Table Of Content云 南 植 物 研 究 , ():
暋2010 323 239~249
ActaBotanicaYunnanica : /
暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI10灡3724SP灡J灡1143灡2010灡09234
藓类植物DNA条码的初步研究———以蔓藓科部分属为例*
赵丽嘉 ,,贾 渝 ,周世良**,杜桂森
12 2** 2 3
暋
首都师范大学生命科学学院 北京 中国科学院植物研究所植物系统
(1 , 暋100048;2
与进化国家重点实验室 北京
, 暋100093)
摘要:选取 个叶绿体基因片段 其中 个编码区基因片段 和 个非编码区
7 , 3 (matK,rps4andrbcL灢a) 4
基因片段 一个线粒体基因片段 和一个核基因
(atpB灢rbcL,atpF灢H,psbK灢IandtrnH灢psbA), (nad5)
片段 材料包括 个属 个种的 份样品 分析比较了 个基因片段的多样性 种内和种间的
(ITS2), 5 14 74 。 6 、
遗传距离 鉴别率等 结果显示 在使用单个片段时 的鉴定效果最好 而 则是叶绿体基
、 。 , ITS2 , atpB灢rbcL
因片段中鉴别能力最高的 使用组合片段的结果发现 两个基因片段组合的鉴别效果最好 通过 树的
。 , 。 NJ
方法检验 和 的鉴定成功率是 当再增加一个或两
,atpB灢rbcL+trnH灢psbA rbcL灢a++trnH灢psbA 64%,
个基因片段时其鉴定效果并没有提高 本研究表明在植物中应用 条码需要用质体基因和核基因联
。 DNA
合
。
关键词: 条形码 鉴定 蔓藓科 片段 藓类植物
DNA ; ; ; ;
中图分类号: 文献标识码: 文章编号:
Q78暋暋暋暋 暋暋 A暋暋暋暋暋暋暋暋 0253灢2700(2010)03灢239灢11
ThePreliminaryStudyonDNABarcodingofMosses
———
ACaseofPartofGeneraofMeteoriaceae
1,2 2** 2** 3
ZHAOLi灢Jia ,JIAYu ,ZHOUShi灢Liang ,DUGui灢Sen
(1SchoolofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100048,China;2StateKeyLaboratoryofSystematic
andEvolutionaryBotany,InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093,China)
Abstract
:WecomparedtheperformancesofthecandidatelociformossDNAbarcodingandtheprimersused
inamplifyingtheloci.Primersforthreecodedloci(matK,rps4andrbcL灢a)andfournon灢codedloci(at灢
pB灢rbcL,atpF灢H,psbK灢IandtrnH灢psbA)ofthechloroplastgenome,onefromthemitochondrialge灢
nome(nad5),andonefromthenucleusgenome(ITS2)wereevaluated.Seventy灢foursamplesrepresenting
14speciesbelongingtofivegeneraofTrachypodoaceae(orMeteoriaceae)werescreened.Allprimersfor
matKandapairofprimersfortrnH灢psbAfailed.Lowsuccesseswereencounteredwiththeprimersforat灢
pF灢HandpsbK灢I.TheprimersforpsbK灢IproducedseveralbandsandthePCRproductsofatpF灢Hwere
difficulttosequence.Thepowersoftheremainingsixlociwerecomparedusingthevariability,identification
successandtheresolutions.ItwasfoundthatITS2isthemostpromisingcandidateforDNAbarcodingfor
mosses.Amongthechloroplastgenes,atpB灢rbcLexhibitedthehighestresolution.AlthoughtrnH灢psbAis
veryvariable,itistooshorttobeanidealbarcodealone.Combinationsofchloroplastgeneswerealsotriedand
PsofbothatpB灢rbcL+trnH灢psbAandrbcL灢a++trnH灢psbAwere64%usingNJmethod.Moreadditionsofloci
didnotincreasetheresolution.Nobarcodinggapexistsforalltheseloci.Phylogeneticanalyseswerecarriedoutpri灢
基金项目 国家自然科技资源平台项目 中科院植物所
* : (2005DKA21401); (KSCX2灢YW灢Z灢0807)
通讯作者
** :Authorforcorrespondence;E灢mail:yjia@ibcas灡ac灡cn,responsiblefortaxa;andE灢mail:slzhou@ibcas灡ac灡cnre灢
sponsibleforDNAbarcoding
收稿日期 接受发表
:2009灢11灢23,2010灢04灢01
作者简介 赵丽嘉 女 硕士 主要从事苔藓植物分子系统学研究
: (1981-) , , 。
云 南 植 物 研 究 第 卷
2暋40暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
ortotheDNAbarcodingevaluationandsometaxonomicproblemsdoexist.Thisstudyexemplifiesthenecessityof
correctspeciesdelimitationandtheadoptionofbothplastidandnuclearlociinplantDNAbarcoding.
Keywords
:DNAbarcode;Resolution;Meteoriaceae;Loci;Mosses
最早开展植物 条码研究的是 等 本研究除了做了
暋 DNA Kress atpB灢rbcL,rps4,rbcL灢a,trnH灢psbA,nad5
在使用了 个片段对被子植物进行探 和 共用了 对引物 见表 外 也做了
(2005)。 11 ITS2( 14 , 2) , atpF灢at灢
个片段 但后者预扩增
讨后,他们认为psbA灢trnH 是最有潜力成为植 p结H果,m不at太K好,psb我K灢们I,设rp计oB了,rpoC1引5物 但是,扩增效果很差
物中 条码的候选片段 尽管它比较短 。 matK , 。
DNA , (曋 叶绿体基因用 产物直接测序法测定序列 核基因的
但是其变异位点较多而且容易扩增 PCR ,
450bp), 。 产物用试剂盒克隆测序 每个样品至少测定 个克隆
然而 越来越多的研究已经表明要使用单个 PCR , 8 。
, 所获得的序列先用 校对拼接 用
片段来对所有的植物物种进行准确鉴定是非常困 SEQUENCHER4灡7 , Clust灢
比对后 再用
alX2灡0 (LarkinandBlackshields,2007), SE灢
难的 一系列的片段组合尝试之后 已经提出一
手工调整
。 , ALversion2灡0a11 (Rambaut,1996)。
些具体的基因片段组合 和 数据分析
:rpoC1+rpoB+matK 1灡3暋
系统发育分析和物种鉴定 为了评估物种鉴定
rpoC1+matK +psbA灢trnH (Chase,2007),rbcL 1灡3灡1暋 暋
是否正确 先使用软件
+trnH灢psbA (KressandErickson,2007),matK , PAUP*ver.4灡0b10(Swofford,
使用最大简约法 构建系统发育树 树
和 2003) (MP) 。MP
+atpF灢atpH+psbK灢psbI matK+atpF灢atpH + 以外类群置根 当缺失数据处理
,gap 。
trnH灢psbA (Pennisi,2007),matK +trnH灢psbA 条码分析 对于物种的鉴定能力是使用
等 1灡3灡2暋DNA 暋
(Lahaye ,2008b)。 树的方法 树是基于 遗传距离建立的 我们
到目前为止 有关苔藓植物 条码研究 NJ ,NJ K2P 。
, DNA 使用以下两种方法 检验和 检验 来比较不同
尚未有报道 苔藓植物的 条码鉴定片段是否 (F灢 BBA灢 )
。 DNA 片段对物种的鉴别能力。
与维管植物一致或者有其特殊性 还需要我们通过 检验 该检验方法是用来测试实验用的标记是否
? F灢 :
大量的工作来回答这些问题 本研究以分布于中 适合鉴别属和种 分子的多样性使用
。 。 ARLEQUINver.
国的蔓藓科中部分属为例来开展工作 其目标是 等 中的 等
, 3灡0(Excoffier ,2005) AMOVA (Excoffier ,
初步探讨适合藓类植物的基因片段或片段组合 分析了属间 属内 种间和种内的关系
。 1992) 、 、 。
检验
我们选取如下 个属 异节藓属 BBA灢 (“Bestmatch暠,“Bestclosematch暠and
5 : Diaphan灢 使用这种检验方法是为了得到
扭 叶 藓 属 拟 木 毛 藓 属 “Allspeciesbarcodes暠):
odon、 Trachypus、 本次研究中用到的标记的鉴定能力 等
拟扭叶藓属 (Meier ,2006)。
Pseudospiridentopsis、 Trachypo灢 使用软件 来计算 检验
和绿锯藓属 上述 属在全世 TaxonDNA BBA灢 。
dopsis Duthiella。 5
界有 种 等 在中国有 种
22 (Frey ,2009), 14 结果
等 这些属曾经属于扭叶藓科 2暋
(Redfearn ,1996)。 PCR扩增和测序
主要分布于旧热带地区 而新 2灡1暋
Trachypodaceae, , 本次研究使用了下列片段
热带地区仅有 属 种 等 ,atpB灢rbcL,
2 2 (Gradstein ,2001)。 和
年 将扭叶藓科归并到蔓藓科 rps4,rbcL灢a,trnH灢psbA,nad5 ITS2,
1994 Buck 。 其扩增成功率都在 以上 只有几个片段中
90% ,
的极小部分没有被扩增出来 全部扩增成
材料和方法 。ITS2
功 扩增成功率最低的是 有 没有扩增
1暋
取样 , nad5, 7%
1灡1暋 成功 表 另外本研究中还增加了
取分布在中国的 份材料 包括 个属 分别为异 ( 3)。 atpF灢at灢
74 , 5 , 和 个片段
节藓属 扭叶藓属 拟木毛藓属 拟扭叶藓属和绿锯藓 pH,psbK灢I matK,atpF灢atpH 4 ,
、 、 、 但是仅有一部分扩增成功并测序 而且测序成功
属 总共 个种 每个种 个样品 外类群是塔藓 ,
。 14 , 1~13 。 率比较低 所以没有对这些数据进行分析
科的小蔓藓 表 , 。
Meteoriellasoluta(Mitt).Okam。( 1)
不同片段组合鉴定能力的比较
DNA提取、扩增和测序
1灡2暋 2灡2暋
的材料均取自近 天采集的干标本 提取全 在使用 树方法和 散点图方法时 核
DNA 15 , NJ K2P ,
基因组 采用 法 基因 的分辨能力存在不一致的现象 图
DNA, CTAB ,(DoyleandDoyle,1987)。 ITS2 (
期 赵丽嘉等 藓类植物 条码的初步研究 以蔓藓科部分属为例
3 暋暋暋 暋暋暋暋 : DNA ——— 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋24暋1
散点图结果表明 的鉴别能力比这 初步结果显示 在单个
1),K2P ITS2 rps4>rbcL灢a>nad5。 :
两个叶绿体基因 和 弱 与 片段中 除了 鉴定效果最好
atpB灢rbcL rbcL灢a , NJ , ITS2,atpB灢rbcL 。
树方法的结果恰好相反 其它片段的结果也不一 但是单一基因片段在物种鉴定上仍然存在缺陷
, ,
致 因此 我们没有展示核基因 和其它基 例如 有的片段引物通用性差 有的片段普遍存
, , ITS2 , ;
因片段的比较图 图 显示单个基因片段鉴定能 在插入 缺失事件 导致在不同类群间的长度变
。 2 / ,
力大小的顺序依次是 异很大 有的片段的信息位点少且鉴别能力弱
atpB灢rbcL>trnH灢psbA> ; ;
表 取样表
1暋
Table1暋Sampling
种名 采集地 标记 凭证标本
Taxa Locality Code Voucher(PE)
异节藓
Diaphanodonblandus(Harv.)Ren&Card
四川省泸定县 贾渝
暋1 Luding,Sichuan * (Y.Jia)J01857(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋2 Luding,Sichuan * (Y.Jia)J01986(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋3 Luding,Sichuan SC灢1 (Y.Jia)J02161(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋4 Luding,Sichuan SC灢2 (Y.Jia)J02129(PE)
四川省汶川县 汪楣芝
暋5 Wenchuan,Sichuan * (M灡Z.Wang)W58561(PE)
四川省汶川县 汪楣芝
暋6 Wenchuan,Sichuan SC灢3 (M灡Z.Wang)W58754(PE)
斜枝绿锯藓
Duthielladeclinata(Mitt.)Zant
贵州省道真县 何强
暋1 Daozhen,Guizhou GZ (Q.He)H636(PE)
江西省崇文县 于宁宁
暋2 Chongwen,Jiangxi JX (N灡N.Yu)Y01151(PE)
四川省盐边县 汪楣芝
暋3 Yanbian,Sichuan SC (M灡Z.Wang)W20374(PE)
软枝绿锯藓
Duthiellaflaccida(Card.)Broth
重庆市仙女峰 李建文
暋1 XiannvMountain,Chongqing CQ (J灡W.Li)L409(PE)
甘肃省文县 李粉霞
暋2 Wenxian,Gansu GS (F灡X.Li)L223(PE)
广西省那坡县 裴林英
暋3 Napo,Guangxi GX (L灡Y.Pei)P2322(PE)
贵州省道真县 何强
暋4 Daozhen,Guizhou * (Q.He)H451(PE)
四川省峨眉山 何强
暋5 EmeiMountain,Sichuan SC灢1 (Q.He)H1162(PE)
四川省峨眉山 何强
暋6 EmeiMountain,Sichuan SC灢2 (Q.He)H1315(PE)
四川省都江堰市 汪楣芝
暋7 DujiangyanCity,Sichuan SC灢3 (M灡Z.Wang)W58360(PE)
四川省都江堰市 贾渝
暋8 DujiangyanCity,Sichuan * (Y.Jia)J06569(PE)
美绿锯藓
DuthiellaspeciosissimaBroth.ex.Card
重庆市南川市 刘阳
暋1 Nanchuan,Chongqing CQ灢1 (Y.Liu)L2520(PE)
重庆市巫溪县 李粉霞
暋2 Wuxi,Chongqing CQ灢2 (F灡X.Li)L1364(PE)
重庆市巫溪县 王庆华
暋3 Wuxi,Chongqing CQ灢3 (Q灡H.Wang)W20(PE)
甘肃省文县 贾渝
暋4 Wenxian,Gansu GS (Y.Jia)J09157(PE)
甘肃省文县 贾渝
暋5 Wenxian,Gansu * (Y.Jia)J09127(PE)
湖北省宜昌市 王庆华
暋6 YichangCity,Hubei HB (Q灡H.Wang)W585(PE)
四川省都江堰市 刘阳
暋7 DujiangyanCity,Sichuan SC灢1 (Y.Liu)L417(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋8 Luding,Sichuan SC灢2 (Y.Jia)J01931(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋9 Luding,Sichuan SC灢3 (Y.Jia)J01951(PE)
拟木毛藓
Psedospiridentopsishorrida(Card)Fleisch
福建省将乐县 汪楣芝
暋1 Jiangle,Fujian FJ (M灡Z.Wang)W48287(PE)
贵州省道真县 何强
暋2 Daozhen,Guizhou GZ灢1 (Q.He)H246(PE)
贵州省道真县 黄玉茜
暋3 Daozhen,Guizhou GZ灢2 (Y灡Q.Huang)H115(PE)
贵州省道真县 黄玉茜
暋4 Daozhen,Guizhou GZ灢3 (Y灡Q.Huang)H294(PE)
大耳拟扭叶藓
Trachypodopsisauriculata(Mitt.)Fleisch
广西省九万山 龙光日 张灿明
暋1 JiuwanshanMountain,Guangxi GX灢1 & (G灡R灡Long&C灡M灡Zhang)GSY灡0286(PE)
广西省猫儿山 左勤 王幼芳
暋2 MaoerMountain,Guangxi GX灢2 & (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1464(HSNU;PE)
广西省猫儿山 左勤 王幼芳
暋3 MaoerMountain,Guangxi GX灢3 & (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1532(HSNU;PE)
云南省贡山 汪楣芝
暋4 Gongshan,Yunnan * (M灡Z.Wang),9310灢b(PE)
台湾拟扭叶藓
TrachypodopsisformosanaNog.
重庆市城口县 贾渝
暋1 Chengkou,Chongqing * (Y.Jia)J10263(PE)
云 南 植 物 研 究 第 卷
2暋42暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
续表
1
种名 采集地 标记 凭证标本
Taxa Locality Code Voucher(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋2 Luding,Sichuan SC (Y.Jia)J01844(PE)
西藏波密县 贾渝
暋3 Bomi,Xizang XZ (Y.Jia)J05755(PE)
云南省贡山 刘阳
暋4 Gongshan,Yunnan YN (Y.Liu)L3736(PE)
疏耳拟扭叶藓
TrachypodopsislaxoalurisBroth.
安徽省黄山 陈邦杰
暋1 Huangshan,Anhui * (P灡C.Chen)7361a(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋2 Luding,Sichuan * (Y.Jia)J01744(PE)
四川省泸定县 汪楣芝
暋3 Luding,Sichuan * (M灡Z.Wang)W58776(PE)
拟扭叶藓
Trachypodopsisserrulata(P.Beauv)Fleisch
重庆市南川区 刘阳
暋1 Nanchuan,Chongqing CQ灢1 (Y.Liu)L2119(PE)
重庆市巫溪县 李粉霞
暋2 Wuxi,Chongqing CQ灢2 (F灡X.Li)L1354(PE)
贵州省道真县 何强
暋3 Daozhen,Guizhou GZ (Q.He)H036(PE)
广西省猫儿山 左勤 王幼芳
暋4 MaoerMountain,Guangxi * & (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)429(PE)
广西省猫儿山 左勤 王幼芳
暋5 MaoerMountain,Guangxi * & (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1353(PE)
湖南省吊罗山 林邦娟 张力
暋6 DiaoluoMountain,Hunan * & (B灡J.Lin&L.Zhang)1084(PE)
扭叶藓
TrachypusbicolorReinw.etHornsch
重庆市南川区 刘阳
暋1 Nanchuan,Chongqing CQ (Y.Liu)L2632(PE)
甘肃省文县 李粉霞
暋2 Wenxian,Gansu GS (F.X.Li)L561(PE)
广西省那坡县 裴林英
暋3 Napo,Guangxi GX (L灡Y.Pei)P2417(PE)
贵州省道真县 汪楣芝
暋4 Daozhen,Guizhou GZ灢1 (M灡Z.Wang)W58901(PE)
贵州省道真县 何强
暋5 Daozhen,Guizhou GZ灢2 (Q.He)H410(PE)
贵州省道真县 何强
暋6 Daozhen,Guizhou GZ灢3 (Q.He)H476(PE)
贵州省道真县 黄玉茜
暋7 Daozhen,Guizhou GZ灢4 (Y灡Q.Huang)H345(PE)
贵州省道真县 黄玉茜
暋8 Daozhen,Guizhou GZ灢5 (Y灡Q.Huang)H455(PE)
贵州省道真县 黄玉茜
暋9 Daozhen,Guizhou GZ灢6 (Y灡Q.Huang)H476(PE)
湖北省宜昌市 王庆华
暋10 YichangCity,Hubei HB (Q灡H.Wang)W613(PE)
四川省都江堰市 刘阳
暋11 DujiangyanCity,Sichuan SC灢1 (Y.Liu)L123(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋12 Luding,Sichuan * (Y.Jia)J01885(PE)
四川省泸定县 贾渝
暋13 Luding,Sichuan SC灢2 (Y.Jia)J02198(PE)
Trachypussp1(=T灡bicolor?)
四川省峨眉山 何强
暋1 EmeiMountain,Sichuan SC灢1 (Q.He)H897(PE)
四川省汶川县 汪楣芝
暋2 Wenchuan,Sichuan SC灢2 (M灡Z.Wang)W58707(PE)
四川省汶川县 刘阳
暋3 Wenchuan,Sichuan SC灢3 (Y.Liu)L756(PE)
西藏墨脱县 汪楣芝
暋4 Motuo,Xizang XZ (M灡Z.Wang)800518灢栟 (PE)
Trachypussp2(=T灡bicolor?)
甘肃省文县 贾渝
暋1 Wenxian,Gansu GS (Y.Jia)J09324(PE)
贵州省道真县 汪楣芝
暋2 Daozhen,Guizhou GZ (M灡Z.Wang)W58955(PE)
Trachypussp3(=T灡bicolor?)
四川省都江堰市 汪楣芝
暋1 DujiangyanCity,Sichuan SC (M灡Z.Wang)W57363(PE)
小扭叶藓
暋TrachypushumilisLindb.
广西省猫儿山 左勤 王幼芳
暋1 MaoerMountain,Guangxi * & (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1823灢1(PE)
广西省猫儿山 左勤 王幼芳
暋2 MaoerMountain,Guangxi * & (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)299(PE)
广西省那坡县 裴林英
暋3 Napo,Guangxi * (L灡Y.Pei)P2550(PE)
江西省上犹县 于宁宁
暋4 Shangyou,Jiangxi JX (N灡N.Yu)Y01236(PE)
贵州省道真县 黄玉茜
暋5 Daozhen,Guizhou GZ (Y灡Q.Huang)H344(PE)
长叶扭叶藓
暋TrachypuslongifoliusNog.
广西省靖西县 裴林英
暋1 Jingxi,Guangxi GX (L灡Y.Pei)P2713(PE)
湖北省神农架
暋2 Shennongjia,Hubei * Sino灢ALutegn1726(PE)
小蔓藓
Meteoriellasoluta(Mitt).Okam.
贵州省道真县 黄玉茜
暋1 Daozhen,Guizhou GZ (Y灡Q.Huang)H364(PE)
没有序列的样品
* *unsequenced
期 赵丽嘉等 藓类植物 条码的初步研究 以蔓藓科部分属为例
3 暋暋暋 暋暋暋暋 : DNA ——— 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋24暋3
表 引物序列及退火温度
2暋
Table2暋Primersequencesandannealingtemperatures(Ta)
Genome Gene Primername Primersequence(5曚to3曚) Ta(曟)
Chloroplast
atpB灢rbcL atpB灢1 ACATCKARTACKGGACCAATAA 50
rbcL AACACCAGCTTTRAATCCAA
atpF灢H atpF ACTCGCACACACTCCCTTTCC 50
atpH GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT
matK matK2灡1f CCTATCCATCTGGAAATCTTAG 50
matK5r GTTCTAGCACAAGAAAGTCG 52
matK3灡2r CTTCCTCTGTAAAGAATTC
matK1f CGATCTATTCATTCAATATTTC
matK1r TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT
psbK灢I psbK TTAGCCTTTGTTTGGCAAG 50
psbI AGAGTTTGAGAGTAAGCAT 52
rbcL灢a rbcL灢ar CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC 50
rbcL灢af ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
rps4 rps5 ATGTCCCGTTATCGAGGACCT 50
trnS TACCGAGGGTTCGAATC
trnH灢psbA psbA1f ACTGCCTTGATCCACTTGGC 50
trnH1r CGAAGCTCCATCTACAAATGG
psbA3F GTTATGCATGAACGTAATGCTC 50
trnH3R CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
Mitochondrion
nad5 nad3R AAAACGCCTGCTGTTACCAT 50
nad4F GAAGGAGTAGGTCTCGCTTCA
Nuclear
ITS2 P3 CTTGGCTCTTGCAACGATGA 52
P4 CCTCCCGCTTATTGATATGC
表 三类不同来源的基因组中 对引物的PCR扩增和测序成功率
3暋 12
Table3暋PCRandsequencingsuccessesof12pairsofprimersfor9lociinthreegenomes
Lengthof PCRsuccess Sequencingsuccess
Locusname Primername Samplestested
products (%) (%)
atpB灢rbcL atpB灢1,rbcL 74 714 96 93
atpF灢H atpF,atpH 50 700 85 71
matK matK1f,matK1r 24 0 0 —
matK2灡1f,matK5r 24 0 0 —
matK2灡1f,matK3灡2r 24 0 0 —
psbK灢I psbK,psbI 50 400,700 86 —
rbcL灢a rbcL灢af,rbcL灢ar 74 571 97 91
rps4 rps5,trnS 74 617 99 96
trnH灢psbA psbA3f,trnH3r 74 218 96 100
psbA1f,trnH1r 24 0 — —
nad5 nad3R,nad4F 74 1140 93 82
ITS2 P3,P4 74 468 100 96
有的片段的信息位点多且鉴定能力也弱 因此 但是不同组合的鉴定能力的大小差异不是很大
, , 。
考虑使用多个基因片段的组合 至少是两个片段 图 中的 和 说明
, 2 P Q atpB灢rbcL+trnH灢psbA+
组合对物种的分辨率可能有较大提高 因为组合
, rbcL灢a>rbcL灢a +rps4+trnH灢psbA>atpB灢
的基因片段在一定程度上可以降低因种内变异而 与 树方法的结果
rbcL+trnH灢psbA+rps4, NJ
带来的影响 同时减少种内和种间变异的重叠 也不一致
, , 。
云 南 植 物 研 究 第 卷
2暋44暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
图 和叶绿体基因鉴定能力的比较 和 和
1暋ITS2 暋A.atpB灢rbcL ITS2;B.rbcL灢a ITS2
Fig灡1暋ComparisonsofthepoweridentificationofITS2andcpDNA.A.atpB灢rbcLandITS2;B.rbcL灢aandITS2
序列的多样性 段 次之的是 种
2灡3暋 ITS2(13灡60), atpB灢rbcL(11灡89)。
我们所使用的基因片段的多样性是通过用变 间和种内的多样性比率在扭叶藓属内最高 同样
,
异位点 信息位点 种间与种内分子多样性的比 最高的也是核基因片段 其次是
、 、 TIS2 (31灡15),
率等 种指标来体现 由于异节藓属和拟木毛藓 片段 属间与属内的多样性
3 。 atpB灢rbcL(10灡45)。
属都是单种属 因此不存在种间和种内的比率 最高的是叶绿体片段 其次
, trnH灢psbA (12灡81),
表 总体来看 多样性最高的序列是核基因片 是
( 4)。 , rbcL灢a(10灡85)。
表 候选条码的序列多样性
4暋
Table4暋Sequencevariabilityofcandidatebarcodes
p
Locus Genera N L Cv Vb/Va
Diaphanodon 3 607 0 0 —
Duthiella 16 675 13 3灡48 1灡66
atpB灢rbcL Psedospiridentopsis 4 633 0 0 —
Trachypodopsis 9 694 18 6灡06 1灡85
Trachypus 22 618 14 2灡92 10灡45
Alltogether 54 694 45 11灡89 6灡13
Diaphanodon 3 566 1 0灡67 —
Duthiella 16 566 8 2灡70 6灡32
rbcL灢a Psedospiridentopsis 4 566 0 0 —
Trachypodopsis 9 566 5 1灡39 1灡00
Trachypus 22 566 12 2灡00 3灡12
Alltogether 54 566 26 5灡20 10灡85
Diaphanodon 3 614 21 14灡00 —
Duthiella 16 615 11 3灡21 2灡34
rps4 Psedospiridentopsis 4 615 3 1灡50 —
Trachypodopsis 9 616 6 2灡22 1灡33
Trachypus 22 614 18 5灡46 3灡64
Alltogether 54 616 38 9灡13 4灡94
Diaphanodon 3 213 0 0 —
Duthiella 16 217 4 0灡88 2灡01
trnH灢psbA Psedospiridentopsis 4 217 0 0 —
Trachypodopsis 9 218 4 1灡22 5灡52
Trachypus 22 214 14 3灡40 4灡53
Alltogether 54 218 28 4灡21 12灡81
期 赵丽嘉等 藓类植物 条码的初步研究 以蔓藓科部分属为例
3 暋暋暋 暋暋暋暋 : DNA ——— 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋24暋5
续表
4
p
Locus Genera N L Cv Vb/Va
Diaphanodon 2 1130 0 0 —
Duthiella 16 1126 39 7灡20 0/0
nad5 Psedospiridentopsis 4 1124 1 0灡50 —
Trachypodopsis 7 1130 13 0 0/0
Trachypus 21 1130 3 0 0/0
Alltogether 54 1130 56 0 0/0
Diaphanodon 3 428 18 29灡33 —
Duthiella 16 413 22 5灡80 1灡79
ITS2 Psedospiridentopsis 4 412 0 0 —
Trachypodopsis 9 405 10 3灡56 1灡73
Trachypus 22 443 82 17灡71 31灡15
Alltogether 54 443 132 13灡60 5灡78
注 序列长度 变异位点 两条序列之间每个位点平均的平均核苷酸差异 p 种间与种内多样性差异的比率
: (L); (Cv); (); (Vb/Va)。
代表样品的序列数
N
p
Note:L:sequencelength;Cv:variablecharacters; :theaveragenumberofnucleotidedifferencespersitebetweentwosequences;
Vb/Va:ratioofthevariancecomponentbetweenspeciestothevariancecomponentwithinspecies.N:numberofsamplessequenced
候选条码鉴别率的比较 加 如 和
2灡4暋 , atpB灢rbcL+trnH灢psbA +rbcL灢a rbcL灢
候选基因在 方法中的鉴别能力 在 组合 其鉴别率仍然为
2灡4灡1暋 BBA 暋 a+trnH灢psbA +rps4 ,
和 检验中 个叶绿体基因片段组合时鉴定率也没有
“bestmatch暠 “bestclosematch暠 , 64%。4
的鉴别率最高 在 个叶绿体 增加 同样是 如果在此 个组合上增加线
ITS2 (64灡81%)。 4 , 64%, 4
基因中 的鉴别率最高 其次是 粒体片段 时 鉴定率却反而下降了
atpB灢rbcL , rps4, nad5 , (50%)。
则 最 低 使 用
trnH灢psbA 。 “Allspeciesbar灢
来 检 验 的 鉴 别 效 果 最 好 讨论
codes暠 ,rbcL灢a 3暋
上述 种检验方法的结果并不是完 引物的通用性
(48灡14%)。 3 3灡1暋
全一致 存在一定的差异 表 成为候选 条码的首要条件是引物的通
, ( 5)。 DNA
树的鉴定结果 通过 树检验 在 用性 本研究的 个片段的引物多数都很容易扩
2灡4灡2暋NJ 暋 NJ , 。 9
单个基因片段中 的鉴定效果最好 增 和 较低的扩增成功率 可能是
ITS2 (57%), ,psbK灢I atpF灢H ,
其次是叶绿体片段非编码区 表 因为需要更严格的条件 在本次研究中没有
atpB灢rbcL ( 6)。 。matK
两个基因片段组合的结果显示 扩增成功 类似情况也见于其它研究中
atpB灢rbcL + , (Fazekas
图 和 的鉴 等
trnH灢psbA( 3) rbcL灢a+trnH灢psbA ,2008;Kressand Erickson,2007,2008;
别率最高 均为 当在这两个组合的基础 等 此外 是否在藓类植物中扩增
, 64%。 Sass ,2007), ,
上再增加一个基因片段时 鉴定成功率并没有增 还有其特殊性需要进一步探索 但是
, matK 。 matK
表 基于 “bestmatch暠,“bestclosematch暠and“Allspeciesbarcodes暠的鉴定成功率
5暋
Table5暋Dentificationsuccess(%)basedon“bestmatch暠,“bestclosematch暠and“Allspeciesbarcodes暠
Bestmatch Bestclosematch Allspeciesbarcodes
Locus
SI AI MI SI AI MI NM SI AI MI NM
atpB灢rbcL 62灡96 35灡18 1灡85 61灡11 35灡18 1灡85 1灡85 42灡59 53灡7 1灡85 1灡85
rbcL灢a 51灡85 46灡29 1灡85 51灡85 44灡44 1灡85 1灡85 48灡14 48灡14 1灡85 1灡85
rps4 57灡4 35灡18 7灡4 57灡4 33灡33 5灡55 3灡7 31灡48 61灡11 3灡7 3灡7
trnH灢psbA 46灡29 46灡29 7灡4 46灡29 46灡29 7灡4 0 44灡44 53灡7 1灡85 0
nad5 26灡0 64灡0 10灡0 26灡0 64灡0 10灡0 0 14灡0 78灡0 8灡0 0
ITS2 64灡81 29灡62 5灡55 64灡81 29灡62 3灡7 1灡85 40灡73 57灡4 0 1灡85
注 鉴定成功 模糊鉴定 鉴定失败 没有匹配
: (SI); (AI); (MI); (NM).
Note:SI:successfulidentification;AI:ambiguousindentificaiton;MI:misidentification;NM:nomatch.
云 南 植 物 研 究 第 卷
2暋46暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
图 基于 个候选 条码和不同组合的 遗传距离比较图
2暋 6 DNA K2P
Fig灡2暋K2PpairwisegeneticdistancebasedonsixcandidateDNAbarcodingregionsanddifferentcombinationloci
A.atpB灢rbcLandrbcL灢a;B.atpB灢rbcLandrps4;C.atpB灢rbcLandtrnH灢psbA;D.rbcl灢aandtrnH灢psbA;
E.rbcl灢aandrps4;F.rps4andtrnH灢psbA;G.atpB灢rbcLandnad5;H.rbcL灢aandnad5;I.rps4andnad5;J.
trnH灢psbAandnad5;K.atpB灢rbcL+trnH灢psbAandatpB灢rbcL+rbcL灢a;L.atpB灢rbcL+rps4andrbcL灢a+
rps4;M.rbcL灢a+trnH灢psbAandrps4+trnH灢psbA;N.atpB灢rbcL+trnH灢psbA+rbcL灢aandrbcL灢a+rps4+
trnH灢psbA;O.atpB灢rbcL+trnH灢psbA+rps4andatpB灢rbcL+trnH灢psbA+rps4
期 赵丽嘉等 藓类植物 条码的初步研究 以蔓藓科部分属为例
3 暋暋暋 暋暋暋暋 : DNA ——— 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋24暋7
图 基于 和 的 树 样品存在分类学问题
3暋 atpB灢rbcL trnH灢psbA NJ ,曪
Fig灡3暋TheNJtreebasedontheregionofatpB灢rbcLandtrnH灢psbA,曪indicatestaxonomicproblemofthesample
在一些被子植物类群中的扩增成功率较高 用引物的设计应该从保守性这个特点出发
(La灢 。
等 等 ITS 是藓类中最有效的一个片段
haye ,2008a,b;Starr ,2009;Hilling灢 3灡2暋 2
等 考虑到 的长度 等 首次提出把核基因 片
sworth ,2009)。 nad5 (1131 Kress (2005) ITS
的扩增成功率已经很好 尽管 断作为植物两个候选的 条码片段之一 但
bp),93% 。 ITS2 DNA 。
片段是多拷贝 但是对样品的扩增和测序都全部 从那之后即被忽略 迄今为止这个片段在植物
, 。
成功 从 扩增成功率来考虑 高等植物通 条码中应该是最好的一个候选条码 尤其是
。 PCR , DNA ,
云 南 植 物 研 究 第 卷
2暋48暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
表 单个片段和不同组合的鉴定结果,使用了没有缺失数据的 个样品
6暋 55
Table6暋Resolutionofasinglelocusandsomecombinationsofmultipleloci.55samplesofnomissingdatawereused
Locus La Cv Ci Ps(%)Locus La Cv Ci Ps(%)
atpB灢rbcL 701 68 47 50 rbcL灢a+rps4 1182 99 63 43
rbcL灢a 566 34 21 43 rbcL灢a+trnH灢psbA 783 60 39 64
Rps4 616 65 42 29 rps4+trnH灢psbA 833 91 60 50
trnH灢psbA 217 26 18 37 atpB灢rbcL+trnH灢psbA+rbcL灢a 1484 128 86 64
Nad5 1131 52 21 7 atpB灢rbcL+trnH灢psbA+rps4 1524 159 107 50
ITS2 460 124 87 57 rbcL灢a+trnH灢psbA+rps4 1399 125 81 64
atpB灢rbcL+rbcL灢a 1268 102 68 57 atpB灢rbcL+rbcL灢a+rps4+trnH灢psbA 2100 193 128 64
atpB灢rbcL+rps4 1318 133 89 57 rps4+atpB灢rbcL+rbcL灢a+trnH灢psbA+nad5 3231 245 149 50
atpB灢rbcL+trnH灢psbA 918 94 65 64
比对长度 信息位点 变异位点 物种作为单系的鉴定成功率
(La); (Ci); (Cv); (Ps)
La:alignedlength;Cv:variablecharacters;Ci:informativecharacters;Ps:percentagesofspeciesresolvedasuniqueclusters
像苔藓植物这样的以单倍体在生活史中占优势的 单向测序
。
大类群 因为杂交不会给测序带来任何困难 在 被广泛的应用在苔藓和蕨类的系统重
, 。 rps4
序列变异较大和拷贝数不太清楚的情况下 这个 建分析中 它可以很好的区别科和属 这个片段
, , 。
片段的缺点之一是比对较难 尽管本次研究只使 的序列中很少有间隙 存在 因此 序列
。 (gap) , ,
用了第二个内含子 但却有 个变异位点和 很容易比对 然而在我们的数据中 和
, 124 。 rps4 rbcL灢
个简约信息位点 而且是本次研究中 个候 的结果却是相互矛盾的 非编码区
87 , 6 a 。 trnH灢psbA
选基因里 使用 和 曾经被提出作为植物 条码的候选基因 并
, “bestmatch暠 “bestclose DNA ,
和 树等检验方法鉴定成功率最高的 且指出它可能是变异位点最多的一个叶绿体片段
match暠 NJ
分别是 和 在对扭叶藓属 等 而且在某些植物类群中鉴别
( 64灡81% 57%)。ITS2 (Kress ,2005),
和异节藓属的鉴定中却是失败的 这可能是因为 效果比较好 等 等
, (Newmadter ,2008;Starr ,
这两个属本身内在生物学原因所致 因为尽管我 尽管如此 在藓类植物中 序
。 2009)。 , trnH灢psbA
们所使用的 个叶绿体基因的鉴定率较 列太短 不是一个理想的候选基因
4 ITS2 (217bp), 。
低 但是它们却能将这两个属区分开 而且将叶 线粒体片段 的变异位点较少 可以考
, , nad5 ,
绿体基因片段和核基因片段 组合也无法将 虑用于科一级的鉴别 虽然以前的研究结果将线
ITS2 。
两属区分开 同样的情况在 等 粒体基因排除在 条码候选基因之外 但是
。 Hedenas (2009) DNA ,
对北美西部的同蒴藓属 的研究 在我们的研究中仍然使用它来检验鉴定物种的效
Homalothecium
以及 等 对猫尾藓属 果 不过数据显示这一片段不适合作 条码
Draper (2007) Isothecium , DNA
的研究中出现过 在 条码中核基因的缺陷 的候选基因
。 DNA 。
可以用质体基因片段来弥补 尽管 不是很 DNA条码的不同组合
。 ITS 3灡4暋
理想 但是由于它的变异较高 在研究 条 由于单个片段的鉴别率较低 我们考虑使用
, , DNA ,
码中 对于理解自然的物种是不可缺少的 因此 不同片段的组合来鉴别并通过 树的方法分析
, , NJ
应该很好地使用它 了各种组合 出乎意料地发现 两个叶绿体片段
。 , ,
atpB灢rbcL是藓类中效果较好的叶绿体片段 组合的鉴别率是最高的 在此基础上增加一个或
3灡3暋 。
单个片段中非编码基因片段 鉴定 者多个片段并没有提高鉴定率 有时反而会降低
atpB灢rbcL ,
成功率最高 其次是 鉴别率 类似的结果在以前的研究中也出现过
(57%), rbcL (43%)。at灢 ,
在以前的研究中没有被考虑作为 等 图
pB灢rbcL DNA (Starr ,2009)( 4)。
条码的候选基因 但是我们的研究结果显示它可
,
能是藓类中比较好的一个潜在的候选基因 但 致谢 在研究过程中吴鹏程教授协助鉴定标本 在此表
, 暋 ,
是 它还需要更多的数据来验证 而且它的长度 示感谢
。
, ,
在藓类中是 到 适合 扩增和
519bp 557bp, PCR
