Table Of ContentFORSCHUNGSBERICHTE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN
Herausgegeben
im Auftrage des Ministerpräsidenten Dr. Franz Meyers
von Staatssekretär Professor Dr. h. c. Dr. E. h. Leo Brandt
Nr.1029
Dr. Hans Füsser
cand. rer. not. Egon Flach
Prof. Dr. Hermann Fink
Institut für Gärungswissensdtaft und Enzymchemie der Universität Köln
Versuche zur gleichzeitigen Gewinnung von
Hefeeiweiß und Antibiotika
Als Manuskript gedruckt
WESTDEUTSCHER VERLAG I KOLN UND OPLADEN
1962
ISBN 978-3-663-03888-7 ISBN 978-3-663-05077-3 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-663-05077-3
G 1 i e der u n g
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Einleitung s. 5
s.
2. Hauptteil 7
a) Vorversuche • s. 7
b) Hefezüchtungen im Belüftet-Bottichverfahren
zur gleichzeitigen Gewinnung von Hefeeiweiß
und Kulturfiltrat •••••••••• s. 15
c) Versuche zur Gewinnung von Mutanten • s. 34
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Zusammenfassung s.
4. Literaturverzeichnis s.
Sei te 3
1. Einleitung
Ein groBer Teil der Bakterien, der Aktinomyceten und der Schimmelpilze
sind im Laufe der Zeit auf Bildung von antibiotisch wirksamen Stoffen
untersucht worden. Über Substanzen mit antibiotischem Charakter bei He
fen ist im allgemeinen wenig bekannt.
LEDERMANN und KLOPSTOCK konnten 1903 beobachten, daß Typhusbazillen,
Staphylokokken und Colibakterien durch gärende Preßhefen und andere
Hefen abgetötet wurden. FERNBACH und Mitarbeiter haben 1909 aus Hefen
einen Stoff gewonnen, der gegen andere Hefen und Bakterien aktiv war.
Bakteriolytische Wirkung von Hefen auf Typhus-, Paratyphus- und Desente
rie-Bazillen beschrieb 1924 SCHILLER. Die Hefen wurden zu erzwungenen
Antagonisten der Bakterien, die als einzige Stickstoffquelle die stick
stoffhaItigen Substanzen der Bakterien benutzten. Auch Tuberkelbazillen
wurden nach SCHILLER angegriffen. Die bakteriolytische Substanz soll
von den Hefen ausgeschieden werden und auch außerhalb der Zelle wirksam
sein. P.L. CARBONIERI (1926) berichtete über die Wirkung von Saccharomy
ces bulgaricus, die darin bestand, daß der Keimgehalt der Zelle redu
ziert wurde, nachdem die Hefe per os verabreicht worden war. Nach
OKUMUKI (1931) bildet Torula suganii eine gegen Pilze wirksame Substanz,
die sich nur in der Zelle findet und sich in Aceton, Alkohol, Äther und
Chloroform löst. SPARAPANI (1931) konnte beobachten, daß in Filtraten
von Saccharomyces Sardus Colibakterien, Typhus- und Paratyphusbazillen,
Streptococcus mastidis nach 96 bis 135 Stunden bei 37°C aufgelöst wur
den und anschließend nicht mehr zur Entwicklung kamen. BARGLOWSKI be
richtete 1938, daß filtrierte Kulturflüssigkeiten von Saccharomyces
cerevisiae und Mycotorula albicans, die den Nährböden zugefügt wurden,
das Wachstum von Tuberkelbazillen hemmten. COOK, GREKE, GIERSCH und
SCHROEDER (1941) sprechen von wachstumshemmender Substanz aus Hefen auf
die Pilze Aspergillus niger und Penicillium glabrum. Diese Substanz
wurde durch fraktionierte Fällung eines konzentrierten Alkohol-Hefe
Extraktes gewonnen. TAKAHASHI (1942) konnte aus autoklavierter Bäcker
und Bierhefe nach Extraktion mit Alkohol, Safranin und neutralem Blei
acetat einen Inaktivator für Tabakmosaikviren gewinnen. Nach CARPENTER
(1945) hemmt Torulopsis utilis var. thermophila und Torulopsis utilis
var. major das Wachstum von Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
und Escherichia coli auf festen Nährböden in vitro. Richard KOCH und
Mitarbeiter berichteten 1952 über antibiotische Wirkungen von Hefen auf
Bakterien.
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In neuerer Zeit liegen u.a. Arbeiten von PARVENTJEV (1954) über anti
biotisch wirksame Substanzen aus Bäckerhefen vor, die in einigen Fällen
aktiv gegen gramnegative Bakterien sind. Nach NAY (1954) sollen auch
Bierhefen antibiotisch wirksame Stoffe produzieren, die die Hefen gegen
bestimmte Mikroorganismen-Infektionen schützen.
Aus der Praxis ist weiter bekannt, daß gärende Hefen wie Bier-, Bäcker
hefen und Weinhefen einen großen Teil der gelegentlich vorkommenden
Mikroorganismen durch ihre Stoffwechseltätigkeit unterdrücken oder in
ihrem Wachstum hemmen können. Alkohol- und Kohlensäurebildung, veränder
te pH-Werte, Verschiebung des Redox-Potentials, Wuchs- und Nährstoff
entzug können die Hemmung mit beeinflussen. Bei der Züchtung der Wuchs
hefe Torula utilis (nach LODDER Torulopsis utilis) im Belüftet-Bottich
verfahren haben FINK und Mitarbeiter 1935 erstmals beobachtet, daß in
der Dauerzüchtung über viele Passagen keinerlei Infektionen festzustel
len waren, wobei allerdings nur Ammoniak-Stickstoff als einzige Stick
stoffquelle und Holzzuckerlösungen bzw. ·Sulfitablaugen als Kohlenstoff
quelle verwendet wurden.
Die anfängliche Erklärung, daß die Ursache dieses Phänomens in gewissen
Hemmstoffen des Holzzuckers bzw. der Sulfitablaugen zu suchen sei, an
die sich die verwendete Torula-Hefe anpasse, dagegen aber die Infektions
flora nicht, wurde später fallen gelassen. 1944 konnten FINK und Mitar
beiter beobachten, daß bei der aeroben Züchtung von Torula-Hefen in
reinen Zuckerlösungen Stoffe mit hemmender Wirkung in der Züchtungs
flüssigkeit nachgewiesen wurden.
Arbeiten über die Verwendung von Kulturfiltraten aus der Torulazüchtung
- als Parallele zur Penicillingewinnung - sind sonst nicht bekannt. Aus
der Literatur geht lediglich hervor, daß die Autoren entweder die Hefen
selbst oder Hefeextrakte auf antibiotisch wirksame Substanzen unter
sucht haben.
Es erschien daher interessant, in Fortführung und Erweiterung der oben
genannten Beobachtungen die bei der mikrobiellen Eiweißsynthese viel
fach verwandte Wuchshefe Torulopsis utilis auf ihre Fähigkeit, anti
biotische Stoffe zu bilden, zu untersuchen.
Diese Hefe wird technisch im Belüftungsverfahren vermehrt, so daß bei
Bildung wirksamer Stoffe es leicht möglich wäre, gleichzeitig Hefeeiweiß
und aus dem Substrat diese wirksame Substanz zu gewinnen.
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2. Hauptteil
a) Vorversuche
In orientierenden Versuchsreihen wurden zunächst Hefen vom Typ Torulop
sis utilis verschiedener Herkunft untersucht. Später wurden weitere
Hefen geprüft und getestet. Die Testungen wurden auf einem von uns ent
wickelten Standard-Nährboden, der folgende Zusammensetzung hatte, durch
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geführt: Ein Prozent Glukose, 0,1 K2HP04, 2 Agar und Hefewasser.
In den späteren Versuchsreihen wurde der Nährboden durch Zugabe von
1 % Standard I von Merck weiter ergänzt.
Die Testungen erfolgten in Form von Hefestrichtesten gegen Bakterien,
und zwar in ähnlicher Weise wie in den Versuchen von A.M. SKORODUMOWA
mit Saccharomyces cerevisiae - Arten beschrieben. Die Methode ähnelt
im Prinzip der Oxford-Zylindertest-Methode, wonach je 1 ccm einer 24
Stunden alten Bakterienkultur in ca. 0,5 %igen Glukose-Agar obiger Zu
sammensetzung eingeimpft wird. Diese Platten wurden ca. 2 Stunden bei
Zimmertemperatur zum Erstarren aufgestellt und anschließend Hefestrich
kulturen angelegt. Bei den Hefen handelte es sich stets um junge 24 bis
48 Stunden alte Kulturen. Als Testorganismen dienten außer
Staphylococcus aureus L 2 aV "Bram" Berlin-Lichterfelde und
Mycobakterium phlei Syn. Mycobakterium moel·leri vor allem
Sarcina lutea 2 BA und Staphylococcus roseus.
Folgende Hefen wurden in den ersten Versuchsreihen getestet:
Torula pseudomycel A
Torula utilis S
Torula utilis 1 W
Torula utilis 2 W
Torula utilis K (mit kleinen runden Zellen von unterschiedlicher Größe)
Torula utilis A
Torula utilis B Stamm 8
Von den sieben Stämmen Torulopsis utilis zeigten nur sechs mehr oder
weniger starke Hemmwirkung. Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 1
wiedergegeben. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die Hefen (Hefe
strich = 1 mm) Hemmzonen im Verhältnis 1 1,1 bis 1 : 5,5 gebildet
haben. Einige von diesen Hefen wurden in späteren Versuchen zum Teil
unter Mitarbeit von E. FLACH gezüchtet und weiter untersucht.
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Tab e 1 1 e 1
Das Verhältnis der Hefen zu den Hemmzonen in mm nach 48 stunden
Nr. H e f e n Staphylococcus Sarcina lutea
roseus
183 Torula pseudomycel 8 I 9 ( 1 I 1 , 1 ) 1 : 15 ( 1 ·· 2,1 )
184 Torula utilis S. 8 : 16 ( 1 : 2 ) 4 : 22 (1 ·· 5,5)
..
161 Torula utilis 1W 8 9 ( 1 : 1 , 1 )
..
162 Torula utilis 2W 10 : 12 (1 1 ,2)
163 Torula utilis K 5 : 15 (1 : 3 ) 4 : 22 (1 ·· 5,5)
186 Torula utilis A 1 : 8 ( 1 : 1 ,1)
---
188 Torula utilis B
Andere Torula-Hefen wurden im Plattenstrichtest gegen Sarcina lutea und
Staphylococcus roseus geprüft. Die untersuchten Hefen zeigten keine
Hemmwirkung und wurden daher nicht weiter verwertet. Es handelte sich
u.a. um folgende Hefen: Torula casei 2, Torula M.N. (Nürnberg), Torula F.
(FLEISCHMANN), Torulopsis kefir, Torulopsis pulcherrima (Geisenheim),
Rosa Torula (Kiel), Candida spec. (Kiel), Candida tropicalis (Geisen
heim), Candida lipolytica Nr. 8662 (Prof. ROSELL), Candida pseudotropi
calis Nr. 2512 (Prof. ROSELL), Torula nigra (Aschaffenburg), Torula
utilis var. coll., Torula pulcherrima (Aschaffenburg) und Torulopsis
utilis var. thermophila Nr. 9255.
Zu den Strichtesten wurden nicht nur Torula-Hefen, sondern auch andere
Hefearten herangezogen. Bei diesen Versuchen konnte beobachtet werden,
daß außer Torulopsis utilis auch andere Hefen hemmende Wirkung besonders
gegen Sarcina lutea aufweisen. Auch hier konnten zum Teil Hemmzonen im
Verhältnis von 1 : 2 bis 1 : 5 gemessen werden. Es wurden folgende Hefen
getestet:
Brettanomyces spec. (Leverkusen)
Saccharomyces fragilis Typ E 8635 (Prof. ROSELL)
Saccharomyces lactis (Kiel)
Willia anomala IV (Geisenheim)
Saccharomycodes spec. (Geisenheim)
Saccharomycodes Ludwigii (Geisenheim)
Schizosaccharomyces pombe Lindner (Aschaffenburg)
Sporobolomyces holsaticus (WINDISCH)
Saccharomyces Logos (van LAER et DENAMUR) und Nadsonia elongata.
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Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Daraus geht
hervor, daß von den 10 untersuchten Hefen nur zwei Hefen keine Hemm
wirkung zeigten.
Ein Teil dieser Hefen, so u.a. Brettanomyces spec., Saccharomycodes und
Schizosaccharomyces, wurde später im Rahmen einer weiteren Arbeit im
Belüftet-Bottich-Verfahren gezüchtet und die Kulturfiltrate getestet.
Tab eIl e 2
Das Verhältnis der Hefen zu den Hemmzonen in mm nach 24 Stunden
H e f e n Sarcina lutea
Brettanomyces spec. 4 ·· 17 ( 1 ·· 4,25)
Saccharomyces fragilis --
Saccharomyces lactis --
·
Willia anomala 4 · 8 ( 1 : 2 )
Saccharomycodes spec. 4 ·· 20 ( 1 ·· 5 )
Saccharomycodes Ludwigii 4 ·· 16 ( 1 ·· 4 )
Schizosaccharomyces pombe 4 ·· 17 ( 1 ·· 4,25)
Sporobolomyces holsaticus 4 ·· 6 ( 1 ·· 1 ,5 )
Saccharomyces Logos 3 ·· 7 ( 1 ·· 2,33)
Nadsonia elongata 5 : 10 ( 1 ·· 2 )
In den Abbildungen 1 bis 6 wurden die Hemmzonen einzelner Hefen gegen
verschiedene Bakterien festgehalten. Die deutliche Hemmwirkung von
Torula utilis K (163) gegen Sarcina lutea, Staphylococcus aureus
(1 : 3 mm) und Myco~akterium phlei (1 : 2 mm) ist zu erkennen. Dagegen
treten die z.T. geringen Hemmzonen der anderen Torula-Hefen nicht sehr
deutlich hervor. Auch die bei Torula utilis Stamm 161 gemessenen Hemm
höfe gegen Sarcina lutea und Staphylococcus roseus sind nur schwach
sichtbar. Aus den Abbildungen 2 und 3 geht weiter hervor, daß die Toru
la-Hefe Stamm 163 erst nach 48stündigem Wachstum sehr starke Hemmwir
kung gegen Staphylococcus aureus erkennen ließ. Ähnlich liegen die
Verhältnisse beim Test gegen Mycobakterium phlei (Abb. 4). Im Gegensatz
zu den vorhergehenden Testen ist auch hier bei der Torula-Hefe Stamm
161 eine deutlichere Hemmung gegen Mykobakterium phlei zu verzeichnen.
Die beiden Stämme Torula utilis 161 und Torula utilis 163 wurden für
die späteren Züchtungen ausgewählt.
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Hemmzonen-Bildung bei Sarcina lutea
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Hemmzonenbildung bei Sarcina lutea
1 Schizosaccharomyces pombe 3 Saccharomycodes Ludwigii
2 Saccharomycodes spec. 4 Saccharomyces logos.
Auch bei den Hefen der Tabelle 2 konnten Hemmwirkungen besonders gegen
Sarcina lutea festgestellt werden. Die Abbildung 5 enthält einen
Brettanomyces-Stamm, und in der Abbildung 6 sind die Hefen Saccharomy
codes spec., Saccharomycodes Ludwigii sowie Schizosaccharomyces pombe und
Saccharomyces logos wiedergegeben. Diese Hefen wurden aber im Rahmen
dieser Arbeit nicht weiter untersucht.
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