Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe

199 Pages·2017·5.4 MB·German

by  Zwicker, Paula

Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der
Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von
Paula Zwicker
geboren am 13.04.1988
in Görlitz

Greifswald, 22. August 2017
Dekan: Prof. Dr. Werner Weitschies

1. Gutachter: Prof. Dr. Ulrike Lindequist
2. Gutachter: Prof. Dr. Julia Bandow

Tag der Promotion: 17.11.2017

Der Weg
wächst im Gehen
unter deinen Füßen
wie durch ein Wunder

Reinhold Schneider

Inhalt I
Inhalt

Abbildungsverzeichnis ............................................................................................. IV
Tabellenverzeichnis ................................................................................................. VI
Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... VIII
1 Einleitung und Zielstellung .................................................................................. 1
2 Theoretische Grundlagen ................................................................................... 3
2.1 Das Immunsystem, Immuntoxizität und das 3R-Prinzip .............................. 3
2.2 Omics-Technologien für Immuntoxizitätsuntersuchungen ........................... 6
2.2.1 In vitro-Immuntoxizitätsbestimmung .................................................... 6
2.2.2 Transkriptomanalysen für die Toxizitätsbestimmung ............................ 7
2.2.3 Das humane Proteom und Toxicoproteomics ...................................... 9
2.3 Zellen und Testsubstanzen ....................................................................... 17
3 Material und Methoden ..................................................................................... 23
3.1 Material .................................................................................................... 23
3.1.1 Reagenzien und Substanzen ............................................................ 23
3.1.2 Testsubstanzen ................................................................................. 25
3.1.3 Kits .................................................................................................... 26
3.1.4 Geräte und Verbrauchsmaterial......................................................... 26
3.1.5 Software ............................................................................................ 28
3.1.6 Medien und Lösungen ....................................................................... 29
3.1.7 Antikörper ......................................................................................... 33
3.1.8 TaqMan Gene Expression Assays ..................................................... 33
3.2 Zellbiologische Methoden ......................................................................... 34
3.2.1 Zellen und Zelllinien .......................................................................... 34
3.2.2 Zellkultivierung .................................................................................. 35
3.2.3 Isolation und Stimulation primärer mononukleärer Zellen .................. 36
3.2.4 Zytotoxizitätstest mittels MTT ............................................................ 36
3.2.5 Zytotoxizitätsermittlung durch ATP-Bestimmung................................ 37
3.2.6 Behandlung der Zellen mit Testsubstanzen ....................................... 38
3.2.7 Zellaufschluss ................................................................................... 39
3.3 Proteomanalyse ........................................................................................ 40
3.3.1 Fällung von Proteinen aus Zellkulturüberständen .............................. 40
3.3.2 Proteinquantifizierung nach Bradford ................................................ 40
II Inhalt
3.3.3 1D-SDS-PAGE .................................................................................. 41
3.3.4 Proteinquantifizierung mittels Ninhydrin-Test..................................... 41
3.3.5 Isoelektrische Fokussierung (IEF) ..................................................... 42
3.3.6 Horizontale high-performance-Gelelektrophorese (HPE) .................. 43
3.3.7 Bildverarbeitung und -auswertung ..................................................... 44
3.3.8 Spotverarbeitung, Massenspektrometrie und Datenauswertung ....... 46
3.3.9 Detektion intrazellulärer Proteine mittels Durchflusszytometrie ......... 47
3.3.10 Proteome Profiler™ .......................................................................... 48
3.3.11 Visualisierung von Proteom-Daten mit Voronoi-Treemaps ................ 49
3.4 Transkriptomanalyse ................................................................................ 50
3.4.1 RNA Isolation und Aufreinigung ........................................................ 50
3.4.2 cDNA Synthese, pre-Amplifizierung und quantitative PCR ................ 50
3.4.3 Genexpressionsanalyse und Datenauswertung ................................ 52
3.5 Übersicht der durchgeführten Methoden .................................................. 54
4 Ergebnisse ....................................................................................................... 56
4.1 Zytotoxizitätsermittlung mit MTT ............................................................... 56
4.2 Gelbasierte Proteomanalysen .................................................................. 63
4.2.1 Anpassung der Proteomanalysen für humane Immunzelllinien ......... 63
4.2.2 Das intrazelluläre Proteom unbehandelter Jurkat-T-Zellen................ 66
4.2.3 Das Proteom Naturstoff-behandelter Jurkat-T- und THP-1-Zellen ..... 67
4.3 Membranbasierte Proteinanalysen ........................................................... 85
4.3.1 Apoptose-assoziierte Proteine .......................................................... 86
4.3.2 Stress-assoziierte Proteine ............................................................... 88
4.3.1 Zytokinsekretion ................................................................................ 91
4.4 Identifizierung von Biomarkern ................................................................. 92
4.5 Durchflusszytometrische Bestimmung von Marker-Proteinen ................... 93
4.6 Transkriptomanalysen .............................................................................. 94
4.6.1 Zytotoxizitätsbestimmung mit ATP .................................................... 95
4.6.2 Pre-Amplifizierung von cDNA ............................................................ 99
4.6.3 Expressionsanalysen ........................................................................ 99
4.7 Funktionelle Analysen ............................................................................ 103
4.8 Metabolitenanalysen zur Bestätigung beeinflusster Prozesse ................ 105
4.9 Entscheidungsbaum ............................................................................... 108
5 Diskussion ....................................................................................................... 111
5.1 Proteom und Transkriptom zur Identifizierung von Immuntoxizität ........... 111
5.1.1 Negativkontrollen ............................................................................. 111
Inhalt III
5.1.2 Positivkontrollen ...............................................................................112
5.1.3 Testsubstanzen ............................................................................... 121
5.2 Die Anwendung von Biomarkern auf Transkriptom- und Proteomebene . 135
5.3 Entscheidungsbaum als Möglichkeit der Immuntoxizitätsklassifizierung . 137
6 Zusammenfassung ......................................................................................... 138
7 Ausblick .......................................................................................................... 140
8 Referenzen ..................................................................................................... 141
11 Veröffentlichungen .......................................................................................... 164
12 Danksagung ................................................................................................... 166
13 Anhang ............................................................................................................... 1
IV Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Entstehung der Immunzellen aus hämatopoetischen
Stammzellen (Hämatopoese) ............................................................................ 4
Abbildung 2 Möglichkeiten der Identifizierung immuntoxischer Effekte auf
Ebene der DNA, mRNA, der Proteine oder Metaboliten. ................................... 7
Abbildung 3 Die Entgiftung von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) über 2
Wege. ............................................................................................................. 14
Abbildung 4 Intrinsischer und extrinsischer Weg der Apoptose und daran
beteiligte Proteine. .......................................................................................... 15
Abbildung 5 Reaktionsmechanismus von MTT....................................................... 37
Abbildung 6 Schema der Reaktion von D-Luciferin im ATP-Test............................. 38
Abbildung 7 Entstehung von Ruhemanns Purpur durch Reaktion von
Ninhydrin mit primären Aminosäuren .............................................................. 42
Abbildung 8 Beispiel einer Warp-Strategie für die Detektion von Proteinen mit
veränderter Abundanz nach Substanz-Behandlung von Immunzellen. ............ 45
Abbildung 9 Prinzip des Proteome Profilers™ ........................................................ 49
Abbildung 10 Vergleich der Zytotoxizitätsverläufe nach 24 h und 72 h
Behandlung von Jurkat-T-Zellen mit den Substanzen in zunehmender
Konzentration. ................................................................................................. 59
Abbildung 11 Zytotoxizitätsverläufe nach 24 h und 72 h Behandlung von
Jurkat-T-Zellen mit den Substanzen in zunehmender Konzentration. .............. 60
Abbildung 12 Vergleich der Zytotoxizität der Naturstoffe auf Jurkat-T-Zellen,
THP-1-Zellen und PBMC nach 72 h Behandlung. ........................................... 61
Abbildung 13 Vergleich der Auswirkungen des pH-Bereichs der IEF-Streifen
auf die Proteintrennung. .................................................................................. 65
Abbildung 14 Zuordnung der identifizierten intrazellulären Proteine
unbehandelter Jurkat-T-Zellen zu biologischen Prozessen. ............................ 67
Abbildung 15 Treemap der biologischen Prozesse, zu denen die
identifizierten Proteine gehören. ...................................................................... 72
Abbildung 16 Treemaps von Proteinen aus Jurkat-Zellen, die mit
verschiedenen Substanzen behandelt wurden. ............................................... 73
Abbildung 17 Treemaps von Proteinen aus Jurkat-Zellen, die mit
verschiedenen Substanzen wurden. ............................................................... 74
Abbildung 18 Beeinflussung des Redoxgleichgewichts durch Cannabidiol. ............ 84