Tesis Doctoral Alejandro Piñeiro Ugalde

213 Pages·2011·10.05 MB·English

by  Alejandro Piñeiro Ugalde

Universidad de Oviedo
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Identificación de nuevos componentes del
degradoma y estudio de la regulación biológica por
miRNAs en un modelo animal deficiente en la
metaloproteasa Face-1

Tesis Doctoral
Alejandro Piñeiro Ugalde
Oviedo 2011

Director de la Tesis
Carlos López-Otín

ABREVIATURAS, SIGLAS Y SÍMBOLOS

ADAM metaloproteasa y desintegrina
ADAMTS ADAM con dominios trombospondina
cDNA DNA copia
Ci curio
dCTP desoxicitidina trifosfato
DNA ácido desoxirribonucleico
dNTPs desoxinucleósidos trifosfato
GH hormona de crecimiento
HGPS síndrome de Hutchinson-Gilford
IGF-1 factor de crecimiento similar a insulina 1
kb kilobase
MBS sitio de unión de microRNAs
MMP metaloproteasa de matriz
miRNA microRNA
mRNA RNA mensajero
pb pares de bases
PCR reacción en cadena de la polimerasa
RNA ácido ribonucleico
ROS especie reactiva del oxígeno
RISC complejo de silenciamiento inducido por RNA
SSC tampón citrato sódico
TAE tampón Tris/acetato con EDTA
TBE tampón Tris/borato con EDTA
TE tampón Tris con EDTA
TIMP inhibidor tisular de metaloproteasa
Tris tris(hidroximetil)-aminometano

ÍNDICE
Introducción ................................................................................................. 1
Los sistemas proteolíticos .................................................................................................. 4
Metaloproteasas ................................................................................................. 6
Aminopeptidasas ................................................................................................ 9
Metzinquinas ..................................................................................................... 12
Envejecimiento ................................................................................................................. 15
Síndromes progeroides .................................................................................... 19
Laminopatías .................................................................................................... 21
Eje somatotrofo ................................................................................................. 25
microRNAs ....................................................................................................................... 28
Biogénesis y mecanismos de acción de los miRNAs ....................................... 29
Relevancia funcional de los miRNAs ................................................................. 33
Objetivos .................................................................................................... 37
Material y métodos .................................................................................... 41
Material ............................................................................................................................. 43
Técnicas de Biología Molecular ....................................................................................... 45
Técnicas de Biología Celular ........................................................................................... 52
Ensayos en animales de experimentación ...................................................................... 56
Técnicas bioinformáticas .................................................................................................. 57
Resultados .................................................................................................. 59
I. Metaloproteasas y el degradoma .......................................................................... 61
II. Identificación y caracterización de la aminopeptidasa O humana ......................... 91
III. Aminopeptidasa O ............................................................................................... 101
IV. Identificación y caracterización de las arqueometzinquinas 1 y 2 humanas ....... 113
V. Señalización del eje somatotrofo y contribución de los miRNAs a su
regulación en el envejecimiento acelerado .......................................................... 125
VI. Efecto rejuvenecedor de la señalización somatotrofa en el envejecimiento
acelerado ............................................................................................................. 135
VII. Análisis de la función de los miRNAs en el envejecimiento ................................ 143
VIII. Otros trabajos relacionados con la Tesis ............................................................. 163
Discusión ................................................................................................. 165
Conclusiones ........................................................................................... 189
Bibliografía ............................................................................................... 193

INTRODUCCIÓN

Introducción
Los elementos reguladores de la actividad celular son responsables del
desarrollo, la homeostasis, la plasticidad e incluso el envejecimiento de los
organismos y han sido señalados como principal vehículo de la evolución de
las especies. Estos elementos constituyen una proporción considerable del
genoma de los organismos y se encargan de coordinar la información
contenida en el DNA para adaptar el comportamiento celular a las distintas
circunstancias exigidas en el espacio y en el tiempo. Este año se cumple el
cincuenta aniversario del modelo del operón publicado por François Jacob y
Jacques Monod en el que se introducía por primera el concepto de los genes
reguladores y se definía un modelo plausible de control de la expresión génica
(Jacob y Monod, 1961). La elaboración de este modelo se considera uno de los
grandes hitos de la biología molecular de la segunda mitad del siglo XX al
señalar el camino que dio lugar al actual conocimiento sobre los sistemas
reguladores de la expresión génica. Desde entonces, el modelo originalmente
propuesto para bacterias se ha refinado sucesivamente y se han añadido
numerosos niveles adicionales de regulación en organismos eucariotas. Así,
además del control de la expresión génica mediante factores de transcripción
que se unen a secuencias reguladoras situadas en los promotores de los
genes, existen sistemas remodeladores de la cromatina que añaden
información heredable a la secuencia primaria del DNA en un proceso
denominado modificación epigenética (Feinberg, 2007). De igual forma, en las
últimas décadas se han identificado diversos grupos de genes que codifican
importantes elementos reguladores que actúan a nivel post-transcripcional, ya
sea sobre los mRNAs o sobre las proteínas. Entre estos sistemas de regulación
post-transcripcional, las proteasas, al igual que las quinasas o fosfatasas, se
han revelado como un importante grupo de enzimas que, además de participar
en procesos biosintéticos o catabólicos, constituyen un nivel de regulación
adicional al de la expresión génica al controlar numerosas propiedades de las
proteínas (López-Otín y Hunter, 2010). Por último, el comienzo del siglo XXI ha
supuesto una nueva revolución en el campo del control de la actividad génica,
con el descubrimiento de miles de moléculas de RNA reguladoras, entre las
que destacan los microRNAs y los lincRNAs (large intervening non-coding
RNAs) (Lee y col., 1993; Guttman y col., 2009).
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Introducción

La interacción entre todos estos sistemas de regulación da lugar a una
intrincada red de conexiones que permite que un mismo genoma sea capaz de
generar y coordinar la notable variedad de tipos celulares especializados que
conforman un organismo vivo, así como adaptar sus funciones a las distintas
condiciones que se puedan presentar. Dada su importancia vital, en la presente
Tesis Doctoral abordaremos el estudio de los sistemas de regulación biológica
mediante una serie de objetivos dirigidos a la identificación de nuevas
proteasas y al análisis de la función reguladora de los microRNAs en procesos
de envejecimiento normal y patológico.
Los Sistemas Proteolíticos
Las proteasas constituyen un grupo de enzimas presente en todos los
seres vivos, desde virus hasta mamíferos. La característica común de este
conjunto de enzimas es la hidrólisis del enlace peptídico, un proceso
históricamente asociado a la degradación inespecífica de proteínas, pero que
en los últimos años se ha revelado como un evento clave en la regulación de
múltiples procesos biológicos. Así, hoy sabemos que la proteólisis constituye
un sistema altamente selectivo de modificación post-traduccional que
condiciona numerosas propiedades de las proteínas, ofreciendo un amplio
abanico de posibilidades de regulación. Este tipo de hidrólisis específica de
determinados enlaces peptídicos de proteínas concretas se denomina
procesamiento proteolítico y su impacto sobre las proteínas es muy diverso,
permitiendo modular características tales como su localización subcelular, su
estado de actividad, su interacción con otras proteínas o su vida media, entre
otras (López-Otín y Overall, 2002). Consecuentemente, las proteasas influyen
decisivamente en procesos tan importantes como la replicación del DNA, el
control del ciclo celular, la proliferación y migración celulares, la diferenciación
celular o la muerte celular programada. Asimismo, la proteólisis afecta a
numerosas funciones del organismo, como la morfogénesis y remodelación
tisulares, la cicatrización de tejidos, la ovulación y fertilización, la angiogénesis,
la hemostasis o la inmunidad (López-Otín y Bond, 2008).
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