The Nisin ABC

230 Pages·2014·44.23 MB·English

The Nisin ABC
-
Investigating the maturation
process of the lanthipeptide nisin
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
André Abts
aus
Dormagen
Düsseldorf, November 2013
aus dem Institut für Biochemie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Referent: Prof. Dr. Lutz Schmitt
Korreferent: Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger
Tag der mündlichen Prüfung:
no pain - no game
(Peter Kurowski, Dormagen 2000)

i
Abstract
The antimicrobial lanthipeptide nisin is produced ribosomally as a precursor peptide
by the lactic acid bacteria Lactococcus lactis. The nisin precursor consists of a
N-terminal leader peptide and a C-terminal core peptide. Nisin is active against several
Gram-positive bacteria including human pathogens. The biological activity of nisin
derives from the characteristic post-translational modifications within the core peptide,
which are installed via four essential steps. First, the dehydratase NisB dehydrates
serine and threonine residues. Second, the cyclase NisC forms the (methyl)lanthionine
rings by linking the dehydrated amino acids to C-terminal located cysteine residues via
thioether bridges. In the third maturation step the fully modified precursor peptide is
secreted across the cytoplasmic membrane via the ABC transporter NisT. The fourth
and last step involves the subtilisin-like protease NisP. The N-terminal located leader
peptide is proteolytically cleaved off by NisP to release the activated mature nisin.
In this thesis, the maturation steps of nisin were investigated on a molecular level.
The modification enzymes NisB, NisC and NisP as well as the nisin precursor peptide
and the mature nisin were isolated in order to analyze their interactions in vitro. The
basic principles of gene expression and protein purification are summarized in chapter
one. The activity of nisin is as well directed against its producing host and therefore
L. lactis developed a self-immunity system, which is described in chapter two.
Chapter three, four and five deal with the cytosolic interactions between the
modification enzymes NisB, NisC and the nisin precursor peptide. The interaction of
NisB with the nisin precursor peptides was investigated by surface plasmon resonance.
NisB is specifically interacting with the nisin leader peptide, especially recognizing the
highly conserved -FNLD- box. NisB is able to distinguish between the three different
maturation states of the core peptide (unmodified, dehydrated and modified). The
interactions between the nisin precursor peptide and NisC were determined using
isothermal titration calorimetry. The obtained binding affinities revealed that in
contrast to NisB, NisC is specifically interacting with the leader peptide and cannot
distinguish between the three different maturation states in vitro. Additionally, a
recognition motif -FxLx- within the leader peptide was identified.
Chapter six is dedicated to the serine protease NisP. The in vitro activity of NisP
could be demonstrated by reversed phase high-performance liquid chromatography.
This analysis revealed that NisP cleaves the nisin precursor peptide independently of
its maturation state.
Finally, in chapter seven a complex of NisB, NisC and the nisin precursor peptide was
obtained and characterized. The unmodified precursor peptide initiates the assembly
of the maturation complex with a stoichiometry of 2:1:1 in vitro.

iii
Zusammenfassung
Das ribosomal synthetisierte, antimikrobiell wirksame Lanthipeptid Nisin wird vom
Milchsäure Bakterium Lactococcus lactis in Form einer Vorstufe produziert. Diese
Vorstufe besteht aus einer N-terminalen Erkennungssequenz und einer C-terminalen
Kernsequenz. Nisin wirkt antibakteriell gegen verschiedene Gram-positive Bakterien,
unter ihnen einige humanpathogene Stämme. Die antibakterielle Wirkung beruht
auf den charakteristischen und namensgebenden Lanthioninringen. Die Bildung der
post-translationalen Modifikationen kann in vier Phasen eingeteilt werden. In der
ersten Phase werden die Aminosäurereste Serin und Threonin durch das Enzym
NisB dehydratisiert. Diese werden in der zweiten Phase über Thioetherbrücken
mit C-terminal positionierten Cysteinresten verbunden. Dies hat eine Ringbildung
zur Folge, welche durch die Zyklase NisC katalysiert wird. Anschließend
wird in der dritten Phase das modifizierte Peptid in den extrazellulären Raum
transportiert. DieseSekretionwirddurchdenABC-TransporterNisTkatalysiert. Nach
erfolgreicher Sekretion wird die N-terminale Erkennungssequenz durch die Protease
NisP abgespalten. Diese Spaltung überführt die Vorstufe in das antimikrobiell aktive
Peptid Nisin.
In dieser Dissertation wurden die Interaktionen zwischen den Nisin-Vorstufen und den
Modifikationsenzymen NisB, NisC und NisP auf molekularer Ebene untersucht. Hierzu
wurde die Isolation der Enzyme, des Peptids Nisin und der Nisin-Vorstufen erfolgreich
etabliert und optimiert. Die Grundlagen der Genexpression und Proteinisolation sind
in Kapitel 1 beschrieben.
Das gereifte, aktive Nisin ist ebenfalls gegen den Nisin produzierenden Stamm
antimikrobiell wirksam. L. lactis hat daher einen Mechanismus entwickelt, um sich
gegen sein eigenes Peptid zu schützen. Dieser Mechanismus ist in Kapitel zwei genauer
beschrieben.
Die Kapitel drei, vier und fünf widmen sich der Untersuchung der zytosolischen
Interaktion der Modifikationsenzyme NisB und NisC mit den Nisin-Vorstufen.
Die Interaktion zwischen der Dehydratase NisB und den Nisin-Vorstufen wurde
durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz untersucht. NisB interagiert spezifisch
mit der Erkennungssequenz, in welcher die hoch konservierte -FNLD- Box als
Erkennungsmotividentifiziertwurde. ZusätzlichkannNisBzwischendenverschiedenen
Modifikationszuständen der Nisin-Vorstufen unterscheiden.
Die zweite Stufe der Modifizierung wird durch NisC katalysiert. Die
Interaktionen zwischen NisC und den Nisin-Vorstufen wurden mit Hilfe der
isothermen Titrationskalorimetrie bestimmt. NisC bindet in vitro ausschließlich
die Erkennungssequenz und kann demnach nicht zwischen den Modifikationsstufen
iv
der Kernsequenz unterscheiden. NisC bindet spezifisch die beiden Aminosäurereste
Phenylalanin und Leucin, daraus ergibt sich ein Erkennungsmotiv -FxLx-.
Die Aktivität der Protease NisP konnte erfolgreich in vitro rekonstruiert werden
(Kapitel 6). Durch analytische Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde
die Spaltungsreaktion kinetisch untersucht. NisP proteolysiert die Nisin-Vorstufe
unabhängig des Modifikationszustand der Kernsequenz.
Aufbauend auf diesen Erkenntnissen konnte in Kapitel sieben ein in vitro Komplex
aus den Enzymen NisB, NisC und der Nisin-Vorstufe isoliert und charakterisiert
werden. Die unmodifizierte Vorstufe des Nisins initiiert hierbei die Bildung des
Modifikationskomplexes in einer 2:1:1 Stöchiometrie in vitro.
Contents v
Contents
Abstract i
Zusammenfassung iii
Contents v
List of Figures vii
Abbreviations ix
1 Introduction 1
1.1 Peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Ribosomally-synthesized and post-translationally modified peptides . . 3
1.3 Lanthipeptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3.1 Biological Activity and Application of Lanthipeptides . . . . . . 5
1.3.2 Classification of RiPPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3.2.1 Class I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.2.2 Class II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.2.3 Class III and IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.3 Function of the leader peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.4 Post-translational modifications (PTMs) . . . . . . . . . . . . . 11
1.4 The Nisin System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4.1 NisA - the nisin mature peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.4.2 NisB - the nisin dehydratase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.4.2.1 Dehydration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.4.3 NisC - the nisin cyclase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.4.3.1 Cyclization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.4.4 NisT - the nisin translocase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.4.5 NisP - the nisin protease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.4.6 The Nisin multimeric lanthionine synthetase complex . . . . . . 25
2 Aims 27
3 Publications 29
3.1 Chapter I - Gene Expression & Protein Purification . . . . . . . . . . . 31
3.2 Chapter II - Nisin Gene Cluster and Immunity . . . . . . . . . . . . . . 67
3.3 Chapter III - NisA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.4 Chapter IV - NisB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
vi Contents
3.5 Chapter V - NisC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
3.6 Chapter VI - NisP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
3.7 Chapter VII - The nisin maturation complex NisABC . . . . . . . . . . 145
4 Discussion 171
4.1 The lanthipeptide nisin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
4.2 The nisin maturation machinery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
4.3 The nisin maturation complex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
4.3.1 Membrane association and stoichiometry . . . . . . . . . . . . . 174
4.3.2 Activation upon substrate binding . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
4.3.3 Association of the complex - specific interaction sites between
NisB, NisC and the leader peptide . . . . . . . . . . . . . . . . 177
4.3.4 Directionality of the post-translational modifications introduced
by NisB and NisC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
4.3.5 Proteolytic cleavage of the leader peptide and release of mature
nisin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
4.4 Model for the nisin maturation complex . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
5 Literature 189
6 Curriculum vitae 205
7 Acknowledgment / Danksagung 209
8 Erklärung zur Promotion 213