Table Of ContentStudien zur Biosynthese von Sactipeptiden:
Charakterisierung der an der Thioetherbrückenbildung
beteiligten Radical SAM Enzyme AlbA und SkfB
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem Fachbereich Chemie
der Philipps-Universität Marburg
(Hochschulkennziffer 1180)
vorgelegt von
Dipl.-Chem. Leif Flühe
aus Hannover
Marburg an der Lahn 2014
Vom Fachbereich Chemie
Der Philipps-Universität Marburg als Dissertation
am 03.11.2013 eingereicht.
Erstgutachter: Prof. Dr. M. A. Marahiel
(Philipps-Universität Marburg)
Zweitgutachter: Prof. Dr. W. Buckel
(Philipps-Universität Marburg)
Tag der Dissertation: 29.01.2014
II
für Lena, Karin und Dirk
II I
IV
Der Hauptteil der Arbeit wurde in folgenden Artikeln veröffentlicht:
Flühe L., Knappe T. A., Gattner M.J., Schäfer A., Burghaus O., Linne U. and Marahiel M.A. The
radical SAM enzyme AlbA catalyzes thioether bond formation in subtilosin A. Nat. Chem. Biol.
2012, 8 (4), 350-357
Flühe L., Burghaus O., Wieckowski B.M., Gießen T.W., Linne U. and Marahiel M.A. Two [4Fe-
4S]-Clusters containing radical SAM enzyme SkfB catalyzes thioether bond formation during the
maturation of the sporulation killing factor. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135 (3), 959-962
Weitere Publikationen des Autors:
Flühe L. and Marahiel M.A. Radical-S-adenosylmethionine enzyme catalyzed thioether bond
formation in sactipeptide biosynthesis. Curr. Opin. Chem. Biol. 2013, 17 (4), 605-612
V
V I
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ..................................................................................................... XIII
Abstract ....................................................................................................................... XIV
Abürzungsverzeichnis ................................................................................................ XV
1.
Einleitung ................................................................................................................. 1
1.1
Naturstoffe ...................................................................................................................... 1
1.1.1 Nicht-ribosomale Peptide .............................................................................................. 2
1.1.2 Ribosomale Peptide ...................................................................................................... 3
1.1.3 Bacteriocine aus Gram-positiven Bakterien .................................................................. 5
1.2 Wichtige Klassen ribosomal synthetisierter Peptide .................................................... 6
1.2.1 Sactipeptide .................................................................................................................. 6
1.2.2 Lanthipeptide .............................................................................................................. 14
1.2.3 Thiopeptide ................................................................................................................. 18
1.2.4 Linaridine .................................................................................................................... 21
1.2.5 Proteusine ................................................................................................................... 21
1.2.6 Cyanobactine .............................................................................................................. 23
1.2.7 Pyrrolochinolinchinon (PQQ) ...................................................................................... 25
1.2.8 Lassopeptide .............................................................................................................. 26
1.3 Radical SAM Enzyme ...................................................................................................... 28
1.3.1 Lysin-2,3-Aminomutase .............................................................................................. 32
1.3.2 Biotin-Synthase ........................................................................................................... 34
1.3.3 Lipoyl-Synthase .......................................................................................................... 35
1.3.4 Methylthiotransferasen ............................................................................................... 36
1.3.5 Molybdopterin-Cofaktor-Biosyntheseprotein A ........................................................... 38
1.3.6 Pyrrolochinolinchinon-Biosyntheseprotein E .............................................................. 39
1.3.7 Radical SAM Reifungsenzyme der Fe-Fe-Hydrogenase HydA .................................. 40
1.3.8 Radical SAM Enzyme, die Glycyl-Radikale generieren .............................................. 42
V II
INHALTSVERZEICHNIS
1.3.9 Butirosin-Biosyntheseprotein N .................................................................................. 44
1.3.10 Reifungsenzyme von Arylsulfatasen ........................................................................ 45
1.4 Aufgabenstellung ........................................................................................................... 47
2.
Materialien ............................................................................................................. 48
2.1 Geräte .............................................................................................................................. 48
2.2 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien ..................................................... 49
2.3 Oligonukleotide ............................................................................................................... 51
2.4 Vektoren .......................................................................................................................... 60
2.4.1 pDG148 ...................................................................................................................... 60
2.4.2 pET-28a(+) ................................................................................................................. 61
2.4.3 pET-48b(+) ................................................................................................................. 61
2.4.4 pETM-10 ..................................................................................................................... 62
2.4.5 pX ............................................................................................................................... 62
2.5 Mikroorganismen ............................................................................................................ 63
2.5.1 Bacillus subtilis 168 .................................................................................................... 63
2.5.2 Escherichia coli BL21 (DE3) ....................................................................................... 63
2.5.3 Escherichia coli TOP10 .............................................................................................. 63
2.5.4 Paenibacillus larvae subsp. larvae BRL-230010 ........................................................ 63
2.6 Kulturmedien ................................................................................................................... 64
2.6.1 LB-Medium ................................................................................................................. 64
2.6.2 HS- und LS-Medium ................................................................................................... 64
3.
Methoden ............................................................................................................... 66
3.1 Molekularbiologische Methoden ................................................................................... 66
3.1.1 Präparation chromosomaler DNA aus B. subtilis 168 ................................................ 66
3.1.2 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli .................................................................. 66
3.1.3 Herstellung von Expressionskonstrukten ................................................................... 67
3.1.4 Mutagenese ................................................................................................................ 67
3.1.5 Chemische Transformation von B. subtilis 168 .......................................................... 69
VI II
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.6 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen ............................................................ 70
3.2 Proteinchemische Methoden ......................................................................................... 70
3.2.1 Fermentation von B. subtilis 168 zur Produktion von Subtilosin A ............................. 70
3.2.2 Hetero- und Homologe Genexpression ...................................................................... 70
3.2.3 Zellaufschluss ............................................................................................................. 72
3.2.4 Proteinreinigung .......................................................................................................... 72
3.2.5 Chemische Rekonstitution von Eisen-Schwefel-Cluster-haltigen Proteinen ............... 77
3.2.6 Reinigung von Subtilosin A durch präparative HPLC ................................................. 77
3.2.7 Reinigung von SerSkfA und von SerSkfA-Varianten durch analytische HPLC ........... 78
3.3 Naturstoffextraktion ........................................................................................................ 79
3.3.1 Extraktion von B. subtilis 168 Zellpellets mittels Methanol ......................................... 79
3.3.2 Extraktion von Kulturüberständen mittels Amberlite XAD16 ....................................... 79
3.4 Biochemische Methoden ................................................................................................ 80
3.4.1 Spaltung der Trx-SkfA-Fusionsproteinvarianten mit der TEV-Protease ..................... 80
3.4.2 SAM-Spaltungsaktivitätsassays .................................................................................. 80
3.4.3 Vorläuferpeptidmodifikationsassays ........................................................................... 81
3.4.4 Thermolysinverdau ..................................................................................................... 83
3.5 Analytische Methoden .................................................................................................... 83
3.5.1 Bestimmung des Eisengehalts von Proteinen ............................................................ 83
3.5.2 Bestimmung des Sulfidgehalts von Proteinen ............................................................ 84
3.5.3 Peptidmassenfingerabdruck ....................................................................................... 85
3.5.4 HPLC-MS .................................................................................................................... 85
3.5.5 HPLC-HRMS .............................................................................................................. 86
3.6 Spektroskopische Methoden ......................................................................................... 89
3.6.1 UV-Vis-Spektroskopie ................................................................................................. 89
3.6.2 EPR-Spektroskopie .................................................................................................... 89
3.7 Kristallisation ................................................................................................................... 90
4.
Ergebnisse ............................................................................................................ 92
IX
INHALTSVERZEICHNIS
4.1 Studien zur Subtilosin A Biosynthese .......................................................................... 92
4.1.1 Klonierung, Expression und Reinigung von AlbA ....................................................... 92
4.1.2 Reinigung der AlbA-Mutanten innerhalb des CXXXCXXC-Motivs ............................. 92
4.1.3 Bestimmung des Eisen- und Schwefelgehalts von AlbA und AlbA-Varianten ............ 93
4.1.4 Bestimmung der SAM-Spaltungsaktivität von AlbA .................................................... 94
4.1.5 Bestimmung der SAM-Spaltungsaktivität von den AlbA-Varianten ............................ 97
4.1.6 Spektroskopische Charakterisierung der in AlbA gebundenen Fe/S-Cluster ............. 97
4.1.7 Massenanalytik des Subtilosin A Vorläuferpeptids SboA ......................................... 100
4.1.8 Bestimmung der von AlbA katalysierten Modifikationen an SboA ............................ 101
4.1.9 Untersuchung der Regiospezifität von AlbA mit Hilfe von Thermolysin ................... 104
4.1.10 Carboxypeptidaseverdau der dreifach verbrückten SboA-Spezies ........................ 107
4.1.11 Vorläuferpeptidmodifikationsassays mit SboA-Varianten ....................................... 108
4.1.12 Modifikationsassays mit der leaderpeptidlosen SboA-Variante ............................. 110
4.1.13 Zeitabhängigkeit der Thioetherbrückenbildung in SboA ......................................... 111
4.1.14 Identifikation der zweiten [4Fe-4S]-Clusterbindungsstelle in AlbA ......................... 112
4.1.15 Interaktionsstudien mit SboA, llSboA, AlbA und AlbA-Varianten ........................... 116
4.1.16 In vivo-System zur Analyse der Produktion von Subtilosin A-Varianten ................ 117
4.2 Studien zur Biosynthese des Sporulation Killing Factors ....................................... 122
4.2.1 Klonierung, Expression und Reinigung von SkfB ..................................................... 122
4.2.2 Expression und Reinigung der SkfBC117A C121A C124A-Mutante .................................... 123
4.2.3 Bestimmung des Eisen- und Schwefelgehalts von den SkfB-Spezies ..................... 123
4.2.4 Bestimmung der SAM-Spaltungsaktivität von SkfB .................................................. 124
4.2.5 Spektroskopische Charakterisierung der in SkfB gebundenen Fe/S-Cluster ........... 126
4.2.6 Herstellung des Vorläuferpeptids des Sporulation Killing Factors ............................ 129
4.2.7 Massenanalytik des SerSkfA Vorläuferpeptids ........................................................ 131
4.2.8 Vorläuferpeptidmodifikationsassays mit SerSkfA und SkfB ..................................... 132
4.2.9 Vorläuferpeptidmodifikationsassays mit SerSkfA-Varianten .................................... 133
4.2.10 Modifikationsassays mit der leaderpeptidlosen SkfA-Variante ............................... 140
X
Description:3.2.7 Reinigung von SerSkfA und von SerSkfA-Varianten durch analytische HPLC .. 78 3.4.2 SAM-Spaltungsaktivitätsassays .
