Table Of ContentFORSCHUNGSBERICHTE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN
Nr. 2H47 /Fachgruppe Physik/Chemie/Biologie
Herausgegeben vom Minister für Wissenschaft und Forschung
Prof. Dr. Klaus Otto
Institut für Physiologische Chemie
der Universität Bonn
Untersuchung der Inaktivierung von Enzymen
sowie des Ribonuclease-Inhibitors
durch die Kathepsine B und D und die
lysosomale Carboxypeptidase B
Springer Fachmedien Wiesbaden GmbH 1979
CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Otto, Klaus:
Untersuchung der Inaktivierung von Enzymen so
wie des Ribonuclease-Inhibitors durch die
Kathepsine B und D und die lysosomale Carboxy
peptidase B / Klaus Otto. - Opladen : West
deutscher Verlag, 1979.
(Forschungsberichte des Landes Nordrhein
Westfalen ; Nr. 2847 : Fachgruppe Physik,
Chemie, Biologie)
ISBN 978-3-531-02847-7
0 1 979 by Springer Fachmedien Wiesbaden
Ursprünglich erschienen bei Westdeutscher Verlag GmbH, Opladen 1979
Gesamtherstellung: Westdeutscher Verlag
ISBN 978-3-531-02847-7 ISBN 978-3-663-19792-8 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-663-19792-8
Inhalt
Verwendete Abkürzungen 2
2 Einflihrung 3
3 Methodik '+
Allgemeines 4
2 Die Kathepsine 5
3 Die Substrat-Enzyme 6
Lt Ergebnisse 8
Serin-Dehydratase 8
? Lactat-Dehydrogenase 12
:X. Halat-Dehydrogenase 1 ;l
/
4 Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 11~
5 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase 18
6 Glucose-6-Phosphatase 18
7 Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 19
8 Ornithin-Decarboxylase 20
9 Ribonuclease-Inhibitor 20
5 Diskussion 23
6 Danksagung 24
7 Literatur 25
2
Verwendete AbkJrzungen
1
BAA nenzoyl-L-argininamid
BAPA Benzoyl-D,L-arginin-p-nitroanilid
DTE Dithioerythritol
EDTA Athylendiamin-tetraacetat
G-6-Pase= Glucose-6-Phosphatase
G-6-PDH Glucose-6-phosnhat-Dehydrogenase
HE PES N-?-Hydroxyäthylpiperazin-N-2-iithansulfonsiiure
LDH Lactat-Dehydrogenase
LysCPB Lysosomale Carboxypeptidase B
Malat-Dehydrogenase
~mH
~1orphol ino äthansulfons äure
NAD(H ox.bzw.red. Nicotinamid-adenin-dinucleotid
2 )
NADP(H )= ox.bzw.red. Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
2
ORD Ornithin-Decarboxylase
PEPCK Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
6-PGHD 6-Phosnhogluconat-Dehydrogenase
P-'5'-P Pyridoxal-5'-phosphat
RNA Ribonucleinsäure
RN Ase Ribonuclease
RSA Rinderserum-Albumin
SDH Serin-Dehydratase
Tris Tris-hydroxyrnethyl-aminomethan
3
Untersuchunp: der Inaktivierunr; von Enzymen sowie des Ribonu
clease-Inhibitors durch die Kathepsine B und D und die lyso
somale Carboxypeptidase B
:' F.inLihrunn:
1.·J'ihrend im Verlaufe der biochemischen Forschung der letzten
Jahrzehnte im all;':emeinen zun1ichst die katabolen Stoff\'lechsel
we.r;e und erst hiernach die entsprechenden anabolen Reaktionen
aufgeklfirt wurden, gilt diese Regel erstaunlicherweise nicht
für den intrazellulä.ren Protein-StoffwechseL ITier wurde zu
erst die anabole Richtung, die so komplexe Protein-Biosynthe
se, in den verp;angenen zwei Jahrzehnten mit viel Scharfsinn
und großem Aufwand erforscht und - wenn auch noch nicht bis
in die letzten Einzelheiten - verhältnismäßig weitgehend auf
geklärt. Der entsprechende katabole Prozeß, der so einfach
scheinende intrazelluläre Protein-Abbau, ist dagegen viel we
nir;er gut bekannt, obwohl es sich auch dabei um qualitativ
1-rie quantitativ bedeutsame Vorgänge handelt; umfaßt doch der
Protein-turno~rer des Or17,anismus pt'o Tag mehrere 100 e;, also
weit mehr als der Protein-Umsatz im Verdauunc;strakt. Außerdem
ist eine intrazellul1ire Protein-Biosynthese ohne ents:'rec'Hm.
·'t 1nrvoranr;er;anr,:enen lAbbau gar nicht möglich. Schließlich ist
dieser nnbefriedir;ende Kenntnisstand auch erstaunlich im Hin
blick auf die schon lange vorhandenen Kenntnisse über die
proteolytischen Vorgfinp;e im Verdauungstrakt, wobei die hier
beteilin;ten Enzyme zu den am Hingsten bekannten und bestunter
suchten überhaupt zHhlen. Die entsprechenden - aber anderen -
Enzyme des intrazelluli:iren Protein-Stoff\,rechsels haben dar;err,en
lanp;e Zeit ein Schattendasein r:;efi.ihrt, obi·lohl auch hierzu
schon kurz nach der Jahrhundertwende die ersten Arbeiten er
schienen sind und sich insbesondere Vlillstätter in den zwanzi
p,er und dreißir;er Jahren mit diesem Problem beschäftigt hat.
Tatsächlich aber war der Kenntnisstand bis vor kurzem
noch sehr unbefriedigend und auch das Interesse an diesem Ge
biet sehr gering. Es darf freilich nicht vergessen werden,
daß die methodischen Schwierigkeiten in früheren Jahren be
tr8chtlich waren und auch heute noch nicht beseitigt sind. Ins
besondere die Isolierung der am intrazellulären Protein-Abhau
beteiligten Enzyme ist schwierig oder zumindest zeitraubend,
ganz zu schweigen von der Aufklärung der regulatorischen Phä-
4
nomene, die hier beteiligt sein müssen. Tatsächlich sind es
"ielleicht gerade diese Regulationsvorgänge und hier wiederum
die Erkenntnis, daß auch viele Prozesse außerhalb des eigent
lichen Protein-turnevers 1mter Beteiligung von Proteasen ( "li
mited proteolysis" - begrenzte Proteolyse, z.B.von Pro-Hormo
nen) ablaufen, die in der jüngsten Zeit starke Impulse zur
nunmehr energischen Bearbeitung dieses Gebietes gegeben haben.
Im folgenden soll von einem Teilaspekt des Protein-Abbaues
die Rede sein, von der Inaktivierung von Enzymen unter der
Wirkung intrazellulärer Proteasen, der Kathepsine, da einer
seits der Aktivitätsverlust durch proteelytischen Abbau in
vielen Einzelfällen qualitativ schon lange bekannt ist, und
andererseits die Methodik der quantitativen in vitro-Untersu
chung relativ einfach erscheint. Der Schwerpunkt lag hier bei
der Untersuchung der \'lirkung der lysosomalen Kathepsine B und
D. (Grundsätzliches über intrazelluläre Proteasen und Pepti
dasen siehe bei Barrett (1).)
3 Methodik
3. ' Allgemeines
GrundsPtzlich wurde bei den Inaktivierungaverauchen so vor
gegangen, daß das zu inaktivierende Enzym, das "Substrat-En
zym'', mit dem Kathepsin zusammen inkubiert und der Aktivitäts
abfall im Verlaufe einiger Minuten oder Stunden mittels Fro
henentnahme in einem geeigneten Enzymtest gemessen wurde.
(Die erste Hälfte dieses Versuchsansatzes wird im nachfolgen
den als "Inaktivieransatz1' oder "Prae-Inkubation" bezeichnet
werden.) Der Prae-Inkubationsansatz hat eine Zusammensetzung,
die abhängig ist vom Substrat-Enzym und vom jeweiligen Kathep
sin; im allgemeinen besteht er aus folgenden Komponenten:
Puffer, Kathepsin, Kathepsin~Aktivatoren, Schutzprotein. Der
Start der Reaktion erfolgt durch Zugabe des Substrat-Enzyms,
die Beendigung durch entweder pH-Änderung, Eiskühlung oder
Zusatz von Kathepsin-Inhibitoren. Die Menge an Substrat-Enzym
wurde nach Möglichkeit so gewählt, daß der anschließende En
zymtest mit 10-100 ~1 der Prae-Inkubation ohne Zwischenver- .
dünnung durchgeführt werden konnte. Für jedes Substrat~Enzym
(und auch für jedes Kathepsin bzw. jede Kathepsin-Präparation)
mußte die optimale Zusammensetzung des Systems in Vorversu
chen ausprobiert werden.
i•l1~.hrend man bei "normalen" Enzymreaktionen meist bestrebt ist,
5
das Substrat im Überschuß zu haben, muß im Inaktivieransatz
das zu inaktivierende Substrat-Enzym (nicht das Kathepsin)
eher im Unterschuß sein, damit man innerhalb kurzer Zeiträume
zu einer deutlich messbaren Substrat-Verarmung - mindestens
10'G Aktivitätsverlust - kommt. Gleichzeitig wird ein Kontroll
versuch ohne Kathepsin angesetzt, der den natürlichen Aktivi
tätsverlust - je nach pH-Wert u.U.nicht unbeträchtlich - er
faßt.
Im Idealfall verläuft eine derartige Inaktivierung nach den
Gesetzen einer Reaktion I.Ordnung, nimmt also einen exponen
tiellen Verlauf und nähert sich asymptotisch dem Wert null.
In vielen Fällen wird aber die Aktivität null nicht erreicht,
es verbleibt auch nach längerer Prae-Inkubation eine Rest
Aktivität. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, einen mitt
leren Inaktivierungsgrad anzustreben, da dann die Fehler am
geringsten sind. Zur weiteren Berechnung kann man den expo
nentiellen Verlauf durch Logarithmieren in eine Gerade um
wandeln und in einer graphischen Darstellung entweder die
Größe lg a/a-x (a=Anfangsaktivität; (a-x)=noch vorhandene Ak
tivität) oder direkt den Logarithmus der jeweils noch vorhan
denen Aktivität (in%) benutzen. Man erhält dann entweder eine
ansteigende oder abfallende Gerade. :Für eine erste litersieht
und auch dann, wenn der Verlauf nicht exakt exponentiell ist,
~Arird man sich mit der Angabe der prozentualen Aktiviti:itsnnde
rung begnügen.
Die Auswahl der verwendeten Substrat-Enzyme richtete sich
nach folgenden Kriterien:
a. Leichte Isolierung bzw. Reinigung des Enzyms oder Beschaf
fung durch Kauf.
b. Leichte Testbarkeit des Enzyms, da u.U. in kürzester Zeit
eine größere Zahl von Enzymtesten durchzufjhren war.
c. Stellung des Enzyms innerhalb eines Stoffwechseh;eges
( mör;l ichst ., Schlüsselenzym").
d. Die verwendeten Enzyme sollten - soweit bekannt - unter
schiedliche Halb>·rertszeiten aufweisen, um e'rtl. eine Korrela
tion zwischen diesen Zeitwerten und der Schnelligkeit der
hier zu messenden Inaktivierunro; herstellen zu können.
::;.? Kathepsine
Kathepsin B und die lysosomale Carboxypeptidase B (lys CPB)
wurden aus Rindermilz nach Otto und Riesenkönig (?) isoliert.
6
Kathe~sin D wurde bei der lys CPB-Gewinnung aus einer entspr.
Fraktion durch Chromatographie an ·DEAE-Sepharose weitergerei
nigt.
Die verwendeten Kathe~sin-Präparate hatten die folgenden Akti
vitäten:
Kathepsin B: 2-6 nanokatal/mg Protein, m1t BAPA als Substrat(2)
Kathepsin D: Ca.20-50 Einheiten/mg Protein (siehe(1))
Lys CPB: Ca.50-15·0 nanokatal/mg Protein, mit BAA als Substr.(2)
In einigen Versuchen wurde auch das "Glucose-6-phosphat-inak
tivierende Enzym" von Katunuma (3) benutzt. Die Reinigung er
.fol!:r,te in Anlehnung an Otto u. Riesenkönig (2) bzw. Katunuma
( 3) und ist von Fuhge ( '') beschrieben worden.
Der Proteingehalt der Kathepsin-Präparationen wurde entweder
nach Lowry et al.(')) oder nach Warburg u. Christian (6) er
mittelt.
3.3 Substrat-Enzyme
Serin-Dehydratase (EC 4.2.1.13): Als Enzympräparation diente
eine aus Rattenleber-HomogenatJberstand nach Pitot et a1.(7)
bei 20-50% Ammoniumsulfat-Sättigung gewonnene Proteinfraktion.
Die Aktivität dieses Präparates betrug 1,7 Einh.pro ml, der
Proteingehalt 5,9mg/ml. Die Aktivitätsbestimmungen erfolgten
nach Holzer et al.(8) im gekoppelten optischen Test nach War
burg (C~) mit LDH und NADH2 • Der Test \'rurde bei 28° in einer
Küvette YOn 10mm Schichtdicke durchgeführt, die Extinktions
änderun~ (bei 366nm) wurde mit Hilfe eines Schreibers aufge
zeichnet, wobei der Papiervorschub 1cm/Min betrug, mithin die
Steigung direkt die Extinktionsänderung pro Min ergibt.
Lactat-Dehydrogenase (EC 1.11.1.27): Die verwendeten Enzyme
(aus Kaninchenherz und Kaninchenmuskel) waren Präparate der
Firma Boehringer/fl[annheim. Die Aktiyitätsbestimmung erfolgte
im optischen Test nach vJarburg (9), im Prinzip wie oben bei
der SDH beschrieben.
Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37): Die Enzyme (mitochondriale
wie auch cytoplasmatische MDH aus Schweineherz) waren Produk
te der Firma Sigma (St.Louis,USA). Die Aktivitätsbestimmungen
erfolßten mit Oxalacetat und NADH als Substrat im optischen
2
Test unter Bedingungen gemäß Berr.;meyer u.Bernt (10).
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1. 1.1.119): Als Enzymprä
parat diente das Hefeenzym der Firma Boehringer/Mannheim; die
7
Bestimmun~ erfol~te im optischen Test nach Warburg unter Be
dingungen gemäß Löhr u.Waller (11).
6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.84): Als Enzympr2-
parat diente wiederum ein Hefeenzym der Firma I3oehrine;er; sei
ne Bestimmung erfole;te nach Angaben von King (12).
Glucose-6-Phosphatase (EC 3.1.3.9): Als Enzympräparation dien
te die Mikrosomen-Fraktion der Rattenleber, die durch entsnr.
Zentrifugation e;ewonnen wurde (13). Der Niederschlae; wurde
in O,;:>SM Saccharose/1mM EDTA suspendiert und bei -20° auf
bel.;ahrt. Bei der Aktivitäts-Bestimmung mit Glucose-6-phosphat
wurde das freigesetzte anorr;anische Phosphat nach Fiske und
Subbarow (1n) bestimmt.
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (EC 11 .• 1.1. 32): Das Enzym -
es ist in der Rattenleber hauptsächlich cytoplasmatischen Ur
sprungs- wurde nach einem von Ballard u.Hanson (15) angep;e
benen Verfahren mittels Ammoniumsulfat-Fällung r;rob angerei
chert; es wurde in 80%iger Ammoniumsulfat-Lösung aufbewahrt,
die je 1mJI1 an DTE und EDTA war. Die Aktivitätsbestimmungen
erfolgten mittels Phosphoenolpyruvat und radioaktivem Eiear
banat ( 11j C), wobei das entstandene 1lJ-C-Oxalacetat durch die
nachgeschaltete MDH-Reaktion mit NADH zu 11+C-!1alat umgesetzt
2
und anschließend im Szintillationszähler gemessen wurde.
Ornithin-Decarboxylase (EC 4.1.1.17): Dieses Enzym wurde nach
einer Kombination der r1ethoden von Jänne et al. ( 16) und Ono
et al.(17) angereichert. Ausgangsmaterial waren ventrale Pro
statae von Ratten, aus denen das Enzym nach Homogenisation
und Ammoniumsulfat-Fällung (20-50% Sättigung) gewonnen wurde.
Die Decarboxylase wurde in ;:>cmr1 Tris, 10ml'1 ß-Mercaptoä.thanol
und 0,1mM P-5'-P bei pH 7,S im Klihlschrank aufbewahrt. Die
Aktivitätsbestimmung geschah mittels radioaktivem 1L J C-L-Orni
thin, das zu Putrescin und radioaktivem 14co umgesetzt und
2
dessen Impulsrate anschließend in einem Szintillationszähler
gemessen wurde.
Der cytoplasmatische Ribonuclease-Inhibitor: Der RNAse-Inhibi
tor wurde nach Shortman (18) sowie Bartholeyns u. Baudhuin(19)
gewonnen. Ausgangsmaterial waren Rattenlebern, aus denen nach
,.
Homogenisation und Gewinnung des 100 OOOxg Oberstandes üer In-
hibitor mittels Chromatographie an DEAE ... Cellulose und Hydroxyl
apatit angereichert wurde. 12,Sng Ribonuclease (Boehringer/
