Table Of ContentFORSCHUNGSBERICIITE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN
Nr. 2523
Herausgegeben im Auftrage des Ministerpräsidenten Heinz Kühn
vom Minister für Wissenschaft und Forschung J ohannes Rau
Dr. Walter Starkebaum
Prof. Dr. Dr. Herbert Witzel
Untersuchung der
enzymatisch-katalysierten Spaltung
von Phosphorsäuretriestern
Springer Fachmedien Wiesbaden GmbH 1975
@ 19 7 5 by Springer Fachmedien Wiesbaden
Ursprünglich erschienen bei Westdeutscher Verlag GmbH, Opladen 1975
Gesamtherstellung: Westdeutscher Verlag
ISBN 978-3-531-02523-0 ISBN 978-3-663-19794-2 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-663-19794-2
Inhalt
1. Einleitung 1
2. Isolierung 2
3. Charakterisierung des Enzyms 5
3.1. Untersuchung zur Reinheit des
isolierten Enzyms 5
3.2. Untersuchung zur Stabilität
des Enzyms 5
3.3. Molekulargewicht und Unter-
einheiten 6
4. Untersuchung von Cofaktoren 6
5. Spezifität des Enzyms 7
6. Kinetische Untersuchungen 8
7. Zusammenfassung und Diskussion 9
Abkürzungsverzeichnis 11
Tabellen 12
Literaturverzeichnis 17
Bildanhang 19
- 1 -
1 • Einleitung
Obwohl Phosphorsäuretriester im Stoffwechsel der Organismen
nicht vorkommen, gibt es eine Reihe von Enzymen, die Verbin
dungen dieser Art, die als Insektizide zur Zeit in großem
Umfang eingesetzt werden, abbauen bzw. hydrolysieren
können.
Diese insektiziden Phosphorsäuretriester müssen mindestens
eine aktivierende Komponente enthalten, die die Elektro
philie im Phosphor erhöht (1). Sie reagieren dann in der
Regel mit den sogenannten Serinhydrolasen, deren Serin-OH
Gruppe im aktiven Zentrum die Phosphatgruppe übernimmt. Die
Hydrolasen werden bei dieser Reaktion irreversibel inakti
viert. Zu diesen Enzymen gehört auch die Acetylcholinester
ase (EC. ;.1.1.7), auf deren Blockierung die insektizide
Wirkung sowie die teilweise sehr hohe Warmblütertoxizität
dieser Phosphorsäuretriester beruht. Diese Toxizität führte
zeitweilig zu Überlegungen solche Verbindungen wie das Sarin,
Soman oder Tabun als Kampfstoffe zu verwenden. Wenn bei den
Triestern eine der Esterbindungen hydrolytisch abgespalten
wird, entsteht ein allgemein nicht toxischer Phosphorsäure
diester, der die Serinhydrolasen nicht mehr angreift.
Enzyme, die diese HYdrolyse der Triester katalysieren, sind
in verschiedenen biologischen Systemen, so z.B. in Säugetier
geweben, Insekten und Mikroorganismen gefunden worden (2-4).
Bisher ist nicht bekannt, ob sie auch in pflanzlichem Mate
rial vorkommen. Die bisher untersuchten Enzyme aus den ver
schiedenen Quellen zeigen eine sehr unterschiedliche Spezi
fität sowie ein differenziertes Verhalten bezüglich ihrer
Cofaktoren.
So stellte Mazur (5) bereits 1946 im Kaninchenserum die durch
ein Protein katalysierte Hydrolyse von Diisopropylfluor
phosphat (DF.P) fest. Das für diese Spaltung verantwortliche
En~~ benötigt, wie später Mounter et al. (6-9) zeigten,
Mn als Cofaktor und wirkt vor allem an Phosphorsäuretri
estern, die als aktivierende Gruppe F, CN oder Dichlorvinyl
enthalten (10-11). Ein ähnliches Enzym wurde aus der ameri
kanische~+Küchenschabe angereichert (12). Es benötigt eben
falls Mn zur vollen Aktivität und spaltet Phosphorsäure
ester mit einer P-F-Bindung. Ein von Hoskin und Long aus
Tintenfi~~hen gewonnenes DF.P-spaltendes Enzym wird dagegen
durch Mn völlig !~biert (1;).
Ebenfalls durch Mn inhibiert werden Enzyme, die aus Kanin
chenserum zuerst vo~ Augusti~~son und Heimbürger angerei
chert wurden und Sr + und Ba als Cofaktoren benötigen
(14-17). Sie spalten vor allem das Tabun und werden daher
häufig als "Tabunasen" bezeichnet.
Ein Sarin spaltendes Enzym, das von Hoskin und Adie ange
reichert wurde, scheint ohne Cofaktor zu arbeiten (18-21).
Schließlich muß auf Enzyme hingewiesen werden, die Phosphor
säuretriester aus der Reihe des E 600 (Paraoxon) spalten,
das p-Nitrophenol als aktivierende Gruppe enthält. Sie wur
den zuerst von Aldridge (22) beschrieben und später von
Hain (23-24) angereichert. Sie scheinen nach Kojima und
- 2-
O'Brien (25) durch Ca++ aktiviert zu werden und zeigen Spezi
fitätsüberschneidungen mit einigen oben genannten Enzymen.
In letzter Zeit sind sie durch chromategraphische Verfahren
von Lenz (26) und Zech (27) gereinigt worden, wobei beide
Autoren nicht von Cofaktoren berichten. Auch Geldmacher von
Mallinckrodt et al. (28,29) erwähnen keine Metallionen als
Cofaktoren bei den Serumenzymen.
Da die insektiziden Phosphorsäuretriester erst in den letz
ten Jahrzehnten synthetisch hergestellt werden, ist es kaum
vorstellbar, daß die Triesterasen für diese Aufgabe vorge
sehen sind. Derzeit ist aber nicht bekannt, welche eigent
liche Funktion diese Enzyme im Organismus ausüben.
Das Vorhandensein eines solchen Phänomens führt nun zu der
Frage, inwieweit die bisher nicht bekannte physiologische
Reaktion, die von diesen Enzymen katalysiert wird, analog
oder gar identisch ist mit der Reaktion an den "unphysiolo
gischen" Triestern. Weiterhin erhebt sich die Frage, ob die
hier festgestellte Spezifität für solche Triester nur durch
eine geringfügige Modifikation im aktiven Zentrum erreicht
worden sein könnte. Diese Probleme, die von großer Bedeu
tung für die generelle Frage sind, wie schnell sich Organis
men auf Schadstoffe adaptieren können, die von außen an sie
heran getragen werden, können nur angegangen werden, wenn
man den Reaktionsmechanismus bzw. den Ablauf der Reaktion
im aktiven Zentrum genau kennt. Erst danach kann man Überle
gungen dahingehend anstellen, von woher sich das neue Enzym
ableiten könnte.
Um den Ablauf der Reaktion studieren zu können, war es zu
nächst notwendig, einen Isolierungsgang zu entwickeln, der
über die in der Literatur bisher beschriebenen Anreiche
rungsverfahren hinaus zu einem sauberen Enzym führt. Weiter
hin mußte eine Charakterisierung dieses Enzyms und eine Ab
grenzung der Spezifität durchgeführt werden und die Rolle
des Cofaktors genauer untersucht werden. Schließlich war es
notwendig, den Verlauf der Reaktion kinetisch zu verfolgen,
um mit Hilfe der bei den Messungen mit verschiedenen Sub
straten gewonnenen Daten Rückschlüsse auf den Reaktionsab
lauf ziehen zu können. Die Ergebnisse dieser Versuche wer
den im folgenden dargelegt.
2. Isolierung
Das DFP-spaltende Enzym aus Schweinenieren ist von Mounter
(7) durch alkoholische Fällungen angereichert worden. Diese
Anreicherungsvorschrift wurde aufgegriffen und durch den
Anschluß mehrerer chromategraphischer Reinigungsschritte
erweitert und verbessert. Dabei gelang die Abtrennung einer
im Extrakt enthaltenen Esteraseaktivität (gegen p-Nitro
phenylacetat als Substrat) erst durch Einfügen eines Hitze
denaturierungsschrittes.
Aus den Erfahrungen von mehreren Isolierungsgängen hat sich
der folgende Arbeitsgang als der derzeitig optimale erwiesen
(die Mengenangaben beziehen sich dabei auf eine Ausgangs
menge von 500 g tiefgefrorener Schweineniere).
- 3 -
Schweineniere 3
+ 1500 ml H2o mit 10- M MnC12
und 10-3 M ß-Mercaptoäthanol,
homogenisieren,
+ Acetatpuffer (0.1 M, pH 4.5)
bis auf pH 6.8,
3 h rühren, 4° C
Suspension
15 h zentrifugieren
14000 X g, 4° C
Rückstand Überstand
verworfen
über Glaswolle
filtrieren
Filtrat
+ Acetatpuffer (0.1 M, pH 4.5)
bis auf pH 5.5,
3 h zentrifugieren,
14000 X g, 4° C
Rückstand Überstand
verworfen
+ Äthanol Vol: 60% des Über
stands, 24 h Methanolbad
(- 10° C), 3 h zentrifugieren,
14000 X g, 0° C
Überstand Rückstand
verworfen + 800 ml 0.5 M NaCl mit 1o-3M
ß-Mercaptoäthanol und 10-3 M
MnC12, 3 h rühren, 4° C,
2 h zentrifugieren,
14000 X g, 4° C
Rückstand Überstand
verworfen
+ Acetatpuffer (0.1 M, pH 4.5)
bis auf pH 5. 5,
3 h zentrifugieren,
14000 X g, 4° C,
Überstand
- 4 -
Rückstand Uberstand
verworfen
+ Äthanol Vol: 5% des Uberstands
30 min Methanolbad (-10° C),
1 h zentrifugieren, 14000 x g, 0° C
Rückstand Uberstand
verworfen
+ Äthanol Vol: 10% des Überstands,
45 min Methanolbad (-10° C),
1 h zentrifugieren, 14000 x g, 0° C
Uberstand Rückstand
verworfen
+ 160 ml 0.5 M NaCl mit 10-3 M ß-Mer
captoäthanol und 10-3 M MnC12,
1 h rühren, 4° C
Lösung
Sepharose 4B - Chromatographie,
Elutionsmittel: 0.5 M NaCl mit 10-3 M
ß-Mercaptoäthanol und 10-3 M MnC12,
Säule: 5 x 120
Durchlaufgeschwindigkeit 40 ml/h
Fraktionen: 35 ml
aktive Fraktionen
Ultrafiltration
Diaflow Membranfilter PM 30
eingeengte Lösung
Sephadex G 200 - Chromatographie
Elutionsmittel: 0.5 M NaCl mit 10-3 M
MnC12 und 10-3 M ß-Mercaptoäthanol
Säule: 2.5 x 100
Durchlaufgeschwindigkeit 8 ml/h
Fraktionen: 6 ml
aktive Fraktionen
- 5-
aktive Fraktionen
Ultrafiltration
Diaflow Membranfilter PH 30
eingeengte Lösung
Nach dieser Operation wurde eine etwa 500 fach gereinigte
Enzymlösung erhalten. Schema 1 zeigt die Bilanz des Iso
lierungsganges.
3. Charakterisierung des Enzyms
3.1. ~~~~E~~~~~S-~~E-~~!~~!~-~~~-!~~!!~E~~~-~z~~-
Für die Beurteilung, ob eine Proteinfraktion einheitlich
ist, werden folgende Kriterien herangezogen
1) Keine Steigerung der spezifischen Aktivität bei
weiteren Reinigungsschritten
2) Zusammenfallen des Aktivitätspeaks mit dem Protein
peak bei chromategraphischen Trennverfahren
3) Eine einzelne Bande in der Diskelektrophorese
Wie den in Schema 1 aufgeführten Werten zu entnehmen ist,
konnte mit dem letzten Reinigungsschritt durch Sephadex
G 100 - Chromatographie eine Steigerung der spezifischen
Aktivität um den Faktor 2 erreicht werden. Weitere Reini
gungsoperationen hatten keine Erhöhung der spezifischen
Aktivität zur Folge, was als Hinweis auf die Reinheit der
Enzymlösung gewertet werden kann. Dafür spricht auch die
Tatsache, daß das Aktivitätsprofil aller anschließend durch
geführten chromategraphischen Reinigungsversuche mit dem
Elutionsprofil zusammenfällt.
Zur Kontrolle für den Fortschritt des Isolierungsverfahrens
wurde eine Polyacrylamid-Diskelektrophorese nach Ornatein
und Davies (30,31) durchgeführt. In Abb. 1 sind die Gelelek
trophoresen nach den verschiedenen Reinigungsschritten ge
zeigt. 1a) stellt die Diskelektrophorese nach den fraktio
nierten alkoholischen Fällungen (Reinigungsschritt 4 in
Schema 1) dar; 1b) nach der Sepharose 4B- Chromatographie
(Schritt 5 in Schema 1); 1c) zeigt die Diskelektrophorese
nach Sephadex G 200 - Chromatographie (Schritt 6 in Schema 1)
1d) nach der Hitzedenaturierung (Schritt 7 in Schema 1) und
schließlich 1e) die Diskelektrophorese nach der Sephadex
G 100 - Chromatographie (Schritt 8 in Schema 1). In der End
präparation ist keine zweite Bande und somit keine Verunrei
nigung mehr nachzuweisen.
Um nähere Aufschlüsse über das Enzym zu erhalten, wurde
die Stabilität in Abhängigkeit vom pH-Wert diskelektropho
retisch und spektroskopisch untersucht. Beide Verfahren
ergaben übereinstimmend einen weiten pH-Bereich, in dem das
- 6 -
Protein einheitlich bleibt und sich weder im Bild der
Diskelektrophorese noch im Spektrum Veränderungen zeigten.
Dieser Bereich erstreckt sich von pH 3.5 - 9.0. Unterhalb
von pH 3.5 und oberhalb von pH 9.0 entstehen in der Diske
lektrophorese zwei neue Banden, während die alte entspre
chend verschwindet. Parallel dazu verschiebt sich auch das
Spektrum erst bei den extremen pR-Werten. Mit der Spaltung
des Enzyms in zwei verschiedene Untereinheiten geht auch
die Aktivität irreversibel verloren.
Durch Zugabe von EDTA als Komplexbildner läßt sich das En
zym irreversibel inaktivieren. Weiterhin verschwindet nach
Zugabe von p-Chlormercuribenzoat die Aktivität sehr schnell,
so daß angenommen werden muß, daß eine SR-Gruppe am Enzym
für die Aktivität von großer Bedeutung ist. Diesen beide~
Kriterien ist bei der Isolierung durch die Zugabe von Mn +
und ß-Mercaptoäthanol Rechnung getragen worden. In der auf
diese Weise stagilisierten Lösung ist das Enzym über mehre
re Wochen bei 4 C mit nur geringen Aktivitätsverlusten auf
zubewahren.
Das Molekulargewicht des. Proteins wurde nach Osborn und
Weber (32) durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit Hil
fe von Vergleichsproteinen ermittelt. Das Molekulargewicht
des isolierten Enzyms betrug hiernach 62 000 daltons. Ver
suche an der Ultrazentrifuge bei niedriger Salzkonzentration
ergaben keinerlei Anhaltspunkte für eine größere Enzymein
heit, so daß die ermittelten 62 000 daltons als Molekular
gewicht des intakten Enzyms angesehen werden können. Das
Enzym dissoziiert aber bei hohen und niedrigen pR-Werten
in zwei Untereinheiten, deren Molekulargewicht durch SDS
Elektrophorese zu ca. 30 000 daltons ermittelt wurde. Unter
suchungen mit Hilfe der Ultrazentrifuge bestätigen die durch
SDS-Elektrophorese gewonnenen Daten. Beide Untereinheiten
sind nicht aktiv, bei gleichem Molekulargewicht jedoch von
unterschiedlicher Natur, wie die Diskelektrophoresen zeigen.
4. ~~~~!~~2~~~-Y~~-2~f~~~E~~
Laut Mounter et al (9) benötigt, ~e bereits erwähnt wurde,
das Enzym zur vollen Aktivität Mn als Cofaktor. Die unbe
dingte Notwendigkeit dieses Ions für die Stabilität des
Proteins konnte bestätigt werden.
Oben wurde bereits gesagt, daß nach Zugabe von EDTA die Ak
tivität des Enzyms verschwindet. Dieser Vorgang ließ sich
mit Hilfe der ESR-Spektroskopie verfolgen. Dabei zeigte
sich, daß mit dem Verlust der Aktivitä~ auch das von der
Konzentration an proteingebundenem Mn+ abhängige ESR-Spek
trum des Enzyms verschwindet. Die Ak~tvitätsabnahme ist
offensichtlich auf den Verlust an Mn zurückzuführen. Wird
dieser Prozeß mit Hilfe der Diskelektrophorese verfolgt, so
ergibt sich ein dem Verhalten bei niedrigen und hohen pR
Werten analoges Bild, d.h. das Protein dissoziiert in zwei
inaktive Untereinheiten. Da diese Untereinheiten das gleiche
elektrophoretische Verhalten und das gleiche Molekular-
