnosti ....................................................................................................... 66
STUDIUM DEGRADAČNÍCH PROCESŮ PHA............................................................................................. 66
3.9.1 Příprava PHB materiálů za účelem testování degradace ............................................................ 66
3.9.2 Testování depolymerázové aktivity ............................................................................................. 67
3.9.3 Stanovení molekulové hmotnosti ................................................................................................ 67
3.9.4 Standardní kompostovací test ..................................................................................................... 67
4 VÝSLEDKY A DISKUZE ..................................................................................................................... 68
CHARAKTERIZACE SUBSTRÁTŮ POUŽITÝCH PRO PRODUKCI BIOPOLYMERŮ ............................................ 68
4.1.1 Substráty pro produkci PMLA a pullulanu ................................................................................. 68

7
4.1.2 Kávová sedlina, jako substrát pro produkci PHA ....................................................................... 69
4.1.3 Olej z kávové sedliny, jako substrát pro produkci PHA .............................................................. 74
4.1.4 Syrovátka jako substrát pro produkci PHA, pullulanu a PMLA .................................................. 75
4.1.5 Peří jako komplexní zdroj dusíku pro produkci PHA .................................................................. 76
PRODUKCE PULLULANU A POLYMERU KYSELINY JABLEČNÉ .................................................................. 77
4.2.1 Testování substrátů pro kultivaci A. pullulans ............................................................................ 77
4.2.2 Produkce pullulanu a PMLA v laboratorním fermentoru ............................................................ 82
4.2.3 Vliv osmotického stresu na produkci pullulanu........................................................................... 85
PRODUKCE POLYHYDROXYALKANOATŮ ............................................................................................... 87
4.3.1 Produkce PHA s využitím kávového odpadu ............................................................................... 87
4.3.2 Produkce PHA s využitím syrovátky jako zdroje dusíku .............................................................. 95
4.3.3 Produkce PHA s využitím hydrolyzátu peří jako zdroje dusíku ................................................... 98
APLIKACE PHA ................................................................................................................................. 102
4.4.1 Vliv kávového oleje na antioxidační a antimikrobiální účinek částic ........................................ 102
4.4.2 Příprava a využití PHB mikro- a nanovláken jako filtračního materiálu................................... 107
4.4.3 Studium degradace PHA .......................................................................................................... 112
4.4.4 Studium degradace modifikovaných polyuretanů s využitím PHB jako parciální náhrady
polyetherového poyolu ........................................................................................................................... 117
5 ZÁVĚR ................................................................................................................................................. 120
6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ................................................................................................. 124
7 REFERENCE ...................................................................................................................................... 125
8 ŽIVOTOPIS ......................................................................................................................................... 144
9 SEZNAM PUBLIKAČNÍ ČINOSTI ................................................................................................... 145

8