Table Of ContentUniversidad
de
Valladolid
Facultad
de
Medicina
Dpto.
de
Bioquímica
y
Biología
Molecular
y
Fisiología
Análisis
del
papel
de
β2-quimerina
en
cáncer
de
mama
TESIS
DOCTORAL
Presentada
por
Victoria
Casado
Medrano
para
optar
al
grado
de
Doctora
por
la
Universidad
de
Valladolid
Directora:
Dra.
María
José
Caloca
Roldán
INSTITUTO DE BIOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR
La
Dra.
María
José
Caloca
Roldán,
Científico
Titular
del
Consejo
Superior
de
Investigaciones
Científicas
en
el
Instituto
de
Biología
y
Genética
Molecular
de
Valladolid
CERTIFICA:
Que
el
trabajo
titulado
“Análisis
del
papel
de
β2-‐quimerina
en
cáncer
de
mama”
presentado
por
Dña.
Victoria
Casado
Medrano,
licenciada
en
Biotecnología
por
la
Universidad
de
León,
ha
sido
realizado
bajo
mi
dirección
en
el
Instituto
de
Biología
y
Genética
Molecular
de
Valladolid
y
reúne
a
mi
juicio
originalidad
y
contenidos
suficientes
para
que
sea
presentado
ante
el
tribunal
correspondiente
y
pueda
optar
al
grado
de
Doctor
por
la
Universidad
de
Valladolid.
Y
para
que
así
conste,
y
a
los
efectos
oportunos,
expido
el
presente
certificado
en
Valladolid,
a
30
de
julio
de
2014.
Fdo.
María
José
Caloca
Roldán
Este
proyecto
de
tesis
ha
sido
financiado
por:
- El
Ministerio
de
Ciencia
e
Innovación
(BFU2009-‐08051)
- La
Junta
de
Castilla
y
León.
Consejería
de
Sanidad
(BIO103/VA44/11)
- Una
beca
EMBO
(Short
Term
Fellowship)
para
estancias
internacionales.
A
Arturo
‘El
éxito
es
la
habilidad
de
ir
de
fracaso
en
fracaso
sin
perder
el
entusiasmo’
Winston
Churchill
INDÍCE
GENERAL
Índice
General...............................................................................................................1
Abreviaturas..................................................................................................................5
Resumen
(Summary).....................................................................................................9
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................13
1.
Cáncer
de
mama............................................................................................................15
1.1
Epidemiología
y
factores
de
riesgo..........................................................................15
1.2
Morfología
y
desarrollo
de
la
glándula
mamaria.....................................................16
1.2.1
Anatomía
comparada
de
la
mama
normal...................................................17
1.2.2
Desarrollo
de
la
glándula
mamaria...............................................................18
1.3
Tipos
de
lesiones
neoplásicas
y
clasificación
del
cáncer
de
mama..........................18
1.3.1
Clasificación
histopatológica
del
cáncer
de
mama.......................................18
1.3.2
Clasificación
del
cáncer
de
mama
según
el
perfil
de
expresión
génica........19
1.4
Cáncer
de
mama
HER2/ErbB2
positivo....................................................................21
1.4.1
Modelos
animales
de
cáncer
de
mama
HER2
positivo:
ratones
MMTV-‐Neu22
2.
Rho
GTPasas..................................................................................................................23
2.1
Regulación
de
las
Rho
GTPasas................................................................................24
2.2
Funciones
de
las
Rho
GTPasas.................................................................................26
2.2.1
Regulación
del
citoesqueleto........................................................................26
2.2.2
Regulación
de
la
expresión
génica,
ciclo
celular
y
supervivencia.................29
2.3
Rho
GTPasas
y
cáncer
de
mama..............................................................................30
3.
Las
GTPasas
Rac.............................................................................................................31
3.1
Regulación
de
Rac....................................................................................................32
3.2
Funciones
celulares
de
Rac......................................................................................33
3.2.1
Función
de
Rac
en
la
reorganización
del
citoesqueleto
de
actina................34
3.2.1.1
Formación
de
lamelipodios.........................................................................34
3.2.2
Función
de
Rac
en
la
adhesión
celular..........................................................36
3.2.3
Función
de
Rac
en
la
progresión
del
ciclo
celular.........................................37
3.2.4
Función
de
Rac
en
la
supervivencia
celular..................................................37
3.2.5
Otras
funciones
de
Rac.................................................................................38
3.2.5.1
Regulación
de
actividades
enzimáticas.....................................................38
3.2.5.2
Regulación
del
transporte
de
glucosa........................................................38
3.3
Papel
de
Rac
en
el
desarrollo
y
progreso
tumoral...................................................39
3.3.1
Papel
de
Rac
en
la
transformación
maligna..................................................39
3.3.2
Papel
de
Rac
en
invasión
y
metástasis..........................................................39
3.3.3
Papel
de
Rac
en
la
angiogénesis...................................................................40
3.4
Alteraciones
de
la
actividad
de
Rac
en
cáncer
de
mama.........................................41
3.4.1
Alteraciones
de
Rac......................................................................................41
3.4.2
Alteraciones
de
RacGEFs
y
RacGAPs.............................................................42
1
Índice
4.
Quimerinas.....................................................................................................................43
4.1
Genes
de
las
quimerinas..........................................................................................43
4.2
Estructura
y
propiedades
bioquímicas.....................................................................44
4.2.1
Dominio
C1....................................................................................................44
4.2.2
Dominio
GAP.................................................................................................45
4.2.3
Dominio
SH2.................................................................................................46
4.3
Estructura
tridimensional
y
modelo
de
regulación..................................................46
4.4
Rutas
de
señalización
reguladas
por
las
quimerinas................................................48
4.4.1
Quimerinas
como
efectores
de
receptores
tirosina
quinasa
y
GPCR............48
4.4.2
Interacción
con
otras
proteínas....................................................................48
4.5
Funciones
biológicas
de
los
miembros
de
la
familia
de
las
quimerinas...................49
4.5.1
Funciones
de
las
quimerinas
en
el
sistema
nervioso....................................49
4.5.2
Funciones
de
las
quimerinas
en
el
sistema
inmune......................................50
4.5.3
Funciones
de
las
quimerinas
en
el
desarrollo...............................................50
4.6
Enfermedades
asociadas
con
las
alteraciones
de
las
quimerinas............................50
4.6.1
b2-‐quimerina
y
cáncer
de
mama..................................................................51
HIPÓTESIS
Y
OBJETIVOS...........................................................................................................53
MATERIALES
Y
MÉTODOS.........................................................................................................57
1.
Modelos
murinos...........................................................................................................59
1.1
Ratones
Knockout
para
β2-‐quimerina
(ratones
chn2-‐/-‐)..........................................59
1.2
Ratones
ErbB2/Neu..................................................................................................59
1.3
Generación
de
ratones
MMTV-‐ErnB2/Neu
deficientes
en
β2-‐quimerina................59
2.
Genotipado
de
los
animales
utilizados
en
el
estudio.....................................................60
2.1
Extracción
de
ADN
genómico...................................................................................60
2.2
Identificación
de
animales
transgénicos
MMTV-‐ErbB2/Neu...................................60
2.3
Identificación
de
animales
deficientes
en
b2-‐quimerina.........................................61
3.
Evaluación
de
la
aparición
y
desarrollo
de
tumores
de
mama
en
los
modelos
murinos63
4.
Sacrificio
de
los
animales
y
recogida
de
muestras.........................................................63
5.
Estudios
histológicos......................................................................................................64
5.1
Inclusión
de
los
tejidos
en
parafina.........................................................................64
5.2
Tinción
con
hematoxilina-‐eosina.............................................................................65
5.3
Evaluación
histopatológica......................................................................................66
5.4
Cuantificación
de
focos
metastásicos
en
pulmón....................................................66
5.5
Inmunohistoquímica................................................................................................67
5.6
Detección
y
cuantificación
de
lesiones
preneoplásicas
mediante
tinción
con
alumbre
carmín..............................................................................................................67
6.
Líneas
celulares
y
condiciones
de
cultivo.......................................................................68
7.
Generación
de
líneas
celulares
estables........................................................................69
7.1
Plásmidos.................................................................................................................69
7.2
Transfecciones.........................................................................................................70
7.3
Selección
de
las
poblaciones
control
y
β2-‐quimerina..............................................70
7.4
Purificación
de
subpoblaciones
mediante
citometría
de
flujo.................................71
8.
Análisis
de
expresión
proteica.......................................................................................71
2
Description:Análisis del papel de β2-quimerina en cáncer de mama unas interacciones estéricas y electrostáticas desfavorables para la unión con. Cdc42 y
