Table Of ContentT.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TANK PROTEİNİNİN SİNYAL İLETİMİNDEKİ
FONKSİYONEL ANALİZİ
TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI PROGRAMI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Ayşegül DALMIZRAK
DANIŞMAN
Yrd. Doç. Dr. Buket KOSOVA
Prof. Dr. M. Lienhard SCHMITZ
İZMİR
2008
T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TANK PROTEİNİNİN SİNYAL İLETİMİNDEKİ
FONKSİYONEL ANALİZİ
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Programı
Yüksek Lisans Tezi
Ayşegül DALMIZRAK
DANIŞMAN
Yrd. Doç. Dr. Buket KOSOVA
Prof. Dr. M. Lienhard SCHMITZ
İZMİR
2008
DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ
Başkan (Danışman) : Yrd. Doç. Dr. Buket KOSOVA
Üye : Yrd. Doç. Dr. Zuhal EROĞLU
Üye : Doç. Dr. Metiner TOSUN
Yüksek Lisans Tezinin Kabul Edildiği Tarih:………………
ÖNSÖZ
Yüksek lisans eğitimim ve tez çalışmam süresince desteğini hiçbir
zaman esirgemeyen, her zaman yanımda olan, bilgi ve deneyimlerini
benimle paylaşarak bana destek olan tez danışmanım Sayın Yrd. Doç. Dr.
Buket KOSOVA’ ya,
Yüksek lisans eğitimin süresince desteğini hep yanımda hissettiğim
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Nejat TOPÇUOĞLU’ na,
Anabilim Dalımızın diğer değerli öğretim üyeleri, Sayın Yrd. Doç. Dr.
Zuhal EROĞLU’ na ve Sayın Doç. Dr. Cumhur GÜNDÜZ’ e,
Yüksek lisans eğitimim süresince birlikte çalıştığım, bilgi ve
deneyimlerini benimle paylaşan, Sayın Ar. Gör. Nur SELVİ ve Sayın Ar. Gör.
Burçin TEZCANLI’ ya,
Anabilim dalımızın diğer tüm çalışanlarına,
Almanya Justus Liebig Üniversitesi Biyokimya Enstitüsü Schmitz
grubunda tez çalışması amacıyla bulunduğum süre içerisinde desteğini hiçbir
zaman esirgemeyen ve her zaman yanımda olan Sayın Prof. Dr. Lienhard
SCHMITZ’ e,
Bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşarak bana destek olan çalışma
arkadaşım Sayın Florian Renner’ e,
Schmitz grubu çalışanlarına,
I
Her zaman yanımda olduklarını bildiğim, desteklerini hiçbir zaman
esirgemeyen Ailem’ e,
TEŞEKKÜR EDİYORUM.
İZMİR 2008 Ayşegül DALMIZRAK
II
İÇİNDEKİLER
1. BÖLÜM
1.1. GİRİŞ VE AMAÇ .....................................................................1
1.2. GENEL BİLGİLER .................................................................4
1.2.1.NÜKLEER FAKTÖR KAPPA B TRANSKRİPSİYON
FAKTÖRÜ AİLESİNİN GENEL ÖZELLİKLERİ ...............4
1.2.1.1. NF- κB Transkripsiyon Faktörü Ailesi .................10
1.2.2. İNHİBİTÖR κB PROTEİNLERİ ......................................13
1.2.3. IκB KİNAZLAR ..............................................................14
1.2.3.1. IKK Benzeri Kinazlar .........................................21
1.2.4.TÜMÖR NEKROZ FAKTÖR RESEPTÖRÜ
İLE İLİŞKİLİ FAKTÖRLER ............................................22
1.2.5. TANK GENİ VE PROTEİNİ ...........................................24
1.2.6. NF- κB İLE İLİŞKİLİ HASTALIKLAR ..............................26
1.2.6.1. NF- κB’ nin Kanser İle İlişkisi ............................27
1.2.6.2. NF- κB’ nin Genetik Hastalıklar İle İlişkisi .........29
1.2.6.2.1. Incontinentia Pigmenti ......................30
1.2.6.2.2. Anhidrotik Ektodermal Displazi
İle Birlikte İmmün Yetmezlik ..............31
1.2.6.2.3. Familial Cylindromatosis Ve
Multiple Familial Trichoepithelioma ....32
1.2.7. NF- κB SİNYAL YOLAĞI İNHİBİTÖRLERİ ....................33
1.2.8. PROTEİNLERİN POST- TRANSLASYONEL
MODİFİKASYONLARI ...................................................38
1.2.8.1. Fosforilasyon Ve NF- κB İle İlişkisi ...................39
1.2.8.2. Ubiquitinasyon Ve NF- κB İle İlişkisi .................40
1.2.8.3. Küçük Ubiquitin İle İlişkili Değiştiriciler Ve
NF- κB İle İlişkisi ..............................................42
2. BÖLÜM
2.1. GEREÇ VE YÖNTEM .............................................................45
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler .......................................45
2.1.2. Kullanılan Sarf Malzemeler ............................................47
2.1.3. Kullanılan Cihazlar .........................................................48
2.1.4. Enzimler ........................................................................50
2.1.5. Besiyerleri Ve Petri Kapları ............................................50
2.1.6. Tampon Ve Çözeltiler ....................................................51
2.1.7. Kullanılan Bakteri Soyu .................................................54
2.1.8. Ökaryotik Hücre Dizisi ...................................................54
2.1.9. Antikorlar .......................................................................55
2.1.10. Plazmidler .....................................................................56
2.1.11. Kullanılan Hazır Kitler Ve Diğer Malzemeler .................56
2.1.12. Hücre Biyolojik İşlemler ................................................57
2.1.12.1. Memeli Hücrelerinin Kültüre Edilmesi ...........57
2.1.12.2. Ökaryotik Hücrelerin Rotifekt
İle Transfeksiyonları ....................................58
III
2.1.13. Moleküler Biyolojik İşlemler ..........................................58
2.1.13.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu .......................58
2.1.13.2. E. coli Top10 Transformasyonu ...................63
2.1.13.3. Mini- prep. ....................................................63
2.1.13.4. Maxi- prep. ...................................................64
2.1.13.5. Nükleik asit konsantrasyonunun
Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi ........66
2.1.13.6. DNA Enzim Kesimi ......................................66
2.1.13.7. Agaroz Jel Elektroforezi ...............................67
2.1.13.8. Moleküler Klonlama .....................................68
2.1.13.9. Enzim Kesiminin Ardından Oluşan
Parçaların 3’ Ucunun Doldurulması –
Klenow Reaksiyonu......................................69
2.1.13.10. DNA Fragmanlarının
Agaroz Jelden İzolasyonları..........................69
2.1.13.11. Ligasyon ......................................................70
2.1.14. Biyokimyasal Protein İşlemleri ......................................71
2.1.14.1. Ökaryotik Hücre Lizatlarının Oluşturulması ...71
2.1.14.2. SDS- Poliakrilamid Jel Elektroforezi ..............72
2.1.14.3. Western Blot Ve İmmun Tespit .....................73
2.1.14.4. Görüntüleme .................................................75
3. BÖLÜM
3.1. BULGULAR .............................................................................76
3.1.1. TANK Proteininin Fosforilasyon
Bölgelerinin Belirlenmesi.................................................76
3.1.2. TANK Proteininin SUMOlasyon
Bölgelerinin Belirlenmesi.................................................80
3.1.3. 10’ lu S- T/ A TANK ∆C 358- 425 Mutantının
Fonksiyonel Analizi.........................................................83
4. BÖLÜM
4.1. TARTIŞMA ..............................................................................85
5. BÖLÜM
5.1. SONUÇ VE ÖNERİLER ...........................................................90
6. BÖLÜM
6.1. ÖZET .......................................................................................92
6.2. ABSTRACT .............................................................................94
7. BÖLÜM
7.1. YARARLANILAN KAYNAKLAR .............................................96
7.2. KISALTMALAR .......................................................................101
7.3. ÖZGEÇMİŞ ..............................................................................108
IV
Tablolar Dizini
Tablo 1: IKKα ve IKKβ arasındaki farklılıklar .......................................16
Tablo 2: NF- κB tarafından düzenlenen ve
hastalıklara yol açan genler...................................................27
Tablo 3: İnsan kanser hücrelerindeki NF- κB aktivasyonu...................29
Tablo 4: NF- κB sinyal yolağını etkileyen inhibitörler,
etkileri ve kullanıldıkları hastalıklar........................................34-35
Tablo 5: Çalışmada kullanılan antikorlar .............................................55
Tablo 6: Çalışmada kullanılan plazmidler ...........................................56
Tablo 7: Kullanılan primerler, primerlerin mRNA dizisindeki yerleri,
protein dizisinde oluşturulan değişiklikler ve ∆C (358- 425)
mutantının protein dizisi .........................................................60-61
Tablo 8: Kullanılan Birincil ve İkincil Antikorlar ....................................74
Şekiller Dizini
Şekil 1: NF- κB’ nin üç ana sinyal yolağı ..........................................6
Şekil 2: NF- κB aile üyeleri ve oluşturdukları dimerler .......................12
Şekil 3: IκB proteinleri .......................................................................13
Şekil 4: IKK proteinlerinin yapısı .......................................................14
Şekil 5: IKK kompleksinin bileşimi ve önde gelen (upstream)
sinyalleşme molekülleri ile bağlantısı ...................................18
Şekil 6: IKK aktivitesinin fosforilasyon yoluyla düzenlenmesi ............20
Şekil 7: TRAF aile üyeleri ..................................................................23
Şekil 8: NF- κB inhibisyon statejileri .................................................36
Şekil 9: DHMEQ’ nun moleküler dizaynı ...........................................38
Şekil 10: Ub modifikasyonları ve hücresel fonksiyonları .....................40
Şekil 11: Ub- konjugasyon döngüsü ....................................................41
Şekil 12: SUMO döngüsü ....................................................................43
Şekil 13: 116, 117, 122, 123, 126, 225 ve 228. serin/ treonin
amino asitlerinin TANK proteini fosforilasyonundaki rolleri ...77
Şekil 14: 116, 117, 122, 123, 126, 225, 228, 230, 243 ve 244.
serin/ treonin amino asitlerinin TANK proteini
fosforilasyonundaki rolleri .....................................................79
Şekil 15: 146., 231., 235. ve 282. lizin amino asitlerinin
TANK proteini SUMOlasyonundaki rolleri ............................82
Şekil 16: TANK geni ∆C 358- 425 mutantı ..........................................84
.
V
Description:bağlanma aktivitesi IκB proteinleri tarafından inhibe edilmiştir (30). İnflamatuvar İlk basamakta ubiquitin, ATP bağımlı reaksiyonla ubiquitin aktive edici .. µl soğuk P1 çözeltisi konmuş ve mekanik yollarla pelletin parçalanması .. kurutulmuş ve daha önceden ikiye bölünerek ra
