Rekrutierung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase 2 zum M3-ACh-Rezeptor Identifizierung

178 Pages·2014·5.48 MB·German

by  Valerie Wolters

Institut für Pharmakologie und Klinische Pharmazie
Fachbereich Pharmazie

Rekrutierung der
G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase 2
zum M -ACh-Rezeptor
3

Identifizierung des Einflusses von Gα und
q
Erstellung eines kinetischen Modells

Dissertation

zur Erlangung des
Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)

dem Fachbereich Pharmazie
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von

Valerie Wolters
aus Aachen

Marburg 2014
Erstgutachter: Prof. Dr. Moritz Bünemann
Zweitgutachter: Prof. Dr. Jens Kockskämper

Eingereicht am 14.10.2014
Tag der mündlichen Prüfung am 26.11.2014

Hochschulkennziffer: 1180
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................... VII
1 Einleitung ............................................................................................................................ 1
1.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) ................................................................ 1
1.1.1 Acetylcholin-Rezeptoren (AChR) ........................................................................ 2
1.1.2 Muskarinerge Acetylcholin-Rezeptoren (M-AChR) ............................................ 3
1.1.2.1 Struktur und Funktion des M -Acetylcholin-Rezeptors ............................... 4
3
1.1.2.2 Pathophysiologie der muskarinergen Acetylcholin-Rezeptoren ................... 4
1.2 G-Proteine .................................................................................................................... 5
1.2.1 G-Protein Klassen ................................................................................................ 7
1.2.2 Gα -Proteine ......................................................................................................... 7
q
1.2.2.1 Struktur von Gα ........................................................................................... 8
q
1.2.2.2 Funktionen von Gα ...................................................................................... 9
q
1.2.2.3 Regulation der Gα -Aktivität ...................................................................... 12
q
1.2.2.4 Kompartimentalisierung des G -Signals ..................................................... 12
q
1.2.2.5 Physiologie der Signalweiterleitung über Gα ............................................ 12
q
1.2.3 Gβγ-Untereinheiten ............................................................................................ 13
1.2.3.1 Struktur von Gβγ ......................................................................................... 13
1.2.3.2 Funktionen von Gβγ .................................................................................... 14
1.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen ..................................................................... 15
1.3.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) .............................................. 16
1.3.1.1 Struktur der GRK2 ...................................................................................... 16
1.3.1.2 Beeinflussung der GRK2-Aktivität ............................................................. 19
1.3.2 Physiologische Funktionen der GRKs ............................................................... 19
1.4 Interaktionsstudien ..................................................................................................... 21
1.4.1 Fluorophore ........................................................................................................ 21
III
Inhaltsverzeichnis
1.4.1.1 Fluoreszenzproteine .................................................................................... 22
1.4.2 Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) .................................................. 23
1.4.2.1 FRET-Experimente ..................................................................................... 24
1.5 Fragestellung ............................................................................................................. 27
2 Material und Methoden ..................................................................................................... 28
2.1 Material ...................................................................................................................... 28
2.1.1 Verbrauchsmaterialien ....................................................................................... 28
2.1.2 Reagenzien und Enzyme .................................................................................... 28
2.1.3 Plasmide ............................................................................................................. 31
2.1.3.1 Klonierungsstrategien ................................................................................. 33
2.1.4 Primer ................................................................................................................. 34
2.1.5 Bakterien ............................................................................................................ 35
2.1.6 Eukaryotische Zelllinien .................................................................................... 35
2.2 Methoden ................................................................................................................... 36
2.2.1 Molekularbiologische Methoden ........................................................................ 36
2.2.1.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .............................................................. 36
2.2.1.2 Mutagenese ................................................................................................. 37
2.2.1.3 Herstellung von LB-Medium und LB-Agar-Platten ................................... 38
2.2.1.4 Herstellung chemisch kompetenter Escherichia coli-Bakterien ................. 38
2.2.1.5 Transformation von kompetenten Escherichia coli-Bakterien ................... 39
2.2.1.6 DNA-Präparation (Midi) ............................................................................. 39
2.2.1.7 DNA-Präparation (Mini) ............................................................................. 40
2.2.1.8 Bestimmung der DNA-Konzentration ........................................................ 41
2.2.1.9 Restriktionsverdau ...................................................................................... 41
2.2.1.10 Agarosegelelektrophorese ........................................................................... 42
2.2.1.11 Gelaufreinigung .......................................................................................... 43
IV
Inhaltsverzeichnis
2.2.1.12 Ligation ....................................................................................................... 43
2.2.1.13 Sequenzierung ............................................................................................. 44
2.2.2 Methoden der Zellkultur ..................................................................................... 45
2.2.2.1 Zellkultur ..................................................................................................... 45
2.2.2.2 Transiente Transfektion .............................................................................. 45
2.2.2.3 Ausplattieren auf Deckgläschen ................................................................. 46
2.2.3 Proteinbiochemische Methoden ......................................................................... 47
2.2.3.1 Western-Blot ............................................................................................... 47
2.2.4 Fluoreszenzmikroskopische Methoden .............................................................. 50
2.2.4.1 Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer ........................................................ 50
2.2.4.2 Translokations-Experimente ....................................................................... 57
2.2.5 Statistik und Software ........................................................................................ 58
3 Ergebnisse ......................................................................................................................... 59
3.1 Einfluss von Gα auf die Rekrutierung der G-Protein-gekoppelten-Rezeptorkinase 2
q
(GRK2) zum M -ACh-Rezeptor .................................................................................. 59
3
3.1.1 Einfluss der G -Proteine auf die Translokation der GRK2 ................................ 59
q
3.1.1.1 G-Protein-bindereduzierte GRK2-Mutanten .............................................. 60
3.1.2 Agonistabhängige Rekrutierung der GRK2 zum M -ACh-Rezeptor ................. 63
3
3.1.2.1 Einflussfaktoren auf die Größe des FRET-Signals ..................................... 68
3.1.2.2 Einfluss der G -Protein-Untereinheiten ...................................................... 72
q
3.1.2.3 GRK2-bindedefiziente Mutante Gα (P185K) ............................................ 75
q
3.1.3 Kinetik der Membrantranslokation der GRK2 ................................................... 76
3.1.4 Interaktion von GRK2 mit Gβγ und Gα ............................................................ 79
q
3.1.4.1 GRK2-Gβγ-Interaktion ............................................................................... 80
3.1.4.2 GRK2-Gα -Interaktion ................................................................................ 81
q
3.1.4.3 Vergleich der „Onset“- und „Offset“-Kinetik ............................................. 83
V
Inhaltsverzeichnis
3.1.5 Konzentrations-Wirkungs-Kurven ..................................................................... 87
3.1.6 Funktionelle Effekte der Gα -Bindung an die GRK2 ........................................ 89
q
3.1.7 Effekte von Gα auf die Interaktion der GRK2 mit dem M -AChR .................. 94
q 2
3.2 Erstellung eines kinetischen Modells der Rekrutierung der G-Protein-gekoppelten
Rezeptorkinase 2 zum M -ACh-Rezeptor .................................................................... 96
3
3.2.1 Interaktion von Gβγ mit M -AChR .................................................................... 96
3
3.2.2 Interaktion von Gα mit M -AChR .................................................................. 103
q 3
3.2.3 Interaktion zwischen Gα und Gβγ .................................................................. 104
q
3.2.4 Konzentrations-Wirkungs-Kurven ................................................................... 111
3.2.5 Kinetik der GRK2-Rekrutierung zum M -ACh-Rezeptor bei unterschiedlichen
3
Agonist-Konzentrationen ................................................................................. 115
3.3 Ergebnisanhang: Charakterisierung von Gα (P185K) ............................................ 120
q
4 Diskussion ....................................................................................................................... 124
4.1 Einfluss von Gα auf die agonistabhängige Rekrutierung der GRK2 zum M -ACh-
q 3
Rezeptor ................................................................................................................... 126
4.2 Kinetische Beschreibung der Rekrutierung der GRK2 zum M -AChR .................. 131
3
4.3 Schlussfolgerung ..................................................................................................... 135
5 Zusammenfassung ........................................................................................................... 137
6 Summary ......................................................................................................................... 139
7 Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 141
8 Abbildungsverzeichnis .................................................................................................... 160
9 Tabellenverzeichnis ........................................................................................................ 165
Publikationen .......................................................................................................................... 167
Lebenslauf .............................................................................................................................. 168
Erklärung ................................................................................................................................ 169
Danksagungen ........................................................................................................................ 170

VI
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
α -AR α -adrenerger Rezeptor
2A 2A
ACh Acetylcholin
AChR Acetylcholin-Rezeptor
ANOVA „analysis of variance“
a.u. willkürliche Einheiten („arbitrary units“)
β-AR β-adrenerger Rezeptor
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
Cer Cerulean
CFP cyan fluoreszierendes Protein
COPD chronisch obstruktive Lungenerkrankung
DAG Diacylglycerol
DNA Desoxribonukleinsäure
EC halbmaximal effektive Konzentration
50
E. coli Escherichia coli
ERK Enzymfamilie („extracellular signal-regulated kinases“)
F Fluoreszenzintensität
FRET Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer
FlAsH Proteinsequenz („fluorescein arsenical hairpin binder“)
G-Protein GTP-bindendes Protein
GAP GTPase aktivierendes Protein
GDP Guanosindiphosphat
GFP grün fluoreszierendes Protein
GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor
GRK G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase
GTP Guanosintriphosphat
HEK-Zellen humane embryonale Nierenzellen
il intrazelluläre Schleife
IP Inositol-1,4,5-triphosphat
3
kb Kilobasen
kDa Kilo-Dalton
VII
Abkürzungsverzeichnis
LARG „leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor“
M-AChR muskarinerger Acetylcholin-Rezeptor
mTurq mTurquoise
MW Mittelwert
NE Norepinephrin
PI3K Phosphoinositid-3-Kinase
PH-Domäne Pleckstrin-homologe Domäne
PLC Phospholipase C
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
RGS „regulator of G-protein signalling“
RH-Domäne RGS-homologe Domäne
RhoGTPase „Ras-homologue-GTPase“
RhoGEF „RhoGTPase nucleotide exchange factor“
RNA Ribonukleinsäure
ROI Messfeld („region of interest“)
rpm Umdrehungen pro Minute
S.E.M. Standardfehler
SI Signalsequenz
t Halbwertszeit
½
TM Transmembrandomäne
wt Wildtyp
YFP gelb fluoreszierendes Protein
ZNS zentrales Nervensystem
VIII
Einleitung
1 Einleitung
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden die größte Gruppe innerhalb der transmembranären
Rezeptoren. Sie kommen in großer Vielfalt bei vielen Organismen vor und ermöglichen die
spezifische Bindung zahlreicher Liganden an der Außenseite der Zelle. Aktivierte Rezeptoren
leiten das Signal an G-Proteine im Inneren der Zelle weiter, die mit zahlreichen Effektor-
Proteinen interagieren und dadurch die unterschiedlichsten Effekte vermitteln können.
Wichtige Effektoren sind zum Beispiel Rezeptorkinasen, die entscheidend an der Regulation
der Signalweiterleitung beteiligt sind. Der Signalweg G-Protein-gekoppelter Rezeptoren ist
außerdem Ziel vieler pharmakologisch wirksamer Substanzen und steht im Mittelpunkt der
Erforschung neuer pharmakologischer Angriffspunkte. Wichtige Vorteile G-Protein-
gekoppelter Rezeptoren als Zielstruktur bestehen in ihrer spezifischen Expression in
definierten Zelltypen und der selektiven Interaktion von Ligand und Rezeptor. Das detaillierte
Verständnis des Signalwegs ist deshalb sehr wichtig für die Entwicklung spezifischer
Arzneistoffe mit möglichst geringem Spektrum an unerwünschten Wirkungen.
1.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)
Die Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren umfasst mehr als 800 verschiedene
Rezeptoren und ist an praktisch allen wichtigen physiologischen Vorgängen beteiligt
(Fredriksson et al., 2003). Ihre Aufgabe besteht darin, Signale von extrazellulären
Signalmolekülen, wie Neurotransmittern und Hormonen, die die Zellmembran nicht passieren
können, ins Innere der Zelle weiterzuleiten. Um diese Aufgabe erfüllen zu können,
durchspannen GPCRs die Membran und stellen sowohl extrazellulär als auch intrazellulär
Interaktionsstellen bereit. Ihr strukturelles Hauptmerkmal sind sieben transmembranäre
α-Helices, die die Rezeptoren in der Zellmembran verankern (Rosenbaum et al., 2009). Die
Transmembrandomänen sind durch drei extrazelluläre und drei intrazelluläre Schleifen
verbunden. Der N-Terminus bildet eine Schleife in den Extrazellulärraum, während der
C-Terminus ins Zellinnere ragt. Für die Bindung des Agonisten sind in den meisten Fällen die
extrazellulären Bereiche der Transmembrandomänen verantwortlich. Eine Ausnahme stellen
die Glykoprotein-Rezeptoren dar, deren Liganden-Bindestelle im N-Terminus liegt
(Fredriksson et al., 2003). An der Interaktion mit den nachgeschalteten Signalmolekülen, den
G-Proteinen, sind verschiedene zytoplasmatische Bereiche des Rezeptors beteiligt (Hu et al.,
1
Einleitung
2010). Durch die Bindung eines Agonisten an den Rezeptor wird dieser aktiviert. Dies führt
zu einer Konformationsänderung des Rezeptors (hauptsächlich in TM und TM ), wodurch
3 4
die Weiterleitung des Signals an das G-Protein ermöglicht wird (Nygaard et al., 2009). Zur
Unterbrechung der Signalweiterleitung spielt insbesondere das GRK-Arrestin-System eine
Rolle (Hausdorff et al., 1990). G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRK) förderen durch
Phosphorylierung der aktivierten GPCRs die Bindung von Arrestin, das daraufhin sterisch die
Bindung von G-Proteinen verhindert sowie eine Rezeptor-Internalisierung bewirkt (Krupnick
und Benovic, 1998). Dieser Mechanismus wird auch als homologe Desensibilisierung
bezeichnet. Zusätzlich werden G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auch agonistunabhängig
durch andere Kinasen, wie die Proteinkinase A (PKA) und die Proteinkinase C (PKA),
phosphoryliert, was als heterologe Desensibilisierung bezeichnet wird (Benovic et al., 1985).
Die Einteilung der verschiedenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren kann nach
unterschiedlichen Systemen erfolgen. Nach phylogenetischen Kriterien können G-Protein-
gekoppelte Rezeptoren in fünf verschiedene Familien eingeteilt werden: Rhodopsin, Sekretin,
Adhäsion, Glutamat und Frizzled/Taste2 (Lagerstrom und Schioth, 2008).
1.1.1 Acetylcholin-Rezeptoren (AChR)
Acetylcholin ist ein wichtiger Neurotransmitter im menschlichen Körper. Es ist
Überträgerstoff an der Präsynapse von sympathischen Neuronen, an der Prä- und Postsynapse
von para-sympathischen Neuronen und an der Motorischen Endplatte (Haga, 2013). Wichtige
Strukturmerkmale für die Interaktion mit Acetylcholin-Rezeptoren sind ein quartärer
Stickstoff und eine Estergruppe des Liganden. Rezeptoren für Acetylcholin können in den
nikotinergen und den muskarinergen Typ unterschieden werden. Nur bei den muskarinergen
Rezeptoren handelt es sich um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, während nikotinerge ACh-
Rezeptoren Ionenkanal-gekoppelte Rezeptoren sind (Wess et al., 2007). Muskarinerge ACh-
Rezeptoren werden z.B. auf postganglionären parasympathischen Neuronen und
parasympathisch innervierten Organen exprimiert, während nikontinerge ACh-Rezeptoren auf
präganglionären Neuronen und Skelettmuskelzellen zu finden sind (Haga, 2013). Für den
Neurotransmitter Acetylcholin stehen also auf unterschiedlichen Zelltypen verschiedene
Rezeptoren zur Verfügung. Dadurch kann Acetylcholin eine ganze Bandbreite
gewebespezifischer Signale vermitteln.
2