SADE ve SAGE ve Gen Ekspresyonunun Seri Analizi

19 Pages·2013·0.54 MB·Turkish

SADE ve SAGE
ve Gen Ekspresyonunun Seri
Analizi
Prof.Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI
Gen Anlatımının Belirlenmesi
• DNA mikroçalışmaları
• Makroçalışmaları
• EST (Expressed sequence tag)
• Gen anlatımının seri analizi (SAGE)
Gen anlatımının seri analizi (SAGE)
teknolojisi Velculescu tarafından 1995
yılında geliştirilmiştir.
SAGE, transkriptin miktarı ve çeşidi ile ilgili
detaylı ve hızlı bilgi vermektedir.
SAGE, mRNA saflaştırılması, cDNA
taglarının oluşturulması, izolasyonu ve PCR
ile çoğaltımı basamaklarından oluşmaktadır.
SAGE nin etkinliğini arttırmak için PCR
döngü sayısı arttırılarak elde edilen ürünün
miktarının arttırılması amaçlanmaktadır.
• SAGE yönteminin mikroadaptasyon formu
olan SADE tekniğinde ise az sayıdaki
(30.000 – 50.000) hücrede nicel gen
anlatımı belirlenebilmektedir.
• Her iki metod arasında az miktarda cDNA
elde edilmektedir. Bunun sebebi pekçok
faktör tarafından biotinalat DNA
bağlanımının değişmesidir. Bu faktörler,
serbest biotin ve fenolün varlığı, biotinilatlı
DNA parçasının uzunluğu, kompozisyonu
ve biotin molekülü ile oligo (dT) arasındaki
mesafedir.
• Bu metodlar büyük miktardaki biyolojik
materyallerin (1-5 mikro gram polyA mRNA)
analizini gerçekleştirebilecek şekilde
tasarlanmıştır. Bununla birlikte, memeli dokuları
özel fizyolojik fonksiyonları ve özel gen anlatımı
paternlerine sahip farklı hücre tiplerinden
oluşmaktadır. Bu da yüksek organizmada geniş
skaladaki anlatım bilgisinin yorumlanmasının
karmaşık hale geldiğini göstermektedir. Bu
sebepten dolayı belirlenmiş hücre popülasyonunun
analizi için daha uygun metotların çıkarılması
gerekmektedir.

SAGE Yapım Aşamaları
• Boncuklarla RNAs yakalanması
• cDNA içinde RNA nın çevrilmesi
• Bir kısımda iki tane tag bulunur
• Di-tag ın PCR ile milyonlarca kopyası yapılır
• Uzun bir concatamer içindeki modüller ve yapışkan Di-tag
birlikte uzaklaştırılır
• Concatamerler bakteri içine konur ve milyonlarca kopyası
elde edilir.
• En iyi konsatamerler bulunur ve dizilemesi yapılır
• Kaç tane cDNA olduğunun belirlenmesi bilgisayar
ortamında yapılır ve sayılır
• RNA dan elde edilen gen ile herbir tag ın dizisi eşleştirilir