Taller de Análisis Forense de ADN

23 Pages·2006·2.7 MB·Spanish

J.M. Butler –Forensic DNA Typing workshop August 17, 2006
SegundaReuniónInternacionalen GenéticaForense(Chiapas, Mexico)
Taller de Análisis
Contorno de Presentación
Forense de ADN
• Análisisde ADN y STRs
John M. Butler, PhD
– Butler, J.M. (2006) Genetics and genomics of core STR loci used in human
InstitutoNacionalde Estándaresy Tecnologíade E.U. identity testing. J. Forensic Sci.51(2): 253-265.
RECESO
• ElectroforesisCapilar
– Butler, J.M., Buel, E., Crivellente, F., McCord, B.R. (2004) Forensic DNA
typing by capillary electrophoresis: using the ABI Prism 310 and3100
Genetic Analyzers for STR analysis. Electrophoresis, 25: 1397-1412.
http://www.fge.chiapas.gob.mx/congresoforense/default.asp
PerspectivaHistóricaen el Análisisde ADN
2006: www.dna.gov
ADN esunaparte importante Leyde Justiciapara 2006
del sistcermimaidnea ljusticia todos($1B sobre5 años) •Reportepublicadoen Nov 2000
Estuchede 5-tintes
dSateo lsanNzaaciloan baalsdee d lea s Identifilery AB2I0 301200 2004Y-STRs •eSseta ptuidsiódee satnimálaisriascduea AlsDeNrí aene l2 ,
Nacion1e0s, U1n99id5a)s(April fLuoecroi nded eCfOinDidIoSs PowerPlex®16 5, y 10 añosfuturos
(16 loci en unasola
aGpilpl leict aatli.o(n1 9of8 5D)N FAo r'feinngseicr prints‘. 1998 2000 amplificación) Conclusiones
Nature318:577-9QuaFdSruSp lex cAonná elilseicstrdoefo SreTsRis Análisisde STR está
Primer STR es 1994 1996 Primer ‘multiplecxa’ pilaresrutina aquíparaquedarse
desarrollado fluorescentecomercial ADNmt poralgunosaños
1990 1992 ElectroforesisCapiladred SeT R gracias a lasbases de
STR esdescritapor datos
primeravez
1985 Desarrollode DQA1 & PM
RFLPPCR (dot blot) ‘Multiplex’ STRs http://www.ojp.usdoj.gov/nij/pubs-sum/183697.htm
'National DNA Index System' (NDIS) Aplicacionesdel Análisisde Identidad
Humana
• Resoluciónde crimen–establecercompatibilidadentre
sospechosoy evidencia…
• Víctimasde Accidentes–luegode accidentede avión…
http://www.fbi.gov/hq/lab/codis/index1.htm • Soldadosen la guerra–quienesel soldado“desconocido”…
• Pruebasde Paternidad–quienesel padre …
• Reclamosde herencia–quienobtieneel dinero…
'Combined DNA Index System' (CODIS) • Investigacionesde personas desaparecidas–de quienes
el cuerpo…
Creadoen 1998 ahoraconectaa todoslos 50 estados • Base de datosde ofensoresconvictos–resoluciónde
Utilizadoparaconectarcrimenesen seriey casosno resueltoscon casosarchivados…
ofensoresrepetitivos
Ofensoresconvictosy muestrasde casosforenseen adicióna
índicede personas desaparecidas IImmpplliiccaaggeenneerraacciióónnddee ppeerrffiilleessddee AADDNN
Requiere13 marcadoresde STR uussuuaallmmeenntteeccoonn llooss mmiissmmoossmmaarrccaaddoorreessddee SSTTRRss
Ha ayudadoen >36,000 investigacionesa travésde la naciónhasta ((‘‘sshhoorrtt ttaannddeemm rreeppeeaatt’’)) yy lluueeggooCCOOMMPPAARRAARR AA
Junio2006
Contienemásde3.4 millonesde perfilesde ADN MMUUEESSTTRRAA DDEE RREEFFEERREENNCCIIAA
1
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NISTpub.htm
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Base de Análisis de ADN
Análisisde ADN RequiereunaMuestrade Referencia
Un perfilde ADN porsí El genomade cadaindividuoesúnico(con la exepción
de gemelosidénticos) y esheredadode los padres
solo no tieneusoporque
carececontexto…
Pruebasubgruposde variacióngenéticaparapoder
Análisisde ADN para diferenciarentreindividuos(probabilidadesestadísticas
de compatibilidadal azarson utilizadas)
propósitosdeidentidad
sólotrabajapor Análisisde ADN debeser realizadode manera
comparación–se eficientey reproducible (informacióndebeser
requieremuestrade admisibleen corte)
referencia
Pruebasde ADN utilizadasactualmenteNO tomanen
Evidenciade Escenadel Crimencomparadaa sospechoso(s)(CasoForense) consideraciónlos genes–poca/no informaciónsobre
Niñocomparadoa SupuestoPadre (Casode Paternidad) raza, predisposicióna enfermedadesóinformación
Restosde Víctimacomparadoa ParienteBiológico(ID de Desastresen Masa) fenotípica(color de ojos, estatura, color de cabello) es
Restosde Soldadocomparadoa Muestrade ReferenciaDirecta
(ID de FuerzasArmadas) obtenida
Procesode ‘Polymerase Chain Reaction’ (PCR)
ADN en la Célula
5’ 3’ PlantillaInicialde ADN
80-500 bases
La mayoríadel ADN esel mismoentre 3’ 5’
personas
cromosoma 22 pares + XX óXY
Separar
‘Primer’ delantero cadenas
5’ 3’ (denaturar) 5’ 3’
núcleocelular
3’ 5’ ‘pArñimaedrirs’ 3’ 5’
(unir) ‘Primer’ de reversa
Moleculade ADN
de doblecadena
Hacercopias
(extender
~3 billionesde pares de bases ‘primers’)
SSóólloouunnaappeeqquueeññaarreeggiióónn CRoeppiaentidroCiAcDloN,
vvaarriiaanntteeeessddee iinntteerrééssyy ppoorrlloo Nucleotidos Exponencialmente
ttaannttooaannaalliizzaaddaappaarraaccaaddaa individuales EEnn 3322 cciciclolossaa uunnaaeefficicieienncciaiaddee 110000%% yy,, 11..0077 bbilillolonneess
mmaarrccaaddoorrddee AADDNN EExxaammiinnaaddoo ddee ccooppiaiassddeel l AADDNN ddee inintteerrééssssoonn ccrreeaaddaass
MarcadoresShort Tandem Repeat (STR)
Ventajas de los Marcadores STR Markers
Unasecuenciatipoacordeónqueocurreentregenes
• Productosde tamañopequeñoson generalmente TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACA
compatibles con ADN degradadoy el PCR permite GGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGA
recuperaciónde informaciónprovenientede mínimas
TAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGAT
cantidadesdel material
ACATGCTTACAGATGCACAC
• Amplificación‘multiplex’ con detecciónpor = 12 repeticionesGATA (“12” estodolo quese reporta)
fluorescencia permiteun alto poderde
discriminaciónen unasola prueba El númerode unidadesrepetitivas
7 repeticiones
8 repeticiones consecutivaspuedevariarentre
• Disponiblescomercialmenteen un estuchefácilde 9 repeticiones individuos
utilizar 10 repeticiones El FBI ha seleccionado13
11 repeticiones
loci de STRlos cuales
12 repeticiones
• Grupouniformede STRsproveela capacidadpara 13 repeticiones debenser corridosen
compartirpormediode base de datos, perfiles todoanálisisde ADN para
criminalesde ADN a nivelnacionale internacional Regiónde interés poderproveer un sistema
(short tandem repeat) comúnde perfilesde ADN
2
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Posicionesde MarcadoresForenses El ‘polymerase chain reaction’ (PCR) esutilizadopara
de STR en CromosomasHumanos amplificarregionesde STR y rotularlos fragmentos
s con tintesfluorescentesutilizando‘primers’ para
do TPOX 13 Loci de STR de CODIS ‘locus’ específicos
Uni D3S1358 1997 ‘Locus’ 1 8 repeticiones
s 10 repeticiones
o
d TH01
a D8S1179
st D5S818 VWA 8 repeticiones
os E FGCASF1PO D7S820 ‘Locus’ 2 9 repeticiones
l
a
r
a
p
R AMEL
T
S Determinaciónde
de D13S317 sexo
ci D16S539 D18S51 D21S11 AMEL
o
L
Imágende
Gelatina ElectroferogramaCapilar
LÁSER Pasosen el análisisde Variación de STRs entre Individuos
de(4 8A8 rngmó)n STR con ABI 310/3100 Un marcadoralélico, queesunamezclade alelos
Separación comunes, esusadoparaconvertirtamañode ADN a
de Tamaño espAeBcIt rPorgisrámfi co númerode repeticionesde STR
RelacionesFamiliaresPuedenMonitoreadas
Separación
de colores
Fluorescencia
Separación Padre
de Muestra Individuosno-relacionados
Capilar
(llenocon
soluciónde Panel CCD (con filtrosvirtuales)
polímero) Detecciónde Muestra Madre
Injecciónde
Muestra Procesarcon programasGeneScan/Genotyper
Hija
Mezlade productosde
PCR rotuladoscon tintes
provenientesde una Preparación
reacciónPCR multiplex de Muestra Sample Interpretation Hijo
Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2ndEdition, Figure 13.8, © Elsevier Science/Academic Press
PRUEBAS DE PATERNIDAD Estándaresinternosde tamaño(Rotuladoscon
DiferentesColoresde Tintes) son Utilizadospara
HerenciaFamiliar de alelosde STR (D13S317)
CalibrarcadaAnálisis
Tamañode productode PCR (bp)
11 14
FaYthoer
12 14
AmCahnildda #1
8 14
MaCrhshiladl l#2
11 12
KCahtiyld #3
8 12
MMi eostpheorsa
3
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Análisisde Genotipode STR porcomparacióna
TH01 TPOX D7 CSF
• Genotiposson genmearardcoasdpoorrcaolmélpiacroaciónde tamañosde AMEDL19D3D8D5 VWA D21FGAD13 D16D18 D2
productosde PCR de los alelosde STR con marcadores DNA Size (bp)
alélicoscompuestode variantescomunesobservadosen la
población 6FAM D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO
(blue)
Marcador TH01
Alélicode VIC D3S1358 D13S317 D16S539 D2S1338
AlelosComunes (green)
Tamañosde productosde
PCR determinadospor TPOX
comparaciónal estándar NED D19S433 VWA D18S51
internode tamaño (yellow)
MuInetsetrréasde PET AMEL D5S818 FGA 1 en 837 trillones
(red)
(probabilidadde queeste
perfilocurraal azar)
Areas sombreadasson +/-0.5 bp asíqueparaun fragmentode D7S820 LIZ GS500 LIZ size standard
sea designadoun alelo“12” estedebecaeren el rangode 281.80 a (orange)
282.80 bp (yaqueel alelo12 en el marcadoralélicoes282.30 bp)
Tiposde Unidadesde Repeticionesde Categorías para Marcadores STR
YCAII STR Categoría Ejemplode 13 Loci de CODIS
Estructurade
Require separaciónde ADN basadaen tamaño
~45% paradistinguirlos alelosel unodel otro Repetición
RepeticionesSimples – (GATA)(GATA)(GATA) TPOX, CSF1PO,
contieneunidadesde D5S818, D13S317,
‘Stutter’ Alto • Dinucleótido (CA)(CA)(CA)(CA) tamañoy secuencia D16S539
idénticos
• Trinucleótido (GCC)(GCC)(GCC) RepeticionesSimples (GATA)(GAT-)(GATA) TH01, D18S51, D7S820
con alelossin
• Tetranucleótido (AATG)(AATG)(AATG) consenso(e.g., TH01 9.3)
• Pentanucleótido(AGAAA)(AGAAA) Repeticiones (GATA)(GATA)(GACA) VWA, FGA, D3S1358,
Compuestas–abarca D8S1179
‘Stutter’ Bajo• Hexanucleótido (AGTACA)(AGTACA) dos ómásrepeticiones
simples adyacentes
DYS448 Repeticiones (GATA)(GACA)(CA)(CATA) D21S11
Complejas–contiene
‘Short tandem repeat’ (STR) = microsatélite variosbloquesde
repeticionesde unidadesde
<2% = repeticionessimples de secuencia(SSR) tamañovariables
EstascategoríasfuerondescritasporprimeravezporUrquhart et al.(1994) Int. J. Legal Med.107:13-20
¿CuántosSTRs hay en el genoma ‘Multiplex’ PCR
humano? (Procesamientode muestrasen paralelo)
• ‘Primers’ compatibles son la
• Los esfuerzosdel Proyectodel GenomaHumanohan llaveparaunareacciónde
aumentadoel conocimientorelacionadoal genomahumano, y ‘multiplex’ PCR exitosa
porlo tanto, existenahoramuchosmás‘loci’de STR
disponiblesen comparacióna hace10 añosatráscuandolos 13
‘loci’ de CODIS fueronseleccionados • Estuchesde STR están
disponiblescomercialmente
• Másde20,000 tetranucleótidosde loci de STR hansido
caracterizadosen el genomahumano(Collins et al. An exhaustive DNA • 15 ómásloci deSTR pueden
micro-satellite map of the human genome using high performance computing. Genomics ser amplificados
2003;82:10-19) simultáneamente
• Puedequehayamásde un millónde loci de STR presentes Retosde ‘Multiplexing’
dpendiendoen cómoseancontados(EllegrenH. Microsatellites: simple (cid:131)Diseñode ‘primer’ paraencontrar
sequences with complex evolution. Nature Rev Genet 2004;5:435-445). ‘primers’ compatibles (no existeun
programa)
• Secuenciasde STR explicanaproximadamente3% del total del (cid:131)reacciónde optimizaciónesaltamente
genomahumano(Lander et al. Initial sequencing and analysis of the human Ventajasde ‘Multiplex’ PCR empíricay a vecestardameses
genome. Nature 2001;409:860-921).
–Aumentala informaciónobtenidaporunidadde tiempo(aumetapoderde
discriminación)
–Reduce labor paraobtenerresultados
Butler, J.M. (2006) Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing. J. Forensic Sci. 51(2):253-265. –Reduce plantillade ADN requerida(menosmuestraconsumida)
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CompañíasSuplenMarcadoresalélicosen estuches
Informaciónesunidacon ‘multiplex’ PCR y análisisdedata
de STR paraAyudara Mantenerla Consistencia
entreLaboratorios
AmpFlSTR®Identifiler™(Applied Biosystems)
Marcadoresalélicosdel estucheProfiler Plus (Applied Biosystems)
D3S1358 VWA FGA
D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO
AMEL D8S1179 D21S11 D18S51
D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338
D5S818 D13S317 D7S820
D19S433 VWA TPOX D18S51
AMEL D5S818 FGA
11 aannáálliissiissiinntteeggrraaddoovvss..
1166 ccoorrrriiddaasssseeppaarraaddaass EstándarinternoGS500 ROX
Productos 'Stutter'
‘Artefactos’ Biológicosde Marcadoresde STR
• Picosqueaparecenprimordialmenteunarepetición
menosqueel aleloverdaderocomoresultadode
'resbalamiento' de la cadenadurantela síntesisde
• Productos‘Stutter’
AND
• Adiciónde nucleótidos‘Non-template’
• Microvariantes • 'Stutter' esmenospronunciadocon unidadesde
tamañomásgrandes(dinucleótidos> tri-> tetra->
• Patronestri-alélicos penta-)
• AlelosNulos
• Regionesde repeticioneslargasgeneranmás'stutter'
• Mutaciones
• Cadaproductode 'stutter' consecutivoesmenos
intenso
CCaappííttuulloo66 ccuubbrreeeessttooss (alelo> repetición-1 > repetición-2)
tteemmaasseenn ddeettaallllee
• Picosde 'stutter' hacenanálisisde mezclasmás
complicados
Alelos de STR con Productos Formación de Producto 'Stutter'
'Stutter' Unidadesde repeticiónsobresalehaciaafueracuandoocurre'respiración' de la
cadenaduranteel procesode replicación
Aleloverdadero
Tamañode ADN (bp) (repeticióntetranucleótida)
Típicamente5-15%de
va aleloverdaderoen
ati D8S1179 repeticiones
nciaRel D21S11 D18S51 tetranucdleeó StidTaRsde locpir ond-u4cto n+4 f<re2c%ue) n–Oteucmcsuueranrletmeme(nteítpneiocbsaamjoenetne
ce Alelo 'stutter' producto "ruido" dependiendoen
es 'stutter' sensibilidad
de Fluor 6.3% 6.2% P'Srotud5tut.ec4rt%o' 'resDbeaclleaomcpiiióaendnatcoa(' iunesfnea rldaioa cr)paodrena 'reIsnbsaceolarptmciaiienóntnetoc('sa duueps ealardi oacrap)doerna
s 1 2 3 5 2’
e
dad 5’ GATA GATA GATA GATA 1 2
ni 3’ CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT 5’ GATA GATA
U 1 2 3CTAT 5 6 3’ CTAT CTAT CTAT
4 1 2 3
Figure 6.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2ndEdition © 2005 Elsevier Academic Press
5
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Impacto del Nucleótido 5’ en
Adición 'Non-Template'
Adición 'Non-Template'
• Polimerasausualmenteañadeun nucleotidoextra al final del producto
de PCR; casisiempreuna"A" (procesollamadoadenilación)
5’-ACAAG…
• Dependientedel extremo5’ del 'primer' de reversa; una“G” +A +A
puedeser colocadaal final del 'primer' parapromoverla adición
'non-template' UltimaBase para
• Puedeser realzadacon un aumentoen la extensiónal final del ciclo 'primer' con rotulación
de PCR (ej., 15-45 min @ 60 ó72 oC) –paradarlemástiempoa la de tinteopuesta
polimerasa (Condicionesde PCR son las
mismasparaestasdos
• Cppuaaernadtieldaar redeseauscltceaixórcnee)ns iavdaesndilea cpilóanntiinlloamdpel eAtDaN(n eon h laay r seuafcicciieónntedep oPlCimRe rasa AIndceonmilapcleiótan -A+A -A+A 5’-CCAAGm…uestras)
++AA ++AA
MejorsiNO hay unamezclade picos“+/-A” --AA --AA PArToTm eeng ae li necxltureyemuon5a’ sdeec uencia
(deseableteneradenilacióncompletaparaprevenirpicosdivididos)
muchosde sus'primers' PP16
A no rotuladosparapromover
adenilaciónsee Krenkeet al.(2002) J.
A D8S1179 Forensic Sci.47(4): 773-785
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/PP16primers.htm
Altos Niveles de ADN Llevan a Impacto de Cantidad de ADN en PCR
Adenilación Incompleta Razónporla cualla cuantificacionde ADN esimportanteantes de unaamplificación'multiplex'
Generalmente0.5 –2.0 ngde plantillade
Tamañode ADN (bp) ADN esmejorparaestuchesde STR
• DemasiadoDNA • MuypocoADN
FUs) -A Fuerade escala –– PPiiccoossdfuiveirdaiddoes e(s+c/-aAla) –– DDeecsabiamlaienncteodaelé pliiccoosheterocigotos
(R +A 10 ng plantilla – Desbalanceentre'locus' – Desbalanceentre'locus'
ativa (sobrec)argado Tamañode ADN (bp) Tamañode ADN (bp)
el
FluorescenciaR D3S1358 VWA (n2iv neglspulagnetriildlao) FGA FluorescenciaRelativa(RFUs) D3S13581-2(A(n0 +snio vAngebglrepscuplaaglraengrnatididtlolioal)l)a p1pll0a5a0n np tEatpigillmlgfla ea pcltioficeasntobcaájsotsicnoivceulaensddoe sAeD N
Figure 6.5, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2ndEdition © 2005 Elsevier Academic Press produce decaimientoalélico
Alelos Microvariantes “Fuera del
Marcador” Patrones de Tres Picos
• Definidoscomoalelosqueno son múltiplosexactosde la Clayton et al.(2004) A genetic basis for anomalous band patterns encountered
during DNA STR profiling. J Forensic Sci.49(6):1207-1214
repeticiónbásicaóvariantesde secuenciade la repeticiónó
ambos D18S51 TPOX D21S11
• Aleloscon unidadesde repeticiónparcialesdesignadaspor
el númerode repeticionescompletady luegoun punto
decimal seguidodel númerode bases en la repeticiónparcial
(Bar et al. Int. J. Legal Med.1994, 107:159-160)
“Tipo 1” “Tipo 2”
• Ejemplo: AleloTH01 9.3: [TCAT] -CAT [TCAT]
4 5 Suma de alturasde
Alturas de
dos de lospicoses
picos
igualal tercero
balanceadas
Máscomúnen Máscomúnen TPOX
Deleciónde T D18S51 y ….. y D21S11
6
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AlelosVariantesCatalogadosen STRBase Alelos Nulos
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_tab.htm • Aleloestápresenteen muestrade ADN perono es
amplificadodebidoa uncambioen nucleótidoen el lugar
Alelosfuerade marcador PatronesTri-Alélicos de enlace del 'primer'
Actualmente • Decaimientoalélicoesun problemaporquemuestras
Actualmente80 heterocigotasaparecencomofalsoshomocigotos
328
en 13/13 loci de
en 13/13 loci de CODIS + FES/FPS
CODIS + F13A01, • Dos gruposde 'primers' de PCR puedenproducirdiferentes
FES/FPS, Penta D, resultadosen muestrasquese originande la mismafuente
Penta E, D2S1338,
D19S433
• Estefenómenoimpactalasbases de datosde ADN
• Estudiosde concordanciason llevadosa cabotípicamente
antes del usode nuevosestuchesde STR
Para másinformación, veaJ.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2ndEdición, pp. 133-138
Concordanciaentregruposde 'primers' de
Impactode Variaciónen Secuenciade ADN
STR esimportanteparabases de datos en el lugarde enlace de 'Primer' en PCR
de ADN
Alelosheterocigotos
bienbalanceados
PowerPlex 16 6 8 No mutación
Base de
17,18
Datos de
17,17 ADN Daletusrbaadlaen cpeicoesn cMenuttraocidóenl elung ealr
Identifiler Decaimiento Alélico mBúfuaselsqsoutreandseagqarueteisvudolet(abneoen nv seuenr * 6 8 de 'epnrilmaceer 'del
compatibles) 8 Mutaciónen el
Bajarla rigurosidad * extremo3’ de lugar
de enlace del 'primer'
de compatibilidad (decaimientoalélico)
Alelo18 decae
esunasolución Fragmentode alelo
6 ha “decaído”
común Butler, J.M. (2005)Forensic DNA Typing, 2ndEdition,Figure 6.9, ©Elsevier Academic Press
Porcientosde Mutaciónde STR http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/mutation.htm
'Locus' de STR Meiosis Materna(%) Meiosis Paterna(%) CualquierPadre Total de mutaciones Porciento
Mutación Observada en Trio Familiar CSF1PO 70/179,353 (0.04) 727/504,342 (0.14) 303 1,100/683,695 0.16%
FGA 134/238,378 (0.06) 1,481/473,924 (0.31) 495 2,110/712,302 0.30%
S TH01 23/189,478 (0.01) 29/346,518 (0.008) 23 75/535,996 0.01%
DI TPOX 16/299,186 (0.005) 43/328,067 (0.01) 24 83/627,253 0.01%
CO VWA 133/400,560 (0.03) 907/646,851 (0.14) 628 1,668/1,047,411 0.16%
e D3S1358 37/244,484 (0.02) 429/336,208 (0.13) 266 732/580,692 0.13%
padre madre oci' d DD57SS881280 8443//331364,,180826 ((00..0031)) 553570//446681,,346567 ((00..1112)) 320138 982141//778946,,436483 00..1120%%
14,18 15,17 14,18 15,17 13 'l DD81S3S1137179 15442/2/33478,2,33955 ( (00.0.024)) 369068//246345,,533500 ((00..1145)) 420225 16,17552/5/70813,5,98255 00..1135%%
D16S539 77/300,742 (0.03) 350/317,146 (0.11) 256 683/617,888 0.11%
D18S51 83/130,206 (0.06) 623/278,098 (0.22) 330 1,036/408,304 0.25%
hijo 15,18 13,17 PDe2n1tSa1 D1 21824//12858,7,70915 ( 0(.00.161)) 41504//31056,0,18988 ( 0(0.0.175)) 42213 1,14631/3/536,748,9993 00..2113%%
Penta E 22/39,121 (0.06) 58/44,152 (0.13) 55 135/83,273 0.16%
D2S1338 2/25,271 (0.008) 61/81,960 (0.07) 31 94/107,231 0.09%
TransmiciónNormal de Alelos MutaciónPaterna D19S433 22/28,027 (0.08) 16/38,983 (0.04) 37 75/67,010 0.11%
(No Mutación) F13A01 1/10,474 (0.01) 37/65,347 (0.06) 3 41/75,821 0.05%
FES/FPS 3/18,918 (0.02) 79/149,028 (0.05) Ningunoreportado 82/167,946 0.05%
F13B 2/13,157 (0.02) 8/27,183 (0.03) 1 11/40,340 0.03%
LPL 0/8,821 (<0.01) 9/16,943 (0.05) 4 13/25,764 0.05%
SE33 (ACTBP2) 0/330 (<0.30) 330/51,610 (0.64) Ningunoreportado 330/51,940 0.64%
Butler, J.M. (2001)Forensic DNA Typing,Figure 6.9, ©Academic Press *Data used with permission from American Association of Blood Banks(AABB) 2002 Annual Report.
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http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NISTpub.htm
J.M. Butler –Forensic DNA Typing workshop August 17, 2006
SegundaReuniónInternacionalen GenéticaForense(Chiapas, Mexico)
Artículode Repasoen Principales'Loci' de
Resúmen de Mutaciones de STR STR
Mutacionesimpactanpruebasde paternidade
investigacionesde personas desaparecidas
perono afectanevidenciaforenseo compatibilidad
entreevidencia-sospechoso…
Journal of Forensic Sciences 2006,51(2): 253-265
• Mutacionesocurreny necesitanser consideradas
• Repasalosestuchesde STR, localizacionesgenómicas,
• Usualmente1 en ~1000 meiosis
porcientosde mutación, potencialde relacióngenética, y
• Paternal normalmentemayor quematernal variantesalélicosconocidosparaSTR autosomal y loci
de Y-STR
• VWA, FGA, y D18S51 tienenlosnivelesmásaltos
• Cubrecaracterísticasde 18 'loci' autosomales(13
• TH01, TPOX, y D16S539 tienenlosnivelesmás
loci principalesCODIS, D2, D19, Penta D, Penta E,
bajos SE33) y 11 loci de Y-STR recomendadospor
SWGDAM
Posicionesde MarcadoresForenses
Característicasde Principales'Loci' de STR
de STR en CromosomasHumanos
os 13 Loci de STR de CODIS 'Locus' LocalizaciónCromosomal (May 2P00o4s; iNcCióBnI cFoínssictrauyó35)
Unid TPODX3S1358 1997 D3TSP1O3X58 thyroid pe3r2oppx2id21a5s.3.e3,1 10thintron CChhrr32; ; 415.4.57527 MMbb
s
do TH01 FGA alpha fib4rinqo3ge1n.,3 3rdintron Chr4; 155.866 Mb
a D8S1179
st D5S818 VWA D5S818 5q23.2 Chr5; 123.139 Mb
s E FGA D7S820 CSF1PO c-fmsproto5-oqnc3o3ge.1ne, 6thintron Chr5; 149.436 Mb
o CSF1PO
l D7S820 7q21.11 Chr7; 83.433 Mb
a
r D8S1179 8q24.13 Chr8; 125.976 Mb
a
R p AMEL TH01 tyrosine h1yd1ropx1yl5as.5e, 1stintron Chr11; 2.149 Mb
de ST D13S317 Determsienxaociónde D1V3WS3A17 von Willeb1r1a2n3pdq1F3a31c.t3.o1r1, 40thintron CChhrr1132; ;8 51..966230 MMbb
ci D16S539 D18S51 D21S11 AMEL D16S539 16q24.1 Chr. 16; 84.944 Mb
o
L D18S51 18q21.33 Chr18; 59.100 Mb
D21S11 21q21.1 Chr21; 19.476 Mb
Butler, J.M. (2006) Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing. J. Forensic Sci. 51(2): 253-265
Tamañode Productode PCR (bp) MismaCorridade ADN con estuches Estuches Comerciales 16plex de
de STR de Applied Biosystems
D3S1358 vWA FGA ComPproabtiabbiliildidaaddadl eA zar STR SRM 2391b component 1
Blue 1.0 x 10-3
D8 EstucheIdentifiler™(Applied Biosystems)
Amel TH01 TPOX CSF1PO Green I 7.8 x 10-4 TH01 Resultadode 'multiplex' STR
AmelD3S13D585S81T8H0v1WATPDO1X3S3F1G7A D7S820CSF1PO Profiler 9.0 x 10-11 AMELDD139 D5 VWA D21DF1TG3PAOX D7D1D618 CSFD2
AmeDl3S1D385S811D759S81v8WAD21SD1113FSG31A7 D7S820D18S51 Profiler Plus 2.4 x 10-11 EstuchePowerPlex®16(Promega Corporation)
Resultadode 'multiplex' STR
D8
AmeDl3S1358 TH01 TPOXD16DS75S39820CSF1PO COfiler 2.0 x 10-7 AMEL D5VWA D21D7 D18 CSF Penta E
D3 TH01 D13 TPOX D16 FGA Penta D
DA1m9eSDl433S31D385S81179THv0W1AD21S11 D16S539 D18S5D12S1338 SGM Plus 4.5 x 10-13
FGA
From Butler, J.M. (2005) Constructing STR multiplex assays. Methods in Molecular Biology: Forensic DNA Typing Protocols
(Carracedo, A., ed.), Humana Press: Totowa, New Jersey, 297: 53-66.
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http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NISTpub.htm
J.M. Butler –Forensic DNA Typing workshop August 17, 2006
SegundaReuniónInternacionalen GenéticaForense(Chiapas, Mexico)
Síntesis de 'Primers' y 'Gotas' de
Valor de Estuches de STR
Tinte
Ventajas • 'Primers' de oligonucleótidosson sintetizadosen dirección3’-a-5’ en
• Control de calidadde materialesestáen manosdel soportesde fasesólidautilizandoquímicade fosforamidita
manufacturero(ahorratiempoparael usuariofinal)
• El tintefluorescenteesenlazadoal extremo5' del 'primer' (esteesel
• Mejoraconsistenciaen resultadosen laboratoriosa
últimocomponentea ser añadido)
través–mismomarcadoralélicoutilizado
• 'Loci' y condicionesde PCR comunesutilizadas– • La reacciónde acoplamientoen cadapasode la síntesisde 'primer'
ayudaen losesfuerzosde base de datosde ADN no es100%, lo quepuedellevara algunasimpurezasde baja
• Másfácilparael usuarioobtenerresultados importancia
• Las moleculasdel tintequesobrany queno son removidasen el
Desventajas procesode purificaciónpost-síntesispuedenser cargadasa través
• Contenidospuedenno ser conocidosparael usuario de la amplificaciónporPCR e inyectadasen el capilarparaproducir
gotasde tinteóartefactos de tinteen loselectroferogramasde
(ej., secuenciade 'primers')
electroforesiscapilar(alelosmásanchosde lo normal)
• Alto costoparaobtenerresultados
Problemascon Artefactosde Tintede 'Primers'
Impacto de Muestras de ADN
Fluorescentes
Degradadas
No Filtración(Directode PCR) • Comparacióna un númerotelefónico(hilerade 13
TH01 números)
TPOX 001-301-975-4049
CSF1PO
FGA D21S11 • Sisólotuviera“4049”…estainformacióntendríaun valor
D7S820 limitadoyaqueno seríatan específica(y podríaser
compatible con otrosnúmerostelefónicoscon diferentes
códigosde área)
TH01 FFilitlrtraaddooccoonn
TPOX ccoolulummnnaassEEddggee • Los perfilesde ADN son esencialmenteunahilerade
CSF1PO números–siel ADN esdañado, entoncesla
FGA D21S11
hilerade númerosesmáscortay menos
CARTUCHOS DE D7S820 informativa…
FILTRACION DE
GELATINA EDGE ------------4049 ó ----301-9-------
86A1N
Un miniSTR esun fragmentode STR de tamañoreducidoque
ADN Degradado permitealtarecuperaciónde informaciónde muestrasdde
ADN degradadas
'Primer' de PCR 'primer' de Región
Segmentosmáslargos de Convencional miniSTR Informativa
ADN no puedenser
recuperadoscuandolas Regiónde repeticiónde STR
mfraoglemceunlatasddaes AeDn Np eedsatáznos ddeeAAmmnnoáoáslsliitstsrriaiassrrddcceeoobbnneeccososrereddrr a alllnlneeccvviiaaaaddeeoonnatatrr ececaaggbbrrououppppooaassrraaddee 'pmriimnieSrT' Rde 'PCriomnevre' ndceio PnCalR
pequeños(causadopor ''pprriimmeerrss''
calor, aguaóbacterias)
Pruebaconvencionalde
STR (estucheCOfiler™)
Permitióquese identificara
AMEL “ADN Degradado” el20% final de lasvíctimas
(decaea altastemperaturas) del WTC
D19
D3 “Curvade
TH01 Decaimineto” de ADN ~150 bp máspequeño Pruebade MiniSTR
degradado (utilizando'primers' de
D8 VWA D21 Butler et al.2003)
FGA D16 D18
D2
Butler, J.M. (2005)Forensic DNA Typing, 2ndEdition,Figure 7.2, ©Elsevier Science/Academic Press
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http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NISTpub.htm
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SegundaReuniónInternacionalen GenéticaForense(Chiapas, Mexico)
'Timeline' para miniSTRs J. Forensic Sci.Sept 2003 issue
y Demostracióndel Valorde la Utilizaciónde Fragmentos
de TamañoReducidoparaADN Degradado
• 1994 –FSS encuentraquelos'loci' de STR máspequeñostrabajan
mejorcon restosde huesosquemadosy tejidosdel fuegode Branch
Davidian
• 1997 –Nuevos'primers' desarrolladosparaespectrometríade masa TH01 Tamañode productode PCR (bp)
'time-of-flight' parahacerfragmentosde STR máspequeños
TPOX
• 2001 –Trabajoen NIST y la Universidad de Ohio con losSTRsde CSF1PO FGA D21S11
CODIS; BodePlexesutilizadosen investigaciónde WTC comenzando
en 2002 D7S820
• 2004 –Trabajoen NIST con non-CODIS (NC) miniSTRs
--110055 bbpp --119911 bbpp --111177 bbpp --3333 bbpp
• 2006 –Applied Biosystems lanzaun estuchede miniSTR 9plex
--114488 bbpp --7711 bbpp
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/miniSTR/timeline.htm Tamañorelativoa losestuchesdeABI
Comparaciónde Porcientode AmplificaciónporPCR
Exitosacon EstuchesComercialesv. Análisiscon
La ComisiónInternacionalde Personas Desaparecidas
miniSTR
(ICMP) ahorautilizaminiSTRs Amp sencillapara15 loci de STR (12 loci en comúnmostradosaquí)
Estudiocon 31
100s de huesosson analizadoscada
huesoshumanosdel
semanacon miniSTRsparaayudaren la
“Body Farm”
re-asociaciónde restos
(Knoxville, TN) y
Oficinadel Coronel
Miniplex02 del Condadode
D21S11, D13S317, D7S820, Franklin (OH)
CSF1PO, vWAand D8S1179
-173 bp
Tresamps para12 loci de STR -183 bp
(Tom Parsons, comunicaciónpersonal) OprpimeleKr .s Le.t;s C inh uthneg ,a Dn.a Tly.s; iDs roáfb deke,g Jra.;d Teadt aDrNekA, fNro. Em. ;h Juamntazn, Ls.k Mele.;t.a Ml rceCmoardin, sB, .JR.. F(2o0re0n6s) i cT hSec iaepnpcleicsa5ti1o(n2) o: f3 m51i-n3i5p6lex
Artículo Reciente Abogando por los
EjercicioEDNAP en ADN Degradado
miniSTRs
EllosrecomiendanquelosminiSTRssean“adoptados
comoel caminoa aumentarambos la robustezy
sensibilidaddel análisis.”
Ellosrecomiendanqueloslaboratorioseuropeos
adoptentresnuevosloci de mini-STR: D10S1248,
Mezclasde 'primers' de MiniSTR y marcadoresalélicosfueronprovistosporelNIST D14S1434 y D22S1045. (D14 sustituídoporD2S441)
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http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NISTpub.htm