Terminaison de la traduction et translecture chez Saccharomces cerevisiae

292 Pages·2017·2.29 MB·French

by  Olivier Namy

THESE de DOCTORAT de l'UNIVERSITE PARIS 6
Spécialité :
Microbiologie

Présentée par
Olivier NAMY

Pour obtenir le grade de DOCTEUR de L'UNIVERSITE PARIS 6

Terminaison de la traduction et translecture
chez Saccharomyces cerevisiae.

Soutenue le 25 juin 2001 devant le jury composé de :

Mr Pierre Netter Président
Mr Richard Buckingham Rapporteur
Mr Michel Philippe Rapporteur
Mme Marguerite Picard Examinatrice
Mr Jean-Pierre Rousset Directeur de thèse
A Mme Palou
A mes parents et grands-parents
A Stéphanie et Chloé

" Chacun à le droit à sa part d'irrationnel"

" Il n'est pas nécessaire d'espérer pour entreprendre, ni de
réussir pour persévérer "
Liste des abréviations -3-
5S, 16S, 18S, 23S, 25S Vitesse de sédimentation des ARNr
30S, 40S, 50S, 60S, 80S Vitesse de sédimentation des sous-unités ribosomiques
A, T, U, C, G, Adénine, Thymine, Uracile, Cytosine, Guanosine
ADN Acide désoxyribonucléique
AMPc Adénosine monophosphate cyclique
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager
ARNr Acide ribonucléique ribonucléique
ARNt Acide ribonucléique de transfert
ATP Adénosine triphosphate
B. subtilis Bacillus subtilis
D. melanogastere Drosophila melanogastere
E. coli Escherichia coli
eEF Facteurs d'élongation eucaryote
eIF Facteur d'initiation eucaryote
EF Facteurs d'élongation procaryote
eRF Facteurs de terminaison de la traduction
GDP Guanosine diphosphate
GFP "Green fluorescent protein"
GTP Guanosine triphosphate
H. sapiens Homo sapiens
IF Facteur d'initiation procaryote
kb Kilopaires de base
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
nt Nucléotide
ORF Phase ouverte de lecture
PCR Amplification en chaîne par polymérase
RF Facteur de terminaison procaryote
RRF Facteur de relargage du ribosome procaryote
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
Sites A, P, E Sites Aminoacyl-ARNt, Peptidyl-ARNt, Exit
snoARN Petits ARN nucléaires
SORF Phase semi-ouverte de lecture
X-gal 5-bromo-4-chloro-3 indol β-D-galactosidase

Le code génétique
UUU Phé UCU Ser UAU Tyr UGU Cys
UUC Phé UCC Ser UAC Tyr UGC Cys
UUA Leu UCA Ser UAA STOP UGA STOP
UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Trp
CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg
CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg
CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg
AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg
AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly
Remerciements -4-
Je souhaite en premier lieu remercier Jean-Pierre Rousset
de m'avoir accueilli dans son laboratoire. Merci pour la
liberté et la confiance qu'il a su m'accorder tout au long de
ces années. Je voudrais aussi le remercier de m'avoir laissé
développer tous les aspects passionnants de ce travail. Je
pense que je n'aurais pas pu trouver un meilleur environnement
pour ma thèse. Je le remercie enfin de m'avoir appris de
nombreuses expressions qui resteront à jamais dans la mémoire
collective du laboratoire, il est dommage que je ne puisse en
siter quelques unes !

Je remercie également Marguerite Picard, Richard
Buckingham, Pierre Netter et Michel Philippe qui m'ont fait
l'honneur de juger ce travail.

Je voudrais ensuite remercier Laure Bidou qui m'accompage
depuis mes premiers pas au laboratoire il y a déjà 6 ans. "Ma
p'tite laure", voici la fin d 'une époque, fini les masques
volants, le GDS, les concombres fous et autres GMT files. Je te
remercie pour toute la bonne humeur que tu as pu m'apporter.
Ton amitié est un cadeau précieux, auquel je tiens énormément.
Nos longues discussions tard le soir vont me manquer. J'espère
que nous arriverons à garder contact, malgré l'éloignement
géographique.
Je remercie aussi très chaleureusement Isabelle Hatin.
Cela n'a pas du être facile tous les jours d'être ma voisine de
bureau, visiblement tu as tenu bon. Merci Isa pour tout ce que
tu as fait pour moi. Tu as toujours su être disponible, prête à
rendre service, à dépanner. Je te remercie pour la joie et
l'enthousiasme dont tu as fait preuve. Merci pour les
nombreuses discussions que nous avons eu, merci aussi pour tes
conseils toujours pleins de bon sens. Merci aussi pour ton aide
dans la rédaction de ce manuscrit. Vive les soirées "ping-pong"
et les après-midi tennis....Au fil du temps tu es devenue
beaucoup plus qu'une collègue, une véritable amie, et c'est
sans aucun doute une des principales réussite de ma thèse !
Je tiens à dire un immense merci à Maryse Godon (alias la
tornade blanche). Depuis ton arrivée au labo, celui-ci a bien
changé et tu y es pour beaucoup!!! Cela n'a pas dû être facile
de t'acclimater à ce nouvel environnement, mais tu y es arrivée
avec succès et je t'en félicite. Ton aide tout au long de ces
années a été précieuse. Toi aussi tu participes largement à
l'ambiance exceptionnelle qui règne dans le laboratoire. Merci
pour tout Maryse.
Michaël, nous ne nous sommes cotoyés que peu de temps au
laboratoire, mais suffisament pour garder en mémoire quelques
moments inoubliables. Notament durant ce voyage à Bruxelles,
dont l'arrêt de tram "fraises" restera un grand moment !!! Je
te souhaite bonne chance, le prochain sur la liste c'est toi
!...

Je tiens à remercier Guillaume Stahl, qui m'a aidé à
démarrer ce sujet. Je suis heureux que nous ayons pu garder
contact malgré les milliers de kilomètres qui nous séparent.
J'espère que nos "grandes" conversations scientifiques pourront
continuer.
J'aimerais remercier tous ceux que j'ai cotoyé au cours de
ces années et qui m'ont aidé de près ou de loin dans la
Remerciements -5-
réalisation de ce travail. Ce serait trop long de tous vous
citer. J'aimerais tout de même dire un grand merci en
particulier à Georges Renault (ainsi qu'à toute l'équipe de
Michel Jacquet) pour ses conseils et son aide dans les
expériences "AMPc". Merci aussi à Murielle Decraene dont
l'efficacité n'est plus à démontrer, merci aussi pour ta
disponibilité et ta gentillesse Mumu. J'aimerais en profiter
pour remercier toute l'équipe enseignante de l'Université 7.
Vous m'avez fait découvrir l'enseignement dans des conditions
idéales et je vous en remercie. Merci en particulier à Anne
Plessis, Claude Bazin et Claudie Isnard pour leur confiance,
leur gentillesse et leur disponibilité.

Je remercie aussi tous les membres de ma famille, qui ont
régulièrement pris des nouvelles de mes expériences, même si
celles-ci doivent leur sembler légèrement obscures....
Rassurez-vous ça a fini par bien pousser! Patpat, il semble que
tu te diriges dans une voie similaire, je te souhaite bon
courage, tu verras c'est fatiguant, mal payé, mais cela en vaut
la peine !
Merci aussi à tous mes amis et principalement, Yannick,
Fabien, et Marianne pour les bonnes soirées, ou nos réunions
"informelles". J'ai aussi une pensée particulière pour toi
Martine, qui a toujours su être à mon écoute, prête à m'aider,
disponible. Ta présence a beaucoup comptée durant toutes ces
années.

Je ne pouvais terminer ces remerciements sans penser à toi
ma puce. Durant toutes ces années tu as subi et accepté (sans
trop protester) mes horaires ainsi que tous les week-end passés
au labo. Merci pour ton soutien quotidien, pour tes
encouragements, ta compréhension et ton aide. Tu m'as apporté
l'équilibre indispensable à la réussite de ces 4 années de
thèse. Heureusement que tu étais là ! Ces quelques lignes ne
pourront certainement pas refléter à quel point je te suis
reconnaissant. Je suis heureux de partager cette thèse avec
toi! Enfin merci de m'avoir donné cet adorable petit ange qui
depuis plusieurs mois illumine notre vie. Je t'Aime ma chérie.
Table des matières -6-
ABREVIATIONS.....................................................................................................................3
REMERCIEMENTS................................................................................................................4
TABLE DES MATIERES.......................................................................................................6
INTRODUCTION....................................................................................................................9
1. DONNEES RECENTES SUR L'INITIATION ET L'ELONGATION DE LA
TRADUCTION.......................................................................................................................13
1.1. L'INITIATION DE LA TRADUCTION EUCARYOTE..........................................................13
1.1.1. Facteurs cis et trans.........................................................................................14
1.1.2. Les protéines impliquées dans l’initiation.......................................................14
1.1.2.1. Le complexe d’initiation eIF4F................................................................14
1.1.2.2. Les autres facteurs protéiques..................................................................16
1.1.3. Mécanismes d'initiation....................................................................................16
1.1.3.1. A la recherche du codon initiateur...........................................................16
1.1.3.2. Reconnaissance du codon AUG...............................................................19
1.2. L'ELONGATION DE LA TRADUCTION...........................................................................20
1.2.1. Les mécanismes de l'élongation.......................................................................20
1.2.1.1. Les facteurs d'élongation..........................................................................21
1.2.1.2. Rôle et importance des ARNt...................................................................24
1.2.2. Composition du ribosome.................................................................................27
1.2.2.1. Transcription et organisation des ARNr...................................................27
1.2.2.2. Modification des ARNr, rôle des snoRNA..............................................28
1.2.3. Données structurales, rôle des ARNr...............................................................29
1.2.4. Rôle et fonction des ARNr................................................................................32
1.2.4.1. Expériences de protection ou de mutagenèse...........................................32
1.2.4.2. Les ARNr et les antibiotiques..................................................................35
2. LA TERMINAISON DE LA TRADUCTION ET LE RECYCLAGE DES
RIBOSOMES..........................................................................................................................38
2.1. UTILISATION DES CODONS STOP ET INFLUENCE DU CONTEXTE NUCLEOTIDIQUE DANS
L’EFFICACITE DE TERMINAISON DE LA TRADUCTION..............................................................38
2.1.1. Biais d'utilisation des codons stop...................................................................39
2.1.2. Influence du contexte nucléotidique sur l'efficacité de terminaison de la
traduction.........................................................................................................................41
2.1.2.1. Le contexte situé en 5' du codon stop.......................................................41
2.1.2.2. Le contexte situé en 3' du codon stop.......................................................43
2.2. LES FACTEURS DE TERMINAISON...............................................................................48
2.2.1. Fonction et structure du facteur eRF1.............................................................50
2.2.2. Le facteur eRF3 et la terminaison de la traduction.........................................52
2.3. MECANISMES DE RECONNAISSANCE DU CODON STOP................................................55
2.4. IMPLICATION DES PROTEINES "ACCESSOIRES" DANS LA TERMINAISON DE LA
TRADUCTION.........................................................................................................................58
2.4.1. Les protéines interagissant avec les facteurs de terminaison..........................58
2.4.1.1. Liaison entre deux sous-unités de PP2A et le facteur eRF1....................59
2.4.1.2. Facteurs interagissant avec eRF3 par crible double hybride....................60
2.4.1.3. Pabp1 et le facteur eRF3..........................................................................60
2.4.1.4. Interactions entre les ARN hélicases et les facteurs de terminaison........61
Table des matières -7-
2.4.2. Les protéines dont les altérations ne sont révélées qu'en contexte de faible
efficacité de terminaison de la traduction........................................................................65
3. LES ERREURS "SPONTANEES" OU "PROGRAMMEES".................................67
3.1. LES ERREURS "SPONTANEES" DE LA TRADUCTION, MECANISMES DE SURVEILLANCE.67
3.2. LES ERREURS PROGRAMMEES : LE RECODAGE..........................................................70
3.2.1. Le "hopping" ou saut de ribosome...................................................................70
3.2.2. Le "frameshifting" ou décalage du cadre de lecture........................................73
3.2.2.1. Le "frameshift" en +1...............................................................................73
3.2.2.2. Le "frameshift" –1....................................................................................80
3.2.3. La translecture d'un codon stop.......................................................................84
3.2.3.1. Redéfinition du codon stop en sélénocystéine.........................................85
3.2.3.2. Les autres cas de translecture...................................................................88
3.3. LES FACTEURS INFLUENÇANT L'EFFICACITE DE RECODAGE.......................................92
4. CONCLUSION ET PROJET........................................................................................96
RESULTATS........................................................................................................................100
ARTICLE N°1......................................................................................................................101
1. RESUME DE L'ARTICLE 1 :....................................................................................102
ARTICLE N°2......................................................................................................................131
2. RESUME DE L'ARTICLE 2 :....................................................................................132
3. CARACTERISATION DU MECANISME DE PASSAGE DES CODONS STOP151
3.1. MISE EN EVIDENCE D'UN AUTRE MECANISME DE PASSAGE DES CODONS STOP.........151
3.1.1. Les gènes soumis à un mécanisme de translecture........................................153
3.1.1.1. Etude du gène RTG4..............................................................................153
3.1.1.2. Etude du gène IMP3...............................................................................156
3.1.2. Dans les cas où le mécanisme est indépendant du facteur [PSI]...................161
3.2. LES EVENEMENTS ALTERNATIFS AU RECODAGE......................................................162
3.2.1. Le cas particulier des SORF possédant un codon AUG en début d'ORF2....162
3.2.2. Le codon AUG permet bien une initiation traductionelle de l'ORF2............164
3.3. CONCLUSION...........................................................................................................166
ARTICLE N°3......................................................................................................................167
4. RESUME DE L'ARTICLE 3 :....................................................................................168
ARTICLE N°4......................................................................................................................186
5. RESUME DE L'ARTICLE 4 :....................................................................................187
6. LES MODIFICATIONS POST-TRANSCRIPTIONELLES DES ARN ET LEUR
ROLE DANS L'EFFICACITE DE TRANSLECTURE...................................................209
6.1. MODIFICATIONS DES ARNT....................................................................................209
6.2. MODIFICATIONS DES ARNR....................................................................................211
6.2.1. L'absence des 2'-O-ribose methylations affecte spécifiquement l'efficacité de
translecture des codons stop UAA et UAG....................................................................213
Table des matières -8-
6.2.2. L'expression d'au moins deux snoARN est nécessaire pour retrouver une
efficacité de translecture sauvage..................................................................................215
CONCLUSION, DISCUSSION ET PERSPECTIVES.....................................................218
1. CONCLUSION & DISCUSSION...............................................................................219
1.1. EXISTE T'IL DES GENES REGULES PAR TRANSLECTURE CHEZ S. CEREVISIAE ?..........220
1.2. COMMENT LE CONTEXTE 3' INFLUENCE T'IL L'EFFICACITE DE TRANSLECTURE ?......226
1.3. EXISTE T'IL D'AUTRES FACTEURS TRANS IMPLIQUES DANS LA TERMINAISON DE LA
TRADUCTION ?.....................................................................................................................229
1.4. QUEL ROLE JOUENT LES MODIFICATIONS POST-TRANSCRIPTIONNELLES DES ARNR
DANS LE RECODAGE ?..........................................................................................................233
2. PERSPECTIVES..........................................................................................................235
2.1.1. Perspectives immédiates................................................................................235
2.1.2. Perspectives à long terme..............................................................................238
MATERIELS ET METHODES.........................................................................................240
1. SOUCHES UTILISEES...............................................................................................241
2. LES PLASMIDES........................................................................................................241
3. MILIEUX DE CULTURE ET TRANSFORMATION D'ADN...............................242
3.1. ESCHERICHIA COLI..................................................................................................242
3.1.1. Milieu de culture............................................................................................242
3.1.2. Transformation...............................................................................................243
3.2. SACCHAROMYCES CEREVISIAE................................................................................243
3.2.1. Milieux de culture...........................................................................................243
3.2.2. Transformation...............................................................................................244
4. TECHNIQUES GENERALES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE........................244
4.1. REACTION D'AMPLIFICATION EN CHAINE (PCR)......................................................244
4.1.1. Conditions générales......................................................................................244
4.1.2. Les amorces utilisées......................................................................................245
4.2. CONSTRUCTION DES PLASMIDES..............................................................................245
4.3. SEQUENÇAGE..........................................................................................................246
4.4. MUTAGENESE DIRIGEE............................................................................................246
4.5. MANUPILATION DES ARN TOTAUX.........................................................................247
4.5.1. Extraction des ARN totaux et RT-PCR...........................................................247
4.5.2. Visualisation des ARN par northern-blot.......................................................247
5. DOSAGE DES ACTIVITES β-GALACTOSIDASE ET LUCIFERASE...............248
5.1. DOSAGE DE L'ACTIVITE β-GALACTOSIDASE.............................................................248
5.2. DOSAGE DE L'ACTIVITE LUCIFERASE.......................................................................249
ANNEXE 1............................................................................................................................250
ANNEXE 2............................................................................................................................244
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...........................................................................246
Le démarrage et l'élongation de la traduction- -
9
INTRODUCTION
La traduction est l'étape qui permet à la cellule d'obtenir des chaînes polypeptidiques à
partir des ARN messagers (ARNm): les protéines. C'est l'étape de l'expression génique la plus
coûteuse en énergie, puisque dans le cas de la bactérie Escherichia coli, en phase
exponentielle de croissance, 60% de l'énergie cellulaire totale est investie dans ce processus.
La machinerie permettant l'enchaînement des acides aminés est très complexe, et fait
intervenir de nombreux facteurs aussi bien protéiques que nucléiques. Chez les eucaryotes le
ribosome est composé d'environ 80 protéines et de 4 ARN ribosomiques (ARNr). Les ARNr
5S, 28S, 5,8S font partie de la grande unité 60S, ainsi qu'environ une cinquantaine de
protéines. L'ARNr 18S est le seul composant nucléique de la petite sous-unité 40S qui compte
environ une trentaine de protéines. Lorsque ces deux particules sont assemblées et forment un
ribosome fonctionnel (80S), trois sites permettent l'allongement de la chaîne polypeptidique :
Le site A (pour Aminoacyl-ARNt), le site P (pour Peptidyl-ARNt) et le site E (pour Exit).
Lors de l'élongation, les ARN de transfert (ARNt) passent successivement par chacun de ces
trois sites. Ces ARNt ont une structure secondaire tout à fait particulière, qui leur permet
d'une part de s'apparier avec les codons présents sur l'ARNm grâce à l'anticodon, et d'autre
part d'être reconnus par des enzymes pour être spécifiquement chargés d'un acide aminé en
fonction du codon reconnu. Ces molécules jouent un rôle essentiel dans la traduction,
puisqu'elles permettent la conversion du message nucléotidique sous forme de protéine.

La traduction se divise en quatre grandes étapes :
1/ L'initiation : durant cette première étape les composants du ribosome sont assemblés au
niveau de signaux spécifiques présents sur l'ARNm afin de pouvoir démarrer la synthèse
protéique au premier codon initiateur (AUG) rencontré.
Le démarrage et l'élongation de la traduction- -
10
2/ L'élongation correspond à l'incorporation successive des acides aminés. Le facteur
d'élongation EF-1A (équivalent du facteur EF-Tu procaryote) est essentiel pour sélectionner
l'ARNt correspondant au codon situé au site A. Ce facteur associé à l'ARNt permet l'entrée
des ARNt chargés dans le site A du ribosome. Au cours de l'élongation l'ARNt va passer
successivement du site A au site P, puis au site E, avant d'être éjecté du ribosome.
3/ La terminaison : ici se termine l'enchaînement des acides aminés. Elle se produit lorsque le
ribosome rencontre un des trois codons stop (UAA, UAG, UGA) porté par l'ARNm. L'arrêt de
la synthèse protéique n'est pas un phénomène passif dû uniquement à une absence d'ARNt
capable de reconnaître le codon stop. Cette étape est consommatrice d'énergie et fait
intervenir plusieurs facteurs protéiques externes au ribosome (les facteurs de terminaison) qui
sont essentiels pour provoquer l'arrêt et la dissociation du complexe traductionnel.
4/ Le recyclage : cette étape demeure la moins bien comprise, notamment chez les eucaryotes.
Il semble qu'elle se déroule conjointement, ou immédiatement après l'étape de terminaison.
Elle est essentielle, puisqu'elle permet le recyclage des composants de l'appareil traductionnel
pour un nouveau cycle d'élongation.
Au cours de chacune de ces étapes, des erreurs peuvent se produire et ainsi
compromettre la fonction des protéines synthétisées. De nombreux mécanismes existent,
notamment au cours de l'élongation, pour éviter ces erreurs, c'est ce que l'on appelle le
"proofreading". Cependant, dans certains cas ces erreurs sont nécessaires pour l'expression
correcte de la protéine. Ainsi localement sur l'ARNm et de manière transitoire les règles
conventionnelles de lecture du code génétique sont modifiées. On parle alors de recodage de
l'information génétique. Nous verrons que ces événements peuvent être utilisés comme moyen
de réguler spécifiquement la synthèse d'une protéine et que ce sont des outils pour étudier le
fonctionnement du ribosome.