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粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白锌离子结合域定点突变
尹 隽，单 梁，宋大新，钟 江!
（复旦大学生命科学学院，微生物学与微生物工程系，上海 ())044）
摘要：粉纹夜蛾颗粒体病毒（-.+"/’0)12+$&+ I’7;=9"#8’=F，K;LM）增强蛋白（$;E7;B8;）具有增强病毒感染力的作用。该
蛋白包含一个多种杆状病毒增强蛋白都具有的保守结构域N6OLN，是典型的金属蛋白酶锌离子结合域，但该结构
域对增强蛋白生物活性的重要性尚未得到研究。本研究通过定点突变构建了该结构域的+个氨基酸分别突变为(
种不同氨基酸的共,)种增强蛋白突变体基因，并用杆状病毒载体进行了重组表达。活性测定发现，,)种突变型增
强蛋白大部分都丧失了野生型增强蛋白所具有的降解粉纹夜蛾幼虫围食膜粘蛋白的生物学功能，只有,种（第0位
L突变为C）保留该生物学活性。这一结果表明锌离子结合域对增强蛋白生物活性具有重要作用，也提示增强蛋白
确是一种金属蛋白酶。
关键词：杆状病毒；增强蛋白；金属蛋白酶；围食膜；定点突变
中图分类号：P322 文献标识码：C 文章编号：)0+012(3（2 ())*）,,1,,,,1)+
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杆状病毒（&7B=9"#8’=F）是一种感染昆虫的双链 中发现（N7FE8%"D" 3# $)A，,33,；J"$9#8;\ 3# $)A，
T!C病毒，长期以来被认为是具有很大潜力的生物 ,33+），但近年在多种LM和!]M的基因组中都发现
杀 虫 剂。杆 状 病 毒 分 成 核 型 多 角 体 病 毒 了增强蛋白的类似基因（_8FBE"?? 7;@ /97#8B$\，,33*；
（ ;=B9$"G"9:E$@’"#8’=F，!]M ）和 颗 粒 体 病 毒 N7:7\7[7 3#$)A，,333；‘=H8" 3#$)A，,333；]"GE7% 3#
（I’7;=9"#8’=F，LM）两个属。杆状病毒增强蛋白 $)A，()),），并发现这些增强蛋白对提高病毒感染昆
（$;E7;B8;），又称协同因子（F:;$’I8FD8B ?7BD"’），或病毒 虫的能力有意义（O8 3# $)A，())4）。同时，在一些细
增效因子（#8’=F $;E7;B8;I ?7BD"’），因其能提高一些 菌如耶尔森氏菌、芽孢杆菌中也发现了与杆状病毒
!]M的感染力而得名（Q7%7%"D" 7;@ K7;7@7，,3*5， 增强蛋白具有一定的同源性（()a b4)a）的基因，
,35)；J"$9#8;\ 3# $)A，,33+）。增强蛋白最初在 LM 但它们并没有增强病毒毒性的作用（L799"[7: 3# $)A，
基金项目：国家自然科学基金项目（435*)))2）
作者简介：尹隽，女，,323年0月生，学士，讲师，研究方向为昆虫病毒学，61%789：:8;<=7;>?=@7;A$@=AB;
!通讯作者 C=DE"’?"’B"’’$FG";@$;B$，61%789：<HE";I>?=@7;A$@=AB;
收稿日期 J$B$8#$@：())*1)+1(5；接受日期 CBB$GD$@：())*1)31,*
444! 昆虫学报 4("#5."*6*$*2’(#/’.’(# #"卷
!""#；$%&%’&()**+,-. !" #$/，!""0），在细菌中的具体 接到同样经 3-’ ! 和 /+) ! 双 酶 切 的 质 粒
生物学功能还不清楚。 2PP$!QD6)6，置换其中原有的野生型片段，即得到
关于增强蛋白的作用机理，有两种假说。一种 带有 $)1@$位点 #个氨基酸分别突变的增强蛋白
假说认为增强蛋白是一种金属蛋白酶（1.2+3. !" 基因质粒（图 4），即第 4 位的组氨酸分别突变为天
#$/，4550），可以降解昆虫中肠起防御保护作用的围 冬氨酸和酪氨酸的 2PP$!QD6)6(4$=、2PP$!QD6)6(
食膜的主要蛋白成分———昆虫肠道粘蛋白（’67.89 4$T，第!位的谷氨酸分别突变为丙氨酸和赖氨酸
’69.79’6%* :,8’6，;;<），从而破坏围食膜，增加病毒与 的2PP$!QD6)6()X、2PP$!QD6)6()Y，第V位的亮氨
昆虫中肠细胞接触的机会，提高病毒感染效率 酸分别突变为精氨酸、缬氨酸的 2PP$!QD6)6(1U，
（=.3>7.6 %6? @3%6%?+7，45AA；1.2+3. !" #$/，4550； 2PP$!QD6)6(1I，第F 位的甘氨酸分别突变为丙氨
B.6C !" #$/，4555）。另一种假说则认为增强蛋白可 酸和精氨酸的 2PP$!QD6)6(@X、2PP$!QD6)6(@U，
以同时与病毒囊膜和细胞质膜结合，从而增强病毒 以及第#位的组氨酸分别突变为天冬氨酸和酪氨酸
与中肠细胞的融合（D%6%?%，45A#；E%6C !" #$/， 的 2PP$!QD6)6(#$=、2PP$!QD6)6(#$T。每个质粒
455F）。 都通过测序确认序列的正确性。
与上述第一种假说相一致，许多增强蛋白的氨 !"$ 表达定点突变增强蛋白的重组杆状病毒的构
基酸序列中都带有一个典型的锌离子结合位点 建
$)GG$ :+9’H，是金属蛋白酶的特征性结构域（1.2+3. 上述各野生型和突变型增强蛋白基因质粒的骨
!" #$/，4550）。但该保守域对增强蛋白活性的重要 架均为 2P*,.P%8$’7!Q（;6Z’93+C.6），系构建重组杆状
性还没有得到研究。本研究通过定点突变的方法逐 病 毒 X8<LBI（ 4,"*2&#+)# (#$’1*&.’(# :,*9’8%27’?
个改变了粉纹夜蛾颗粒体病毒（%&’()*+$,-’# .’ @I， 6,8*.+2+*RS.?3+Z’3,7）用的转移载体，带有多角体启动
D6@I）增强蛋白该保守域中的氨基酸，并通过杆状 子和多角体基因两侧的同源重组序列。各增强蛋白
病毒表达系统表达制备的突变蛋白，证明该位点的 基因位于多角体启动子下游，并与 0[$’7 标签序列
氨基酸序列对增强蛋白降解围食膜的能力具有决定 融合，以利筛选。用上述4"个突变型增强蛋白基因
性作用。 质粒及野生型增强蛋白的质粒 2PP$!QD6)6分别与
线性化的杆状病毒 X8<LBI 基因 组 =LX 用
! 材料和方法 Q.**H.89’（6 ;6Z’93+C.6）共转染 JH!4 细胞。转染后 F 天
收集上清，用空斑法挑取 G(C%*显色阴性，不产生多
!"! 细胞、基因和病毒 角体的重组病毒空斑，用50孔板稀释法进一步纯化
草地贪夜蛾 /+*0*+"!&# 1&,2’+!&0# 细胞株 JH!4以 !次。得到4株表达野生型增强蛋白和4"株表达各
含 4"K 小牛血清和抗生素的 D<L(M$ 培养基 突变型增强蛋白的重组病毒。
（J’C:%）培养，温度为 !NO。D6@I 增强蛋白基因质 !"% 重组蛋白的表达分析
粒 2PP$!QD6)6 由 美 国 P+R8. DS+:27+6 ;679’9,9. 用表达野生型和突变型增强蛋白的重组
（;9S%8%，LT）U/ @3%6%?+7 教授惠赠。粉纹夜蛾中肠 X8<LBI分别感染 JH!4 细胞，F 天后收集细胞，用
围食膜由美国康奈尔大学昆虫系 B/ E%6C 博士惠 BP（J 2S+72S%9.(W,HH.3 7%*’6.）轻洗 4遍后，进行变性聚
赠。 丙烯酰胺凝胶电泳（J=J(BX@)）及 E.79.36 W*+9 分
!"# 锌离子结合域氨基酸突变的增强蛋白基因的 析。J=J(BX@) 按标准方法进行，凝胶浓度为 AK。
克隆 E.79.36 W*+9所用第一抗体为兔抗 0[$’7(9%C抗体，第
质粒 2PP$!QD6)6带有完整的 D6@I 增强蛋白 二抗体为碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体。用 PQ;B\
基因。在锌离子结合域 $)1@$附近有一个唯一的 LPD显色。
3-’!位点（图4）。利用该位点设计共4"条引物，在 !"& 增强蛋白活性分析
$)1@$位点中引入定向突变。该组引物分别与上 增强蛋白活性分析以围食膜降解实验进行
游的 /+)!位点的一引物组合，以 2!QD6)6 质粒为 （1.2+3. !" #$/，4550；E%6C %6? @3%6%?+7，455N；李志
模板，进行 BQU。引物序列均见图 4。反应条件为 广等，!""!）。从粉纹夜蛾#龄幼虫中解剖得到围食
5FO V" 7，#AO V" 7，N!O V" 7，共V"个循环。扩增 膜，用蒸馏水漂洗，存于 ] !"O待用。用野生型
的产物（#VN W2）经 3-’!和 /+)!双酶切后，分别连 X8<LBI和44株重组 X8<LBI感染 JH!4 细胞，F 天
$$期 尹 隽等：粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白锌离子结合域定点突变 $$$5
后收集细胞，用!"#缓冲液洗$遍，细胞沉淀悬浮在 中的表达
$%% &’% (()*+& ,-./ 01234 的缓冲液中，反复在液 :FDT!M本身没有增强蛋白类似基因。用带有
!
氮和567水浴中冻融5遍，裂解细胞。对细胞裂解 野生型和突变型增强蛋白基因的转移载体，共$$个
液进行#8#9!:;<和 =>/?>-@ A*)?分析（同 $3B）。根 质粒，分别与线性化的野生型 :FDT!M基因组 8T:
据=>/?>-@ A*)?条带亮度，取适量细胞裂解液，用 ’% 共转染#S’$细胞，经分离、克隆化，得到相应的$$个
(()*+& ,-./ 01234调节到4% &，加入一条围食膜， 重组病毒，分别表达野生型增强蛋白和$%种不同的
!
’67反应 B4 (.@。反应后的样品用 #8#9!:;< 和 突变型增强蛋白。病毒感染细胞样品用 #8#9!:;<
=>/?>-@ A*)?分析，=>/?>-@ A*)? 第一抗体为兔抗粉纹 及=>/?>-@ A*)?分析，结果表明，各重组病毒株都表
夜蛾幼虫肠道粘蛋白 CCD抗体（美国 ")EF> ,G)(0/)@ 达了约$%U V8（含4W端XY1./序列）的野生型和突变
C@/?.?H?> IJ ;-K@KL)/教授惠赠）。第二抗体和显色方 型增强蛋白（图 ’，5），但 <@<P的蛋白水平较低，有
法同上。 降解条带。
!", 增强蛋白的活性分析
! 结果与分析 用围食膜降解法分析了重组突变型增强蛋白的
活性。用表达$% 个重组突变型增强蛋白及野生型
!"# 表达突变增强蛋白的重组$%&’()的构建 增强蛋白的细胞裂解液分别与粉纹夜蛾围食膜共同
在含野生型 ,@;M 增强蛋白基因的质粒 孵育。反应后将反应液进行 #8#9!:;< 和 =>/?>-@
0""1’N,@<@的基础上，通过 !NI 介导的定向突变 A*)?分析，检测围食膜的主要蛋白成分CCD的降解情
法构建了$%个在增强蛋白锌离子结合域的 4 个核 况。未降解的 CCD 系分子量高达 ’%% V8 以上的蛋
白，增强蛋白可以将它降解，形成小分子量的蛋白
心氨基酸发生氨基酸改变的突变型基因，其中每个
氨基酸分别突变成 ’ 个不同的氨基酸，一个与原氨 （&>0)-> !" #$J，$UUX；=K@R K@L ;-K@KL)/，$UU6；李志
基酸的性质接近，另一个差别较大，具体突变见图 广等，’%%5）。=>/?>-@ A*)? 的结果表明野生型增强
$。突变型增强蛋白根据突变前后氨基酸命名，分别 蛋白确能将 CCD 降解为小分子量的蛋白（图 B），但
$%个突变型增强蛋白中，仅突变型 <@;:具有明显
为 <@$18，<@$1O，<@<:，<@<P，<@&M，<@&I，<@;:，
的降解围食膜 CCD的活性，在小分子量区域出现明
<@;I，<@418和<@41O。由于4个核心氨基酸中$，
显的可与抗 CCD抗体发生反应的条带（图 B）。其余
4位都是组氨酸，命名时用数字区分。
突变型增强蛋白均未检测到降解 CCD的活性。
!"! 增强蛋白突变体在重组病毒感染的 *+!#细胞
图$ !NI介导,@;M增强蛋白基因的定点突变图示
Q.RJ $ 8.KR-K()S!NI9(>L.K?>L/.?>9L.->F?>L(H?KR>@>/./)S,@;M>@GK@F.@
...Q 昆虫学报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$ LM卷
图! "#"$%&’(分析重组&)*+%,感染的"-!.细胞表达野生型和突变型增强蛋白
/012 ! (3456770898-:0;<=>46?9<@A=?9=69B?9)090956)8@C09?9=&)*+%,09-6)=6<"-!. )6;;7<6=6)=6<C>"#"$%&’(?9?;>707
"-：未感染细胞 D909-6)=6<)6;;7；*：蛋白分子量标准*8;6)A;?5:601B=@?5E65；(9：表达野生型F9’,增强蛋白的&)*+%,G6)8@C09?9=
&)*+%,6345677091:0;<=>46F9’,69B?9)09；’&，’G，.H#，.HI，(&，(J，KG，K,，LH#，LHI：表达.M种突变型增强蛋白的重组
&)*+%,G6)8@C09?9=&)*+%,6345677091.M@A=?=6<F9’,69B?9)09，56746)=0N6;>2 下图同FB67?@6-85=B6-8;;8:091-01A5672
图O P67=659C;8=分析重组&)*+%,感染的细胞中野生型和突变型增强蛋白的表达
/012 O (3456770898-:0;<=>46?9<@A=?9=69B?9)090956)8@C09?9=&)*+%,$09-6)=6<"-!. )6;;7<6=6)=6<C>P67=659C;8=
图Q P67=659C;8=分析突变型增强蛋白降解RR*的生物活性
/012 Q RR*$<615?<?=089$?)=0N0=>8-@A=?9=69B?9)09<6=6)=6<C>P67=659C;8=
.&：野生型&)*+%,P0;<=>46&)*+%,2
域在后来发现的大部分增强蛋白中也同样存在（表
! 讨论 .）。P?91和 ’5?9?<87（.SSV）进一步证实增强蛋白
作为金属蛋白酶的底物正是昆虫幼虫中肠围食膜的
K64856等（.SST）首先提出增强蛋白是一种金 主要蛋白成分之一 RR*。尽管如此，H(UUH结构域
属蛋白酶，主要依据有两方面，一方面，增强蛋白降 对于增强蛋白活性的必要性并没有得到直接的证
解围食膜的活性受二价阳离子的影响，当有 (’F& 实。
存在时，其降解围食膜的活性被抑制；另一方面，当 本研究以 F9’, 增强蛋白为对象，针对其金属
时各种已知的增强蛋白序列中都带有金属蛋白酶的 蛋白酶特征结构域 H(K’H（组氨酸$谷氨酸$亮氨酸$
特征性锌离子结合结构域 H(UUH。这个特征结构 甘氨酸$组氨酸），用定点突变和杆状病毒表达载体
;;期 尹 隽等：粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白锌离子结合域定点突变 ;;;>
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表! 一些病毒增强蛋白中锌离子结合结构域的氨基酸序列
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锌离子结合域 1&’2$’3序列号 ,$)J%/K"#J*&’($’)"’4 <4 @,2."0.A"4 -+0%&(4，A9：;=<W;=@V
病毒增强蛋白
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构建并表达了 > 个氨基酸分别发生突变的共 ;9 个 7"‘，7" 7，I//#& S，P/’%M H，N(&"%0$’’ P8，6#%$’-*/’ I，:99=V
突变型增强蛋白，每个氨基酸分别突变成一种与之 H($#$)R&#"[$R"/’/T :+3.*0"+$&,6#4)"+0+ ’J)%&/L/%M(&-#/K"#J*&’($’)"’
$’-"R*TJ’)R"/’$%$’$%M*"*K"$&\L#&**"/’"’$’;)0&4"+’%+$+(#6&",#$+I
较类似的和一种差别较大的氨基酸，同时还表达了
’J)%&/L/%M(&-#/K"#J*#&)/0,"’$’R4 <4 E.,4 =#"&(4，?<：;:=W;=:V
野生型N’1! 增强蛋白。通过 OPOBG816和 Q&*R&#’ 7"+1，]"’U，+(/’.U，:99:V X&)/0,"’$’R&\L#&**"/’$’-$)R"K"RM$’$%M*"*
,%/R验证了各重组增强蛋白的表达，其中 6’6S的表 /TN’1!&’($’)"’"’8)IFG!4 ;$0+=#"&(&4#$+D#,#$+，;（@ <）：=:EW
==9V［李志广，尹隽，钟江，:99:V N’1!增强蛋白在8)IFG!中
达水平较低，并有降解，提示该突变可能影响蛋白的
的表达和活性分析4 中国病毒学，;（@ <）：=:EW==9］
稳定性。 G&’.U，+(/’.U，1#$’$-/*XX，;AAAV N(&,$)J%/K"#J*&’($’)"’ "’)#&$*&*
在此基础上，通过围食膜降解实验，比较了野生 R(&L�&$,"%"RM /T "’*&)R L&#"R#/L(") 0$R#"\4 <4 @,*.$0 -%9*#&(4，<>
（;）：;>AW;EEV
型和各突变型增强蛋白的生物活性。结果表明，
G/L($0 5U，2"*)(/TT PO，O%$K")&3 UI，:99;V 2/R( 893+,0"#+ /#*’+"
56715结构域确实对 N’1!增强蛋白降解围食膜中 ’J)%&/L/%M(&-#/K"#J* &’($’)"’ .&’&* )/’R#",JR& R/ K"#$% L/R&’)M4 <4
CCI蛋白具有关键作用。几乎所有的突变型增强蛋 =#"&(4，@>：?E=AW?E<?V
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白都丧失了金属蛋白酶的活性，只有第 < 位甘氨酸
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突变为丙氨酸的突变型（6’18）具有类似野生型增 .&’&*4 <4 E.,4 =#"&(4，@E：:EA=W:@9>V
强蛋白的降解 CCI活性。由于甘氨酸与丙氨酸结构 N$’$-$]，;A?>V 8 *M’/L*"* /T *RJ-"&* /’ R(& *M’&#."*R") L#/L&#R"&* /T $’
非常类似，这一结果是可以预料的。同时在一些天 "’*&)R,$)J%/K"#J*：$ R#",JR& R/ 6-Y$#- 84 OR&"’($J*4 <4 @,2."0.A"4
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然增强蛋白中也有第 < 位是 8 的，如 5%&"#*0&,.)"+ Q$’.G，1#$’$-/*XX，;AA@V 8’"’R&*R"’$%0J)"’"*R(&R$#.&R*J,*R#$R&T/#
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:4 $&,6#4)"+0+ IFG!B2的增强蛋白（表;）。 EA?:V
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本研究证实了 N’1! 增强蛋白的 56715 结构
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域与其降解围食膜的活性有直接关系。这一结果也 L&#"R#/L(") 0&0,#$’& /T T/J# %&L"-/LR&#$’ "’*&)R*4 <4 E.,4 =#"&(4，
再次提示增强蛋白确是通过降解围食膜来提高病毒 @>：;AE;W;AE@V
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感染昆虫的能力。这些结果可能为有效地利用增强
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蛋白提高病毒杀虫剂的杀虫效率提供理论依据。 ),#’),$0+4 <4 @,2."0.A"4 -+0%&(4，=;：<?W>EV
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参 考 文 献（8&1&7&*,&.） )$L*J%&)/0L/’&’R*，"’L$#R")J%$#R(&*M’&#."*R")T$)R/#，"’R(&/))%J*"/’
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W?;<9V （责任编辑：黄玲巧）
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