PROTEOMIC STRATEGY FOR BIOMARKER DISCOVERY ETH ZURICH Doctor of Sciences ...

161 Pages·2009·11.15 MB·English

by  Ralph Schiess

ETH Library
Proteomic strategy for biomarker
discovery
Doctoral Thesis
Author(s):
Schiess, Ralph
Publication date:
2008
Permanent link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-005726127
Rights / license:
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DISS. ETH Nr. 1 8 0 9 7

PROTEOMIC STRATEGY FOR BIOMARKER DISCOVERY

A dissertation submitted to the
ETH ZURICH
for the degree of

Doctor of Sciences

presented by

RALPH SCHIESS

Dipl. biochem., UZH
born March 26, 1978
citizen of Herisau (Appenzell A.Rh.)

accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Ruedi Aebersold, examiner
Prof. Dr. Markus Aebi, co-examiner
PD Dr. Hanno Langen, co-examiner

2008

Abstract

The greatest benefits for patients are likely to be realized from the monitoring and management of
early stage disease rather than from treatment of late stage disease. This concept, often called preventive
medicine, has been a vision for many years. Among the strategies that have the highest potential to realize
the promises of preventive medicine is the detection of prognostic and diagnostic protein signatures in
blood plasma and other body fluids. Due to its high sensitivity and high-throughput, mass spectrometry
(MS) is the method of choice for the identification and accurate quantification of the proteins contained in
complex sample mixtures. Therefore, MS is expected to be a key technology for the discovery of new
protein-based biomarkers. Yet despite intensive interest and investment, only a few protein biomarkers
are used in clinical practice, and the rate of introduction of new biomarkers into clinical practice is
falling. The high complexity and large dynamic range of blood plasma proteins currently prohibits the
sensitive and high-throughput profiling of disease and control plasma proteome sample sets large enough
to reliably detect disease indicating differences. To circumvent these technological limitations I describe
here a new two-stage strategy for the MS assisted discovery, verification and validation of disease
biomarkers.
In an initial discovery phase glycoproteins with distinguishable expression patterns in control and
diseased tissue are detected and identified. In the second step the proteins identified in the initial phase
are subjected to targeted MS analysis in plasma samples, using the highly sensitive and specific selected
reaction monitoring (SRM) technology. Since glycosylated proteins, such as those secreted or shed from
the cell surface, are likely to reside and persist in blood, the two-stage strategy is focused on the
quantification of tissue derived glycoproteins in plasma. The focus on the glyco-proteome not only
reduces the complexity of the samples, but also targets an information-rich subproteome which is relevant
for remote sensing of diseases in the plasma.
First, I established a strategy for the consecutive analysis of O- in addition to N-glycoproteins. While
the enrichment for N-glycoproteins was already established before, I set out to increase the coverage of
the glyco-proteome by the selective identification of O-glycoproteins. Then, in order to test our
hypothesis that the glyco-proteome reflects perturbations in intracellular signaling systems, I investigated
the changes in the cell surface glyco-proteome upon stimulation in a well-defined system of Drosophila
melanogaster cells. Finally, the glycoprotein based biomarker discovery and validation workflow
presented here was applied towards the robust and successful identification of human biomarkers for
i
prostate cancer diagnosis. Monitoring the identified set of protein biomarker candidates in the blood
plasma of selected patient groups allowed for the sensitive and specific identification of the patient subset
with localized prostate cancer. Conclusively, the results presented here outline a new and successful
strategy for the remote sensing of protein biomarker candidates in blood by MS-based technologies,
which might/should influence decisions on future proteomics based biomarker discovery approaches.
ii
Zusammenfassung

Die größten Vorteile für Patienten werden wahrscheinlich durch die Überwachung und Behandlung
früh erkannter Krankheiten und nicht von der Behandlung von fortgeschrittenen Krankheiten erzielt
werden. Dieses Konzept, häufig auch Präventivmedizin genannt, ist eine Vision seit vielen Jahren. Unter
den Strategien, die das größte Potenzial haben um die Versprechen der Präventivmedizin zu erfüllen, ist
die Entdeckung von prognostischen und diagnostischen Proteinsignaturen im Blutplasma und anderen
Körperflüssigkeiten. Wegen seiner hohen Empfindlichkeit und hohen Durchsatzes ist die
Massenspektrometrie (MS) die Methode der Wahl für die Identifizierung und genaue Quantifizierung der
in komplizierten Gemischen enthaltenen Proteine. Deshalb ist MS eine Schlüsseltechnologie für die
Entdeckung von neuen auf Proteinen basierenden Biomarkern. Trotz des verstärkten Interesses und
großen Investitionen werden heute nur wenige Proteinbiomarker in der klinischen Praxis verwendet, und
die Rate der Einführung von neuen Biomarkern in die klinische Praxis sinkt. Die hohe Komplexität und
große dynamische Konzentrationsspanne von Blutproteinen verunmöglichen zurzeit die empfindliche
Analyse einer großen Anzahl an gesunden und kranken Blutproben um Krankheitsindikatoren zuverlässig
zu entdecken. Um diese technologischen Einschränkungen zu umgehen, beschreibe ich hier eine neue
Zwei-Stufen-Strategie für die auf MS basierende Entdeckung, Überprüfung und Validierung von
Biomarkern.
In einer ersten Entdeckungsphase werden Glykoproteine mit unterschiedlichen Expressionsmustern in
gesundem und krankem Gewebe entdeckt und identifiziert. Im zweiten Schritt werden die in der ersten
Phase identifizierten Proteine mit gezielten MS-Messungen in Blutproben analysiert. Dabei wird die hoch
empfindliche und gezielte SRM-Technologie (Selected Reaction Monitoring) angewendet. Glykosylierte
Proteine werden vorwiegend sekretiert oder sie befinden sich an der Zelloberfläche, von wo sie leicht
abgelöste werde können. Deshalb ist es sehr wahrscheinlich, dass die vom Gewebe abgegebenen
Glykoproteine mittels der Zwei-Stufen-Strategie im Blut wieder gemessen werden können. Der Fokus auf
das Glykoproteom reduziert nicht nur die Komplexität der Proben, sondern nimmt auch ein
informationreiches Subproteom ins Visier, welches für die indirekte Diagnose von Krankheiten im Blut
wertvoll ist.
Zuerst entwickelte ich eine Strategie für die gemeinsame Analyse von O- und N-glykosylierten
Proteinen. Während die Anreicherung für N-Glykoproteine bereits etabliert war, versuchte ich die
Abdeckung des Glykoproteoms durch die zusätzliche Identifizierung von O-Glykoproteinen zu
vergrößern. Danach untersuchte ich die Veränderungen im Glykoproteom an der Zelloberfläche
iii
hervorgerufen durch bestimmte Stimulierungen von Zellen der Taufliege (Drosophila melanogaster).
Dies untersuchte ich um unsere Hypothese zu prüfen, dass das Glykoproteom Veränderungen in
intrazellulären Signalsystemen widerspiegelt. Schließlich wurde die Bedeutung der auf Glykoproteinen
basierenden Strategie zur Identifizierung von Biomarkern durch die robuste und erfolgreiche
Identifizierung von Biomarkern für die Prostatakrebs-Diagnose im Menschen bewiesen.
Zusammengefasst zeigen die erzielten Resultate eine neue und erfolgversprechende auf MS basierende
Strategie für die Identifizierung von Proteinbiomarkern zur Krebsdiagnose im Blut, welche die
zukünftigen Anstrengungen in diesem Bereich beeinflussen sollte/könnte.
iv
Abbreviations
AQUA Strategy for the absolute quantification of proteins
BH Biocytin hydrazide
BPH Benign prostatic hyperplasia
CA Cysteamine
CD Clusters of differentiation
CID Collision-induced dissociation
CSC Cell Surface Capturing
cKO Conditional knock-out
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ESI Electrospray ionization
GO Gene ontology
HRPC Hormone refractory prostate cancer
HSPC Hormone sensitive prostate cancer
ICPL Isotope coded protein label
IHC Immunohistochemistry
InR Insulin receptor (CG18402)
LC Liquid chromatography
locCaP Localized prostate cancer
LTQ-FT Linear ion-trap Fourier transform ion cyclon resonance mass spectrometer
m/z Mass to charge [Da]
MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization
MS Mass spectrometry
MS1 feature MS1 peak representing a potential peptide ion
MS/MS Tandem mass spectrometry
N-, O-glycosites A peptide that is N- or O-glycosylated in the intact protein in its de-glycosylated form
NxS/T motif Amino acid sequence of asparagine followed by any amino acid (except proline) and
either serine or threonine
O-GlcNAc O-linked β-N-acetylglucosamine
PIN Prostatic intraepithelial neoplasia
PM Plasma membrane
PNGase F N-glycosidase F
PSA Prostate specific antigen
RT-PCR Reverse transcribed poly chain reaction
SPEG Solid-phase extraction of glycopeptides
SRM Selected reaction monitoring (also called MRM)
TM Transmembrane
TMA Tissue microarray
TOF Time-of-flight
TPP Trans Proteomic Pipeline

v
vi
Danksagung

Während den 4 Jahren meiner Doktorarbeit haben mich unzählige Leute begleitet. Einige möchte ich
hier speziell erwähnen, allen anderen, welche ich nicht vergessen habe, Danke ich für ihre Unterstützung.
Prof. Dr. Ruedi Aebersold, der es mir ermöglicht hat diese Arbeit unter seiner Leitung durchzuführen,
möchte ich ganz herzlich für seine hohe Fachkompetenz und menschliche Art danken. Während meiner
Zeit als Doktorand stand er mir fast rund um die Uhr mit wissenschaftlichen Anregungen und Hilfe zur
Seite, was mich stets motiviert hat. Ruedi hat mich sowohl als Mensch wie auch als Wissenschaftler
inspiriert.
Weiter möchte ich mich bei meinem Doktoratskomitee bedanken. PD Dr. Hanno Langen und Prof. Dr.
Markus Aebi haben diese Arbeit durch ihre kritischen Anregungen und kompetenten Diskussionen bei
unseren Treffen geprägt und mir neue Perspektiven aufgezeigt.
Dr. Bernd Wollscheid danke ich ganz besonders für die tolle wissenschaftliche Zusammenarbeit und
gute Freundschaft. Seine tolle Art wissenschaftliche Probleme anzugehen und über themenübergreifende
Fragen zu diskutieren hat zu manch spannendem Gespräch, manchmal auch mit einem Glas Bier, geführt.
Der E56-Gang, Reto Ossola und Dr. Alexander Schmidt, sei für die tolle Laboratmosphäre und
erfrischenden LSE (Lab Social Event)-Abende gedankt. Reto und Alex standen mir stets mit Rat und Tat
zur Seite und haben einen wesentlichen Anteil am guten Gelingen dieser Arbeit. Reto war ein treuer
Begleiter seit der ersten Stunde in Seattle. Alex hat durch seine Kompetenz in MS und seine Kunststücke
auf dem Wakeboard geglänzt.
Reto Wijker, meinem Masterstudenten, muss ich ein dickes Lob aussprechen. Er hat durch seine
positive und akribische Art, einen wichtigen Bestandteil zu dieser Arbeit beigetragen und die gegebenen
Freiheiten exzellent genutzt.
Dr. Lukas Müller und Dr. Bernd Bodenmiller, die beide ihre Doktorarbeit mit mir begonnen haben,
gratuliere ich, dass sie es vor mir geschafft haben, die Doktorwürden zu erlangen. Lukas hat durch seine
hilfsbereite Art manch unangenehme Informatikarbeit diskussionslos erledigt und mit seinen
„Programming Skills“ Excel überflüssig gemacht. Er war zudem ein treuer Linksaußen und guter DJ.
Bernd war stets für einen Schwatz zu haben. Seine freundliche Ausstrahlung und ausgeprägte
wissenschaftliche Faszination schafften es immer wieder, mich zu motivieren, auch wenn er versuchte,
mir die Biomarker zu klauen.
vii