Table Of ContentPROTEİN KÜTLE SPEKTROMETRİSİ
Giriş:
“Proteom” terimi ilk olarak ‘uluslararası proteomiğin bu derece önem kazanması ve mev-
elektroforez derneği’nin 1994 yılında Siena’da ger- cut halini almasındaki başlıca etken, genom proje-
çekleştirdiği bir toplantıda Marc Wilkins tarafından sinin sonuçlarının yarattığı şok etkisidir. 100.000
önerilmiştir. Wilkins bu terimi bir genom tarafından ila 120.000 arası olduğu düşünülen insan gen sa-
ifade edilen tüm proteinleri tanımlamak için kul- yısının sadece 30.000 civarında olduğunun anla-
lanmıştır. “Proteomik” terimi ise proteomdan türe- şılması, canlılık ile ilgili bilginin DNA’nın baz dizile-
tilmiştir. Proteomik en genel anlamda gen ve hücre rinde değil de sistemin genel işleyişinde aranması
fonksiyonlarının doğrudan doğruya protein düze- gerektiği gerçeğini ortaya koymuştur (yakın za-
yinde belirlenmesi ile ilgili olan bilim dalıdır. Bu mandaki bazı çalışmalarda bu rakam 25.000 ila
amaçla, genetik regülasyon ağlarının analizinden, 29.000 arasında verilmektedir. Gen kavramı ve bir
proteinlerin nitelik, nicelik, modifikasyon durumu, genin nerede başlayıp nerede bittiği ile ilgili tartış-
ifade düzeyleri ve birbirleri ile geliştirdikleri etkile- malar da buna eklendiğinde neredeyse toplam gen
şimlerin analizine kadar geniş bir çalışma alanı sayımızın, kromozom sayımızdan az(!) çıkabilece-
proteomik olarak tanımlanır. Aslına bakılırsa ğini düşünmeye başlıyoruz. 25.000 rakamı için
bkz: Pennisi, E. Human genome. A low number kaynaklanan pek çok sınırlamadan (çözünürlük,
wins the GeneSweep Pool. Science 300, 1484 post-translasyonel modifikasyonlar, serbest N-
(2003)). Proteomik çalışmalarıyla ilgili bazı internet terminalinin olup olmaması v.b.) etkilenmeksizin
adresleri aşağıda verilmiştir. yapılabilmektedir. İster de novo dizileme adıyla
anılan ve doğrudan doğruya kütle spektrometre-
Proteomik Web Siteleri sinden alınan veri üzerinden dizi tespiti yapan tek-
1.)http://base-peak.wiley.com nik için olsun, isterse de daha sonra geliştirilmiş
2.)http://www.narrador.embl-heidelberg.de olan, geniş çaplı proteom taramaları için kullanılan
3.)http://prospector.ucsf.edu
ve spektrometreden elde edilen spektrumu geniş
4.)http://www.narrador.embl-
heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.html veri tabanlarıyla karşılaştırarak dizi ve işlev bilgisi-
5.)http://www.matrixscience.com ne ulaşmaya çalışan sistemler için olsun, geliştiri-
6.)http://www.seqnet.dl.ac.uk/bioinformatics/webapp/mowse len dizileri betimlemekte biyoinformatik yöntemleri
7.)http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound
ve ilişkili tek harfli amino asit kodları kullanılır
8.)http://www.lsbc.com:70/lutefisk97.html
9.)http://www.m-scan.com (Tablo.1).
10.)http://www.protana.com
11.)http://www.expasy.ch/tools
Kütle spektrometrisi sadece kütle ve dizi
12.)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
13.)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbest/index.html analizi yapmaya yarayan bir yöntem olmaktan öte,
14.)http://genome-www.stanford.edu/saccharomyces/ aynı zamanda çok değerli protein etkileşimleri bil-
gisine ulaşmamıza imkân verecek bir tekniktir.
Aslına bakılırsa insan genom projesi bu Protein etkileşimleri zamanımızın ve yakın gelece-
şok edici sonuçları vermeden önce düşünülen şey, ğin muhtemel en güçlü süper bilgisayarları için bile
proje sonunda tüm genlerin ürettiği proteinlerin devre yaktıracak zorlukta birer sorun kaynağıdır.
yalnızca işlevlerinin belirlenmesinin (amino asit di- Küçük sayılacak boyutlardaki proteinler için bile
zileri, nükleotid dizilerinden zaten elde edilebilece- 1030’lar düzeyinde olan muhtemel konfor-
ğine göre) bütün bilinmeyenleri aydınlatacağı yö- masyonların tüm proteinler için bilgisayarlarca he-
nünde idi. Fakat bugün ortada olan gerçek, prote- saplanmasını hayal etmek bile zorken, bunlar ara-
inlerin oluşturduğu karmaşık ağın taşıdığı bilginin, sındaki tüm etkileşimleri yine bilgisayarlarla ve salt
genomik bilgiden daha fazla olup, ondan türetile- primer dizilere bakarak bulmayı hedeflemek akılcı
meyeceğidir. Sonuçta DNA düzeyinde bile doğru- bir yaklaşım değildir. İşte bu konuda da MS analizi
sal olmaktan uzaklaşıp, işlevsel ve sistemik bir ba- ciddi olanaklar sunmaktadır (Şekil.1/a ve 1/b).
kış açısına doğru yönelen yaklaşımlar, protein dü-
zeyinde hemen tamamen etkileşimlerin yarattığı Protein Dizileme Çalışmaları:
genel sistem ve ağın dinamiklerinin belirlenmesi
eksenine kaymıştır. İşte burada kilit olan bilgiler,
Protein dizileme çalışmaları yeni bir araş-
proteinlerin primer dizilerinden, üç boyutlu etkile-
tırma alanı değildir. İlk olarak F. Sanger kendi ge-
şimlerinin yarattığı ağın devinim parametrelerinin
liştirdiği kimyasal ile bir proteindeki serbest N-
tespitine kadar uzanır. Bu tür bilgiler doğaları ge-
terminallerinin sayısını bulmanın ve dolayısıyla
reği edinilmesi zor bilgilerdir. Zira yaşamsal sistemi
proteinlerin dördüncül yapıları hakkında bilgi sahibi
parçalarına bölüp analiz etmek, kazanılması he-
olabilmenin yolunu açmıştır. FNDB (1-floro-2,4-
deflenen bilginin yok olmasına, sistemin korunma-
dinitrobenzen) isimli kimyasalın kullanımı ile prote-
ya çalışılması ise aksine bilgi edinme becerisinin
in yapısındaki N-terminal a.a.’leri belirlemek şekil-
ciddi biçimde azalmasına yol açacaktır. Sonuçta
de görüldüğü gibi mümkündür (Şekil.2). Daha son-
bu sıkıntıları aşmak için mevcut olanlardan daha
ra aynı amaç için başka kimyasallar da geliştiril-
sofistike analiz tekniklerine gereksinim duyulacağı
miştir. Bunların iki örneği Dansyl ve Dabsyl klorür-
açıktır. İşte “protein kütle spektrometrisi” bu konu-
ler şekil.3’te belirtildiği gibidirler.
da atılmış en ciddi adımlardan biridir.
Ancak bu konudaki asıl gelişme Edman
Bir proteini tanımlamakta kullanılan en te-
degredasyonu ile proteinlerin dizilerinin tamamının
mel parametre kütlesidir. Bir proteinin kütlesinin
elde edilmesi ile sağlanmıştır (Şekil.4). Bu yön-
bilinme hassasiyeti arttıkça, onun muhtelif etkile-
temde polipeptit zinciri her döngüde yalnızca bir
şimlerde aldığı rolü bilme imkânı da artar. Kütle-
a.a. kısalmakta ve fakat degrede olmadan yeniden
sindeki değişmelere bağlı olarak, bağlı kofaktör
kazanılabilmektedir. Böylece bir a.a. kısalmış olan
veya metal iyonlarının varlığından, kovalent modi-
peptidin N-terminalindeki ikinci a.a. de ikinci bir re-
fikasyonlara kadar pek çok konuda bilgi edinilebilir.
aksiyon ile koparılıp analiz edilebilmektedir. Böyle-
İşte bu nedenle protein kütle spektrometrisi (mass
ce sırasıyla tüm a.a. dizisini elde etmek teorik ola-
spectrometry – MS), proteomik çalışmalarının te-
rak mümkündür. Fakat bu yöntemin de kendine
mel analitik yöntemidir. Bu teknik ile proteinlerin
has kısıtlamaları vardır ve pek çok durumda isteni-
kütlelerinin belirlenmesi çok büyük bir hassasiyetle
len sonucun alınması mümkün olmamaktadır.
yapılabilmekte ve dizi analizleri, kısa zamanda,
Özellikle yöntemin ilk a.a.’i koparmada %100 etkin
yüksek bir doğrulukla ve proteinlerin yapısından
olmadığı durumda ki, etkinlik hemen hemen hiçbir
zaman %100 değildir, bir sonraki basamağa geçen laşmış ve iyonize olmuş protein ve/veya peptit mo-
ancak bir önceki basamağa ait olan a.a.’lerin yarat- lekülleri spektrometrik analize hazır durumdadır.
tığı zemin gürültüsü özellikle 50. basamaktan itiba-
ren son kopan a.a.’in tespitini neredeyse imkânsız- Bir kütle spektrometresinin algılayıcısı tıp-
laştırmaktadır. Yine eğer varsa post-translasyonel kı bir fotomultiplikatör gibi çalışır. Detektörün ça-
modifikasyonlar hem sistemi durdurabilmekte hem lışma biçimi, iyonun hedefe çarpmasının yarattığı
de tespit edilememektedir. Hepsinin ötesinde eğer güçle oluşturulan ve hedeflendirildiği zıt yüklü pla-
proteinin serbest N-terminali yoksa veya ilgili reak- kalar ile gücü artırılan bir elektron sağanağının
siyon için çözünür hale getirilemiyorsa, yöntem en oluşturulması üzerine kuruludur. Sonuçta en küçük
başından çöker ve hiçbir uygulama yapılamaz. yük için bile hissedilir bir sinyal oluşturulur. Bu tür
Tüm bu zorlukların üstesinden gelebilmek için (Şe- cihazlarda tipik yükseltgenme oranı her iyon başı-
kil.5) önce proteinin a.a. kompozisyonu belirlenir na 106 elektron gibi son derece yüksek değerler-
ve böylece dizi özgül proteazlarla muamele edildi- dedir (Şekil.18). Ancak kolayca görülebileceği gibi
ğinde vereceği parçaların sayısı anlaşılır. Ayrıca cihaz, moleküllerin kütlelerini değil yük kütle oran-
Sanger reaktifi ile N-terminal a.a.’i belirlenir. Daha larını ölçebilir. Zira temel olarak bilinenler, molekü-
sonra iki farklı ve dizi özgül kesim reaksiyonu ile lerin kaynaktan çıktıktan sonra hedefe varıncaya
polipeptit 35–40’dan az sayıda a.a. içeren parçala- kadar geçirdikleri süre ve buna bağlı olarak da hız-
ra bölünür ve saflaştırılan her bir parçanın Edman ları ile detektöre ulaşan belirli bir türün orada bı-
degredasyonu ile dizisi belirlenir. Belirlenen diziler raktığı elektriksel yüktür. Hedefte bırakılan yük
daha önce elde edilen bilgiler ışığında çakıştırıla- hem moleküllerin taşıdığı yük ile hem de miktarları
rak ana diziye ulaşılır. Bu uygulamalardan önce ile doğru orantılıdır. Aynı şekilde kaynaktan aynı
varsa di-sülfit bağlarının koparılması gerekir (Şe- anda çıkan moleküllerden hangisinin hedefe daha
kil.6). Bunun için ya performik asit ile sistein önce çarpacağını da hızı belirler. Böyle bir ortam-
a.a.’leri okside edilip sisteik aside dönüştürülür ya da (vakumda) molekülere etki eden kuvvet
da ditiyotreitol (DTT) veya uygun başka bileşikler =m. yasası gereği ivmeli bir harekete neden
(β-merkaptoetanol, glutatyon v.b.) ile sistein köprü-
olur. Bu denklemdeki (kuvvet) her tür molekül
leri indirgenip açıkta kalan -SH grupları
için sabit olsaydı, kütleleri ile ters orantılı bir ivme-
iyodoasetat ile asetillenerek inaktive edilir.
lenmelerinin olmasını ve böylece kütlelerinin de
kolayca hesaplanmasını beklerdik. Oysaki sabit bir
MS’de Genel Kavramlar: elektrik alanda ( ) elektrikle yüklü parçacıklara
etkiyen kuvvet, =q. denklemi ile verilir (q=yük).
Klasik yöntemlerin yukarıda da belirtilen Yani bu kuvvet hem elektrik alanın yeğinliği ile
eksikliklerine kıyasla kütle spektrometrisi son de- hem de parçacığın taşıdığı yük ile orantılıdır. To-
rece hassas ve kolay uygulanır bir yöntemdir. Pek parlarsak spektrometrede oluşan ivmeyi .q=m.
çok durumda proteinlerin sadece dizisini değil, ay- denklemi gereğince (ve elektrik alanın her iyon için
nı zamanda post-translasyonel modifikasyonlarını, sabit olduğu gerçeği göz önünde tutulduğunda)
işlevlerini ve birbirleri ile olan ilişkilerini de ortaya yük/kütle oranı belirler (aynı şekilde kütle/yük oranı
çıkartabilecek uygulamaları olan, böylece şeklinde de alınabilir). Böylece kaynaktan aynı an-
proteomik çalışmaları için temel bir yöntem oluştu- da çıkan ve aynı yük/kütle oranına sahip olan tüm
ran kütle spektrometrisi aslında yeni bir teknik de- türlerin detektöre aynı zamanda ulaşmaları bekle-
ğildir. 1960’lardan beri pek çok basit yapılı bileşiğin nir. Görüldüğü gibi sonuçlar her zaman için birden
yapısal analizi için kullanılan bu teknik, uzunca bir fazla bilinmeyenin olduğu denklemler şeklinde or-
zaman karmaşık organik moleküller için kullanılabi- taya çıkmaktadır. Bu denklemlerden sonuç üret-
lir olmamıştır. Zira uygulamada ilgili bileşiğin bu- menin iki yolu vardır; matematiksel analiz yöntem-
harlaştırılması ve iyonize edilip vakum ortamında leri kullanılarak sonuç üretilebilir veya sistem çok
ivmelendirilmesi gerekmektedir. Proteinlerin yapı- iyi kalibre edilerek hedefe yönlendirilen her tür için
ları gereği çok kuvvetli moleküller arası etkileşimle- ön bilgi elde edilir ve taşıyabilecekleri yük kısıtla-
ri mevcuttur. Bu sebeple pek çok organik bileşik nır. Pratikte her iki yöntem de bir arada ve
gibi ve çok daha belirgin olarak proteinlerin teorik otomatize edilmiş olarak kullanılır. Spektrumu veri-
ve pratikteki buhar basınçları sıfırdır. Bu tür bileşik- len örnekte (Şekil.7) sistem sadece tek bir protei-
leri buharlaştırma yolunda yapılan girişimler genel- nin kütle analizi için kullanılmıştır. Sonuçta, ilgileni-
de ciddi yapısal degredasyon ile sonuçlanmakta- len proteine ilişkin spektrumdan kütlesini çok has-
dır. Aynı şekilde iyonizasyon süreçleri de muhtelif sas bir şekilde elde etmek mümkündür. Bu örnek-
zorluklar taşımaktadır. Sonuçta her hangi bir teorik teki proteinin iyonizasyon sürecinde pek çok farklı
engel olmamasına karşın pratikte uygulama, uzun- yük/kütle oranına sahip türevi oluşmuştur. Açıktır
ca bir süre mümkün olamamıştır. Bu gidişatı değiş- ki bunun nedeni faklı düzeyde yüklenen molekül-
tiren şey ise proteinleri tahrip etmeden buharlaştı- lerdir. Örneğin birbirine komşu iki piki ele alalım.
rıp, iyonize etmeyi başaran biri Nobel ödüllü iki Bunların arasındaki yük cinsinden fark 1’dir. Bu
tekniğin geliştirilmiş olmasıdır. Bu aşamada buhar- fazladan yükün taşıyıcısı olan protonun kütlesinin
de proteinin toplam kütlesine eklenmesi nedeniyle
aralarındaki kütle farkı da birdir. Böylece bir birine landığı için ilgili a.a.’in tespit edilmesi mümkün
komşu iki pikin (m/z) ve (m/z) değerleri için; olur.
1 2
M +(xp) M + x Standart Proteomik Deneyi:
(m/z). = ⇒
1
xq x
Bugün standart bir proteomik deneyi ola-
rak kabul edilen olağan bir kütle spektrometrisi
deneyi sırasıyla şu basamaklardan oluşur (Şe-
M +(x+1)p M +(x+1)
(m/z). = ⇒ kil.10). 1.Protein örneklerinin ilgili kaynaktan izo-
2
(x+1)q x+1 lasyonu. 2.Protein örneğinin bir ön eleme oluştur-
mak maksadıyla SDS-PAGE veya 2D-PAGE ile
ayrıştırılması. 3.Jelden kazanılan proteinlerin dizi
eşitlikleri yazılabilir (M=proteinin kütlesi;
özgül proteazlarla peptitlere parçalanması.
p=protonun kütlesi olan +1; q=protonun yükü olan
4.Peptitlerin HPLC veya Ion-exchange
+1; x=ilgili proteinin (m/z) piki için net yükü). Bu-
1 kromatografisi gibi yöntemlerle ayrıştırılıp mümkün
rada görüldüğü gibi denklemlerde iki adet bilinme-
mertebe saflaştırılması. 5.Oluşan her bir örneğin
yen vardır (M ve x). “x” değerini doğrudan doğruya
buharlaştırılıp iyonize edilmesi. 6.İyonize buhar
MS grafiğini inceleyerek bulmak mümkündür (Bkz:
üzerinde spektrometrik analiz yapılması.
Standart Proteomik Deneyi; 7.Verilerin İncelenme-
7.Verilerin incelenmesi.
si, ilk paragraf). Buna rağmen bu iki denklemin “x”
ve “M” için çözümlerini kullanmak da mümkündür.
Bu tip hesapların pek çok pik için tekraren yapılıp 1.İzolasyon: Proteinlerin kaynaktan izolas-
ortalamalarının alınması sonuçların kesinliğini artı- yonu pek çok standart prosedür ile gerçekleştirile-
rır. Ayrıca çeşitli bilgisayar algoritmaları, pek çok bilir. Bu işlemde kullanılacak prosedür hedeflenen
m/z değerinden oluşan bir spektrumu tek bir pike analize göre belirlenir. Eğer kaynağın proteom
dönüştürüp son derece hassas bir kütle ölçümü analizi yapılacaksa tam protein izolasyonu yapılır.
yapmakta kullanılabilir. Şekil.7’deki örnekte Ancak özel bir protein veya protein grubu çalışıla-
aerolysin’in kütlesi %0,01’lik bir hata oranıyla, caksa bunların izolasyonuna yönelik prosedürler
47.342 Da olarak hesaplanmıştır. uygulanır.
Günümüzde kullanılan teknik sıklıkla “Tan- 2.PAGE: Bu ikinci basamak bir ön eleme
dem MS” (ardı ardına kütle spektrometrisi), basamağıdır. Çünkü poliakrilamit jel elektroforezi
“MS/MS” veya “MS2” olarak adlandırılır. Bunun ne- ile ayrıştırılan proteinlerin aynı kütlede olanları ay-
nı bantta toplanır (denatüre koşullarda!). 2D (iki
deni aslında cihaz içinde arka arkaya iki spektru-
mun oluşturulması olgusudur. İlki protein veya ge- boyutlu) PAGE uygulamasında (bir boyutta SDS
nelde polipeptitleri ayrıştıran ikincisi ise dizi anali- ile denatüre koşullarda, 90° farklı diğer bir boyutta
zinin yapıldığı iki farklı spektrumdur. Grafikte gö- ise bir pH gradiyenti ile izoelektrik noktalarına göre
rüldüğü gibi kurulan sistem sayesinde (Şekil.8) tam yapılan ayrıştırmada) bile jel üzerindeki tek bir le-
ve ayrıntılı bir analiz gerçekleştirilir. Sistem yete- kenin sadece bir proteine ait olduğu kesin değildir.
rince iyi kalibre edilmişse çarpışma hücresindeki Yine post-translasyonel modifikasyonlar pek çok
her bir peptit türü için ortalama bir kırılma olayı ya- sorunlara neden olur. Bu nedenle genelde uygula-
şanır. İlk bölmedeki ayrışma nedeniyle belirli bir nan yöntem PAGE sonrası oluşan bantları kesip
zaman diliminde çarpışma odasında etkilenen yal- her bir banttan kazanılan proteinlerin kütle
nızca bir tür peptit vardır. Yine sağlanan kalibras- spektrometrik analizinin ayrı ayrı yapılmasıdır (Şe-
yon sayesinde bu peptitler genel olarak +1 yüklü- kil.11). Son olarak akıldan çıkarılmaması gerekir
dür. Peptitde oluşan kırılmalar, ortamın vakum ko- ki, pek çok klasik yöntemle belirlenemeyecek ka-
şulları nedeniyle iyon değil serbest radikal oluşumu dar düşük miktardaki proteinler bile kütle spektro-
ile sonuçlanır. Böylece taşınan +1 yük oluşan iki metresince saptanabilirler. Bu nedenle özellikle
parçadan yalnızca birinin üzerinde kalır. Detektör- aranılanın bilinmediği durumlarda ön eleme basa-
ce belirlenebilecek olan da işte bu parçadır. Dikkat makları işlemin karmaşıklığını azaltma ve bir ön-
bilgi edinme aşaması olarak görülmeli, izolatın ta-
edilirse tıpkı Sanger dizi analizinde olduğu gibi
atasal peptidin birer a.a. farkla bir birinden ayrılan mamı için kütle spektrometresi analizi yapılmalıdır.
pek çok farklı boyda parçasının oluşabileceği ve
oluştuğu görülür. İşte bu parçalar çarpışma hücre- 3.Dizi Özgül Proteazlarla Muamele: Kütle
sinden detektöre varıncaya kadar farklı kütleleri spektrometrisi, en yüksek etkinlikle 500 – 3000
nedeniyle farklı miktarda ivmelenir ve detektöre Dalton aralığındaki polipeptitler için sonuç üretir.
farklı zamanlarda ulaşır. Elde edilen veri grafiği Bunun nedeni daha büyük molekül ağırlıklı ve do-
(Şekil.9) üzerindeki yük/kütle oranları arasındaki layısıyla daha uzun zincirli polipeptitlerin hem yük-
farklılıklar, daha sonra çarpan parça ile önceki sek bir etkinlikle iyonize buhar haline getirileme-
arasındaki tek bir a.a.’in kütle farkından kaynak- mesi ve son derece karışık bir spektrum üretmesi-
dir. Tek bir proteinin çalışılacağı ve iyi ayarlanmış örnekle yüklenirler ve bu örneğe ilişkin olarak alı-
koşullarda bu basamak atlanabilir. Ancak geniş öl- nan yaklaşık 1 saat’lik spektrumda her bir
çekli proteom analizlerinde temel basamaklardan polipeptit yaklaşık 10 ila 60 saniye genişliğinde bir
biridir. Veri tabanlarının bir biri ile tutarlılığını sağ- pik verir. Bu tip polipeptit piklerinin analizi ile her
lamak ve böylece karşılaştırma kolaylığı yaratmak bir polipeptit hakkında gerekli bilgi elde edilir.
amacıyla genellikle tripsin kullanılır. Tripsin kulla-
nımının bir diğer nedeni de karboksi terminalinde 5.Buharlaştırma ve İyonizasyon: Yukarıda
bazik amino asitler bırakarak aşağıda açıklandığı belirtilen nedenlerden dolayı en sorunlu aşama
gibi analizi daha kolay ‘y’ türü iyonlar oluşturması- buharlaştırma ve iyonizasyon basamağıdır. Bu iş
dır. Tripsin iki farklı bölgeye özgüldür (Arg-C ve için geliştirilmiş iki farklı teknik vardır. Bunlar; ESI
Lys-C). Yani polipeptit zincirinde her arjinin ve lizin ve MALDI’dir.
amino asidinin C-terminalindeki a.a. ile arasındaki
bağı hidroliz eder. Ayrıca fiziksel dayanımı olup ko-
a.) MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorp-
lay bir kullanım sağlar. Yaygın kullanılan bir diğer
tion/Ionization): Bu teknikte analit (polipeptit karı-
dizi özgül proteaz ise Endopeptidaz Lys-C’dir. Bu
şımı) kendisine kıyasla aşırı miktarda olan ve mo-
enzim 8M üre gibi gerçekten zorlayıcı koşullar al-
rötesi soğurucu karakterde olan bir matriks içine
tında bile etkindir. Özellikle çözünür hale getirilme-
gömülü olacak şekilde hazırlanır. Matriks malze-
si zor olan veya diğer proteinlerle güçlü etkileşim-
mesi genelde düşük molekül ağırlıklı aromatik ya-
leri olan proteinlerle çalışılırken kaçınılmaz olan
pılı organik asitlerden seçilir (gliserol, tiyogliserol
denatüre edici koşullarda kullanımı, olumlu sonuç-
veya nitrobenzil alkol gibi bileşikler de kullanılır).
lar verir. Seçilen enzimin dizi özgüllüğün sebebi ise
Bu yapıya uygun dalga boyunda lazer ışını gönde-
mümkün mertebe bir biri üzerine çakışmayan ve
rilmesi ile matriks molekülleri süblimleşir ve bunla-
kısmen de olsa öngörülebilir parçaların oluşması-
ra göreli olarak çok düşük miktarda olmaları nede-
nın sağlanmasıdır.
niyle birbirleri ile temas halinde olmayan polipeptit
molekülleri kendilerini gaz fazında bulurlar. Bu or-
4.Peptitlerin Ayrıştırılması: Oluşturulan tamda meydana gelen çok sayıda çarpışma sonu-
polipeptitler HPLC veya Ion-exchange cunda çeşitli miktarlarda artı ve eksi yüklenmiş
kromatografisi gibi yöntemlerle saflaştırılarak ayrı polipeptit molekülleri oluşur. Artı yüklü moleküller
ayrı (MALDI tekniğinde) veya doğrudan doğruya bir elektrik alan yardımıyla buharlaşma yüzeyinden
kolon çıkışının analize yönlendirilmesi ile (ESI tek- uzaklaştırılıp spektrometreye yönlendirilirler (Şe-
niğinde) incelemeye alınabilir. Bu basamağın te- kil.12). Bu yönlendirme elektrikle yüklü bir
mel amacı spektrumun zaman ölçeğinde genişliği- ekstraksiyon ızgarası ile yapılır. Aslında böylece
ni artırmak ve incelenmesini kolaylaştırmaktır. Her birbirlerinden gelişi güzel uzaklıklarda bulunan
ne kadar molekülleri önce yük/kütle oranına göre iyonların mümkün mertebe aynı düzlemde toplan-
ayrıştıran ve çarpışma hücresine sırayla aktaran ması da sağlanmaya çalışılır (Şekil.13). Bu sayede
cihazlar ve teknoloji mevcutsa da bu ön ayrıştır- sırf daha geriden geldiği için daha büyük kütleli bir
manın en azından iki önemli faydası olacaktır. Bi- molekülle aynı anda detektöre varan küçük kütleli
rincisi bahsedildiği gibi spektrum aralıklarını mili- moleküllerin varlığı gibi sorunlar engellenir. Ayrıca
saniyelerden dakikalara çıkacak olması, ikincisi ise kullanılan organik asitler ve lazerin dalga boyu,
aynı yük/kütle oranına sahip olabilecek muhtemel matriks moleküllerinin iyonlaşmaları ve böylece
moleküllerin daha önceden hidrofobisite veya polipeptitleri de iyonlaştırmaları için özel olarak
izoelektrik nokta pH’sı gibi özelliklerine göre ayrış- seçilir. Aslında MALDI, temel kavramı itibariyle
tırılarak iç içe geçmiş spektrumların oluşumunun Protein Kütle Spektrometrisi çalışmalarını başlatan
engellenecek olmasıdır. Aslında son derece kar- yöntemdir. Eskiden “Hızlı Atom Bombardımanı”
maşık polipeptit karışımları için HPLC kolonlarının (“FAB-MS / Fast Atom Bombardment – MS”) gibi
kullanımı yeni bir uygulamadır. Çünkü daha önce- tekniklerle bu temel mantık uygulama alanı bul-
leri HPLC kolonlarının ayrıştırma gücü düşük ve muştur (bu amaçla genel olarak yüksek hızlı Sez-
akış hızları yüksekti. Sonuçta karmaşık polipeptit yum iyonları [Cs+] kullanılmış). Ayrıca teknik sade-
karışımlarının ayrıştırılması etkin olarak gerçekleş- ce proteinler için değil pek çok başka biyolojik ve
tirilemediği için kolon çıkışının doğrudan kütle organik molekül için de kullanılmış ve hala da kul-
spektrometresine bağlanması söz konusu olamı- lanılmaktadır (Tablo.2’de çeşitli matriks malzeme-
yordu. Günümüzde kullanılan Yüksek-Performans leri ve kullanım amaçları verilmiştir). Eskiden MS
Sıvı Kromatografisi kolonlarının iç çapı 50 – 150 uygulaması için proteinlerin polariteleri de kimya-
µm ölçeğinde olup uzun hidrofobik alkil grupları sal olarak düşürülürdü. Bu amaçla özellikle arjinin
içermesi nedeniyle hidrofobisiteye göre ayrıştırma amino asitlerinin guanido grupları hidrazinoliz ile
yapar. Bu tip kolonlarda akış hızı da son derece uzaklaştırılır ve bütün amino grupları asetik anhid-
düşük olup 100nl/dak (0,1µl/dak veya rit ile asetile edilirdi. Ardından bütün karboksil, hid-
0,0001ml/dak) civarındadır ve bu miktar doğrudan roksil ve NH grupları kuvvetli bir baz ile permetile
kütle spektrometresine yönlendirilmeye uygundur. edilip, ardından metil iyodat ile muamele edilip me-
Bu tip kolonlar çoğu zaman birkaç µg dolayında tilenmiş halde bırakılırlardı. MALDI ve özellikle
ESI’nin gelişmesi bu uygulamaları gereksizleştir- olur (bkz: yukarıdaki denklemler). Bu nedenle
miştir. MALDI gibi moleküllerin çıkış zamanının aynı ol-
duğu bir sisteme eklenen TOF türü bir kütle spekt-
b.) ESI (Electrospray Ionization, 2002 Nobel Kimya rometresi aynı yükü taşıyan moleküller için, zama-
ödülü): İlk olarak 1988/1989 yıllarında Münster na karşı, en düşük kütleliden en yüksek kütleliye
Üniv. Deneysel fizik grubundan Prof. Dr. M. W. doğru olmak kaydı ile bir spektrum verir. Bu spekt-
Benninghoven tarafından uygulanmıştır. Bu teknik rumda her bir pikin şiddeti ilgili türün göreli miktarı
doğrudan HPLC kolonunun çıkışında uygulanır ile doğru orantılıdır. Kolayca görülebileceği gibi bu
(Şekil.14). Kolonun ucuna çapı, kolon çapından spektrumun aynısı, örneğin bir fazla yüklü türler
çok daha küçük (~8µm) bir iğne yerleştirilir (Şe- için de meydana gelecek fakat bu spektrum diğe-
kil.15). Bu iğnenin çıkışı çok daha dar olup nm öl- rinden daha önce alınacaktır, zira bu grubun için-
çeğindedir (Şekil.16) ancak uygulamanın ardından deki moleküllerin bir öncekilere oranla kazanacağı
basınç ve sürtünme etkileri nedeniyle 1–2 µm’ye ivme daha fazla olacaktır. Aynı şekilde piklerin
kadar genişler. İğne ile çıkış yönündeki levha ara- zaman aralıkları da, göreli oranları değişmeksizin
sına yüksek bir potansiyel fark uygulanır (~birkaç azalacaktır. Böyle bir spektrumda her bir türün ay-
kV kadar). Oluşan püskürme sonucu son derece nı spektrumdaki diğer türler ile göreli mesafesi (ta-
küçük damlacıklar oluşur. Akış hızının 20nl/dak bii eğer her iki spektrumda da temsil ediliyorsa)
veya daha az olduğu koşullarda damlacık çapı aynı kalacaktır. Buna karşın diğer tüm nicel değer-
~200nm veya daha azdır. Eğer analit konsantras- ler farklı olabilir. Örneğin her bir türün, spektrumlar
yonu 1pmol/µl düzeyinde tutulmuşsa o zaman her arası kıyaslamada şiddetinin aynı kalması olasılığı
damlacık başına yaklaşık 1 polipeptit molekülü dü- hem düşüktür (zira farklı miktarda yüklenmiş türle-
şer. Damlacığın uçuşu sırasında taşıyıcı faz hızla rin tam olarak aynı miktarda oluşması olasılığı dü-
buharlaşır (oda koşullarında) ve yüksek potansiyel şüktür) hem de muhtelif kalibrasyonlarla engel-
fark nedeniyle damlacığın üzerinde oluşan yük, lenmeye çalışılan bir durumdur. Ayrıca örneğin +2
polipeptide aktarılır. Polipeptit molekülleri iyonla- yüklü türlerin spektrumu ile +3 yüklü türlerin spekt-
şan su ve amonyak gibi taşıyıcı faz moleküllerin- rumu kıyaslandığında, her iki spektrumda da bulu-
den aldıkları protonlar nedeniyle pozitif yüklenirler. nan iki komşu türün bir birine göre şiddetleri de
Taşıyıcı faz, pozitif yüklü iyonların oluşumunun ko- çok büyük olasılıkla farklı olacaktır. Çünkü her bir
laylaştırılması için çoğu zaman asidik pH’da tutu- peptidin +2 yüklenmeye yatkınlığı ile +3 yüklen-
lur. Birden fazla analit içeren damlacıklar aynı yük- meye yatkınlığı arasındaki farkın tam olarak aynı
lü analit moleküllerinin birbirlerini itmesi nedeniyle olması beklenemez. Örneğin diğerinden belirgin
parçacık yarılması denilen bir süreçle ayrışırlar. ölçüde daha fazla histidin içeren peptit, +3 yüklü
Sonuçta buhar fazında ve iyonize olmuş polipeptit türlere ilişkin spektrumda +2 yüklüler spektrumuna
ve/veya protein molekülleri oluşturulmuş olur. Dik- göre daha yüksek şiddette bir pik oluşturacaktır.
kat edilirse istenilen sonucun elde edilebilmesi ta- Bu tip gölge spektrumların birbiri üzerine düşüşü-
mamen kalibrasyona bağlıdır. Molekülün başka nün engellenmesi ve her bir pikin ayrıntılı analizi-
moleküllerle etkileşime girmemesi ve istenilen dü- nin kolaylaşması amacıyla bu tip cihazlarda mole-
zeyde elektrikle yüklenmesi hep koşulların ayar- küllerin kat ettikleri yol elektrik ve manyetik yansı-
lanması ile sağlanır. İdeal düzeyde iyonlaşmış bu- tıcılar kullanılarak uzatılır. TOF türü cihazlar
har, iğne çıkışı istikametinde bulunan ve negatif MS/MS analizi için (polipeptit dizi analizi için) kul-
yüklü olan bir levhanın ortasındaki küçük açıklıktan lanılmak üzere TOF–TOF şeklinde organize edile-
vakum ortamına girer (Şekil.17). Artık MS analizi bilirler. Böyle bir durumda çarpışma hücresi de iki
başlamış olur. bölüm arasına yerleştirilir (Şekil.20). Dört–kutuplu
(Quadrupole) kütle spektrometreleri (Şekil.21) ise
iyonların yolu çevresine yerleştirilmiş dört adet
6.MS Analizi: Pek çok farklı çeşit kütle
elektrot sayesinde iyonların istenilen belirli ve ka-
spektrometresi vardır. Ancak iyonize analit hedefe
rarlı bir yörüngede hareket etmelerini sağlar. Böy-
çarptığında bir tespit sinyalinin oluşturulması te-
lece belirli bir m/z oranına sahip her tür farklı bir
melde hep aynı yöntemle sağlanır. Daha önce de
zamanda ve istenilen zaman aralıklarıyla çarpışma
belirtildiği gibi hedefte meydana gelen elektrik de-
odasına yönlendirilir. Çarpışma odası çıkışında
şarj bir elektron sağanağının üretilmesi ile hissedi-
doğrusal bir iyon kapanı tarafından ikinci bir dört–
lir güçte bir sinyale dönüştürülür (Şekil.18). Farklı
kutuplu bölüme yollanan iyonlar buradaki değişken
zamanlarda alınan farklı güçlerdeki sinyallere göre
elektrik alanın etkisi ile m/z oranlarına göre ayrıştı-
m/z oranının tespitinde kullanılan yöntemler cihaz-
rılıp hedefe yollanır. Quadrupole–TOF denilen bir-
dan cihaza farklılık gösterir. TOF (Time of Flight)
leşik cihazlarda ilk analiz dört–kutuplu bir cihazda
(Şekil.19) türü cihazlarda bu ölçüm, cihazın içinde-
yapılırken (MS), MS/MS analizi için bir TOF düze-
ki yol boyunca kaydedilen zamanın türevidir. Do-
neği kullanılır (Şekil.22). İyon kapanı (Ion–trap)
ğaldır ki farklı kütle ve aynı yüke sahip moleküller,
(Şekil.23) türü cihazlarda ise tuzaklama için kulla-
sabit bir elektrik alanda, aynı anda ivmelendirilirse;
nılan doğrusal iyon kapanlarının çalışmasına ben-
üzerlerine etkiyen kuvvet aynı olacağından, belirli
zer biçimde ancak üç boyutlu bir elektriksel alan
bir zaman sonundaki hızları kütleleri ile ters orantılı
denetimi sağlayarak m/z oranına göre ayrıştırmayı Örneğin şekil 26/a’daki 617,28’lik pik için +2 yüklü
da iyon kapanı içinde yapan düzenekler bulunur. peptitlerden oluştuğunu ispatlamanın yolu nedir?
Belki de en gelişmiş ve hassas cihazlar olan FT– Pek tabii 1848,8181 Da’luk bir peptidin +3 yüklü
MS (Fourier transform ion cyclotron resonance bir iyonu da olabilir ((617,28 x 3) - (1,0073 x 3 pro-
mass spectrometer) (Şekil.24) türü cihazlarda ise tonlar!) = 1848,8181). Burada yardımımıza, her bir
fragmentasyon ve fragment analizi son derece pikin bir birine çok yakın ama farklı m/z oranına
güçlü süper mıknatıslar arcılığıyla ve manyetik re- sahip birer izotoplar kümesi şeklinde ortaya çıkışı
zonans tekniği kullanılarak gerçekleştirilir. FT–MS koşmaktadır. Doğal karbonun %1’i, karbonun 13
türü cihazlar şekilde de görüldüğü gibi iyonların kütle numaralı (13C ) izotopu şeklinde bulunur ve
6
daha etkin bir şekilde tuzaklanabilmesi amacıyla doğal karbonun yaygın türü olan 12C’den 1Dalton
doğrusal bir iyon kapanı ile kombine bir şekilde de daha ağırdır. Bu nedenle çeşitli polipeptitler ta-
tasarlanabilir. Bu cihazlardan elde edilen veriler- mamen rastlantısal olarak bir birlerinden birer
den sonuç üretilmesinde Fourier dönüşümü adı ve- Dalton daha ağır veya hafif olacak şekilde ortaya
rilen bir matematiksel analiz yöntemi kullanılır. Ci- çıkarlar (örneğin bir kopya 3 tane 13C içerirken di-
hazın adı da buradan gelir. ğeri 2 tane içeriyorsa aralarındaki fark yalnızca
1Da olur ve aynı şekilde 2 – 3 Da’luk farklar içeren
7.Verilerin İncelenmesi: Cihazdan ilk ola- moleküller de bulunabilir). Eğer şekildeki polipeptit
rak zamana karşı alınan sinyal yeğinliğini gösteren +1 yüklü olsa idi, her bir dalton’luk fark m/z ora-
bir ‘toplam iyon akısı’ (‘total ion current / full mass nında bir birimlik bir değişikliğe neden olacaktı.
spectrum’) grafiği alınır (Şekil.25/a). Örnek, HPLC Örneğin bu durumda şekil 26/a’daki kutucuk içeri-
kolonu içerisinden kolonla en az etkileşenden en sindeki ayrıntılı gösterimde 617,28’lik pikin yanın-
çok etkileşene doğru olacak şekilde çıkıp kütle da ondan tam bir birim farklı pik veya pikler ola-
spektrometresine girdiği için, bu ilk grafik temel caktı; mesela 618,28. Bu pik gerçekten vardır, an-
olarak bu ilk ayrışmanın bir yansımasıdır. Spekt- cak 617,78’lik bir diğer pik ile birlikte! Aralarında
rometre içine aynı anda giren, bir diğer deyişle 0,5 birimlik bir fark bulunan, ancak gerçekte bir bir-
HPLC kolonundan aynı anda çıkan bütün türler lerinden yalnızca birer Da’luk kütle farkı ile ayrıldı-
birkaç saniyeden birkaç on saniyeye varan bir za- ğını bildiğimiz moleküllere ilişkin pikler kümesi, bi-
man aralığı içerisinde detektöre ulaşırlar. Bu ne- ze ilgili kütlenin 2’ye bölündüğünü yani +2 yüklü
denle kütle spektrometresi içerisinde birbirlerinden olduğunu ispatlar.
ayrıştırılmış ve hatta ayrıştırılan her tür yolu üze-
rinde fragmente edilip, oluşan fragmentleri bile ay- Daha başka bir yük belirleme yöntemi, bir
rıştırılmış da olsa, bu olaylar sırasında alınan tüm zemin gürültüsü kaynağından gelir. peptitlerle bir-
sinyaller dakika gibi bir zaman ölçeği üzerine çizi- likte hareket eden Na+ iyonunun yarattığı zemin
len bir grafikte yaklaşık olarak tek bir pik verecek gürültüsü şekil.42’de görülmektedir. Pikler arası
şekilde birleşik görünecektir. Ancak bu grafik üze- m/z oranı farkının 22 birim olması ilgili iyonların +1
rindeki dar bir zaman aralığının ayrıntılı gösterimi yüklü olduğunu ortaya koyar (Na23, ancak M+Na+-
(şekilde 42’nci dakika civarındaki, bir dakikadan M+H+=22!). Şekil.43’de ise şekil.42’deki spektru-
kısa bir alan) bize o zaman aralığındaki polipeptit mun sağ tarafındaki piklerin daha ayrıntılı bir gös-
veya proteinler için daha geniş bir bilgi verir. Bu terimi vardır. Burada da doğal izotopik dağılım ne-
dar zaman aralığı için çizilen grafikler, alınan sin- deniyle oluşan pikler kümesindeki her bir piki diğe-
yalin yeğinliğinin, yük başına DALTON (Da) birimi rinden ayıran m/z değeri 1’dir. Sonuç olarak de-
şeklindeki kütle/yük oranı için fonksiyonu olacak neydeki peptitlerin +1 yüklü olduğu her iki şekilde
şekilde elde edilir.(Şekil.26/a). Bu tür grafiklere, de kesin olarak söylenebilir. Belirtilmesi gereken
‘seçilen iyon akısı’ (‘extracted ion current’) grafiği bir diğer nokta, Potasyum iyonunun da (39K+) tıpkı
denir. Bu grafikteki kütle/yük oranı değerlerinde, sodyum iyonu gibi sıklıkla benzeri etkileşimlere gi-
protein veya peptitlerin kendi kütleleri yanı sıra po- rip kütlece 38 birimlik sapmalara yol açabildiğidir.
zitif yüklenirken aldıkları protonların kütleleri de is-
ter istemez hesaba katılır. ESI’de Tripsin muame- Tüm bu analizlerin yapılabilmesi kütle
lesi ile elde edilmiş polipeptitler genellikle iki kez spektrometresinin çözünürlüğüne bağlıdır. TOF
protone olmuş halde (+2 yüklü olarak) bulunurlar. türü cihazlarda çözünürlüğün, m/z değerinin ilgili
Sonuç olarak spektrometre tarafından 1232,55 pikin genişliğinin yarısına bölünmesi ile elde edilen
Da’luk bir peptidin m/z oranı (1232,55 + (2 x değer cinsinden verilecek olursa, 10.000 civarında
1,0073 protonun kütlesi)) / 2 = 617,28 olarak he- olduğu söylenebilir. Böylece çok yüksek düzeyde
saplanacaktır. 15 amino asitten daha uzun yüklenmiş (yani pikleri arası mesafe son derece
polipeptitler veya fazladan protone olabilecek kısalmış) türler için bile önemli ölçüde net ve ze-
histidin gibi amino asitlerden fazlaca içeren min gürültüsünden kolayca ayırt edilebilir piklerden
polipeptitler ikiden fazla yüklenebilirler. (Şekil.26/b) oluşan bir grafik almak mümkün olabilmektedir.
Bu durum ilginç bir sorun yaratır. Grafiğimizdeki Daha önce de belirtildiği gibi bu konuda en yüksek
her hangi bir pik için, gerçek molekül kütlesi hesa- performans FTMS (veya FTICR-MS Fourier
bında kullanacağımız yük sayısını nasıl belirleriz? transform ion cyclotron resonance – MS) türü cihazla-
ra aittir. NMR’ların (Nükleer Manyetik Rezonansla- ğı polipeptitten çok daha küçük kütleli olan He
rın) MS (kütle spektrometresi) analoğu olan bu ci- atomunun aktarabileceği 1eV’dan bile daha düşük
hazlarda çözünürlük kimi zaman 100.000’den yük- enerjilerin, ancak pek çok çarpışma neticesinde bir
sek değerlere ve kütle hassasiyeti de milyonda bir- peptit bağını kırabilecek düzeye ulaşacağı görüle-
lere kadar yükselebilir. Ancak bu cihazlardan elde bilir. Böylece sağlanan kontrollü enerji aktarımıyla
edilen spektrumlar, cihazın çalışma ilkesine bağlı aşırı ve düzensiz kırılmaların da önüne geçilmiş
olarak diğer cihazlardan elde edilen spektrumlar- olunur. Bu işlem sırasında çarpışma hücresine gi-
dan farklıdır (Şekil.25/b). ren iyona “öncü iyon” (precursor ion) MS2 spekt-
rumunu oluşturan iyonlara ise “ürün iyonlar” (prod-
Buraya kadarki tüm işlemler MS olarak ad- uct ions) denir (“ebeveyn / atasal” ve “evlat” iyonlar
landırılır. MS/MS veya MS2 olarak anılan ikinci bir – parent and daughter ions – denildiği de olur).
kütle spektrometrisi (tandem MS) ise ilgili Burada dikkat edilmesi gereken, her bir MS2
peptitlerin dizilerinin tespiti için kullanılacak olan spektrumunun tüm peptit iyonları içinden sadece
spektrumu üretir (bazen yeterince ayrıntılı verilerin birine ait parçalanma ürünü iyonlardan oluştuğu-
elde edilebilmesi için dizi analizinin yapılacağı dur.
spektrum birkaç parçalama basamağı sonucunda
elde edilir – MS3, MS4… – ve bu durumda genel Burada ön önemli olgulardan birisi
olarak MSn ifadesi kullanılır [Şekil.27]). Sonuç ola- peptitlerin nasıl parçalandığı ve bu parçaların nasıl
rak dizileme yapılabilecek bir spektrumun elde adlandırıldığıdır. Parçalanan peptitlerin adlandırıl-
edilmesi amaçlanır. (Şekil.28). Bunun için ilk spekt- ması “Roepstorff – Fohlmann – Biemann Adlan-
rumdaki belirli piklere karşı gelen peptitler ikinci bir dırması” olarak anılır. (Şekil.30). En yaygın ve bilgi
basamakta parçalara ayrılır. Bu işlem genelde çar- verici iyonları amino asitler arasındaki amit veya
pışma hücresine alınan moleküllerin üzerine yön- peptit bağının kırılması oluşturur. Yukarıda belirti-
lendirilmiş eylemsiz (inört) gazlar ile gerçekleştirilir. len nedenlerle yeni bir iyonlaşmanın olmadığı par-
Bu amaçla azot molekülleri veya argon veya hel- çalanma işlemi sırasında var olan yükün amino
yum atomları kullanılır. (Şekil.8 ve 29). Geliştirilmiş terminali tarafında kalması ile “b” türü iyonlar,
olan başka parçalara ayrıştırma yöntemleri de var- karboksi terminali tarafında kalmasıyla da “y” türü
dır (örneğin, “ECD – electron capture dissociation / iyonlar oluşur. Quadrupole veya Quadrupole–TOF
elektron yakalama ile ayrışma”, “SID – surface in- türü cihazlarda y-iyonları baskın halde bulunan tür
duced dissociation / yüzey etkinliği ile ayrışma” ve iken, iyon kapanı türü cihazlarda hem b-iyonları
“ETD – electron transfer dissociation / elektron ak- hem de y-iyonları birlikte gözlenir.
tarımıyla ayrıştırma” gibi). Fakat “gaz fazında çar-
pışma etkinliği ile ayrıştırma (CID – collision in- De Novo Sequencing olarak bilinen bu di-
duced dissociation)”, ticari tandem kütle spektro- zileme çalışmalarında, hem yüksek hassasiyet ve
metrelerinde en geniş ölçekte kullanılan tekniktir. süratin avantajları ile hem de pek çok teknik soru-
Parçalanmanın yapısı büyük ölçüde çarpışma nun yarattığı sınırlamalarla karşılaşılır. Örneğin
enerjisine bağlıdır. İlk spektrumun elde edilmesin- aralarında 114Da bulunan iki büyük pik ve bunla-
den önce istenmeyen parçalanmaların oluşumu- rın tam arasında bulunan 57Da’luk küçük bir pik
nun engellenmesi için (örneğin TOF türü cihazlar- nasıl değerlendirilir? Aradaki pik bir zemin gürültü-
da) ilk iyon kapanı içindeki iyonların enerjileri 10eV sü olarak değerlendirilip 114Da’luk pik bir
civarında tutulur. Çarpışma hücresinde ise 60 – asparajin amino asidi olarak mı kabul edilmeli,
70eV’a kadar çıkılır. Doğaldır ki her tür cihaz için yoksa bu bölge arka arkaya sıralanmış iki glisin
ve kullanım esnasında cihazın her bölgesi için amino asidi olarak mı değerlendirilmelidir? Uygu-
kendine has enerji düzeyleri ile uygulama yapılır. lamada uzmanlar neyin zemin gürültüsü, neyin ise
Aynı şekilde çarpışma hücresi içine doğru uygula- gerçek bir veri sinyali olduğunu çok büyük bir do-
nan eylemsiz gazın enerji düzeyi de hassasiyetle ğulukla ayırt edebilmektedirler. Zemin gürültüsü-
ayarlanır. Aslına bakılırsa, cihazların büyük çoğun- nün pek çok kaynağı vardır. Örneğin Şekil.31/a’da
luğunda düşük enerjili CID uygulaması yapılır görülen son derece karmaşık bir “Toplam İyon
(<100eV). Bunun sebebi kırılmaların peptit iskele- Akısı” grafiği içinden elde edilen MS grafiğinde,
tinde meydana gelmesinin amaçlanıyor olmasıdır. ilgili peptit ile birlikte hareket etmiş olan bir Na+
Daha yüksek enerji düzeylerinde ise amino asit iyonunun yarattığı zemin gürültüsü izlenebilmekte-
yan zincirlerinde meydana gelen kopmalara ilişkin dir (yukarıda belirtildiği gibi K+ iyonu da önemli bir
spektrumlar gözlenmektedir. Örneğin bir ‘gaz fa- diğer zemin gürültüsü kaynağıdır). Özellikle kimi
zında CID’ uygulamasında He atomları ortalama proteinlerin belirli dizilerinin bazı iyonlara karşı
20eV’lik ve mümkün mertebe homojen bir enerji yüksek ilgisinin olması doğal ve gerekli bir durum
düzeyi ile yönlendirilirler. Bu enerji düzeyi dikkat olup MS analizinde sorun yaratabilir. Yine izolas-
çekicidir. Hidrojen atomunun iyonizasyon enerjisi- yon ve saflaştırma basamaklarında yapılacak ek-
nin 13,6eV (313kcal.mol–1) olduğu düşünülürse (ki siklik ve yanlışlıklar da çeşitli sorunlara neden ola-
olağan kimyasal reaksiyonlar, enerji alış verişi açı- bilir (MS analizinin doğası gereği, bir açıdan sorun
sından her zaman bu değerin altında kalır), çarptı- yaratan bir veri, diğer açıdan yarar sağlayabilir.
Örneğin buradaki Na+ iyonları yukarıda da belirtil- kasyonun izlerini taşır. Tabi, daha başka bir modi-
diği gibi kütle belirlemede son derece yararlı ola- fikasyon daha ileri bir bölgede meydana gelmişse,
bilmektedir). o zaman spektrumun ilerleyen bölümleri iyice kar-
maşıklaşır. Zira her iki modifikasyona ilişkin kay-
Aslında bazı spektrumların analizinde kar- malar üst üste birikerek analizi zorlaştıracak ölçü-
şılaşılan sorunlar çok daha ciddi olabilmektedir. de beklentilerden sapma yaratırlar.
Örneğin şekil.31/b’de görülen spektrum, çeşitli
“uydu iyonları” (satellite ions) içermesi nedeniyle Bir diğer sorun da bazı fragmentlerin bek-
ilginçtir. Buradaki tandem-MS spektrumu bir lenen yüklerde olmamalarından ileri gelir. Örneğin
Quadrupole-TOF türü cihazdan alınmıştır. İki kez yine şekil.31/b’deki kırmızı okla işaretli pik, aslında
protone olmuş triptik FLYM(Ox)WPNAR dizili m/z değeri 953,44 olan fragmentin +2 yüklü türe-
peptide ilişkin öncül iyon, m/z 607,32’de izlenmek- vidir. Aslında bazı fragmentlerin su veya amonyak
tedir (grafikte yıldız ile işaretli pik / M(Ox); okside kaybetmesi ile de uydu iyonlar oluşabilir. Bu du-
metiyonin). Öncü iyonun MS2 spektrumunda gö- rumda bunlar türüne göre; a -NH veya y -H O
m 3 n-m 2
rülmesi normaldir, zira bu deneyde ürün iyonlar +1 şeklinde adlandırılır. Genel olarak iki değerli peptit
yüklü iken öncü iyon +2 yüklüdür. Burada grafiğin iyonları ile MS2 analizine başlanan sistemlerde tek
altında kırmızı ile işaretlenen Y-M(Ox)-W serisi, yüklü “y” ve “b” türü iyonlar oluşur. Ancak oluşan
dizi etiketidir (peptit etiketi). Ayrıca hemen tüm be- b-iyonların bir bölümü karbonil grubu (C=O; kütle
lirgin pikler y-iyonlarıdır. İyon kapanı türü bir cihaz farkı, 27,9949Da) yitirerek a-iyonlarına dönüşebilir-
kullanılsaydı veya peptitler dizileri içinde fazlaca ler (CO, çok kararlı bir bileşiktir!). Bu durum b-
bazik amino asitler içerselerdi, o zaman düşük iyonlarına ilişkin piklerin şiddetini azaltır.
güçte de olsa b-iyonlarına ilişkin pikler görmeyi
beklerdik. Son olarak belirtilmesi gereken şey ise
(belki de ilk söylenmesi gereken şey), MS/MS ana-
MS2 analizinde önemli sorunlardan biri, lizindeki esas zorluğun izobarik (eş kütleli) olan
prolin’in amino terminal peptit bağı ile aspartat’ın lösin ve izolösin amino asitleri ile çok yakın kütleli
karboksi terminalindeki peptit bağının görece ka- lizin ve glutamin amino asitlerinden kaynaklandı-
rarsız olmasıdır. Bu nedenle bu bağların kırılması- ğıdır (Şekil.1).
nı ilgilendiren pikler, bunlardan önceki ve sonraki
bağların kırılmasıyla ilişkili piklerden daha şiddetli Veri Tabanı Taraması De Novo Dizilemeye Kar-
olurlar (yani ilgili peptidin dizisi içinde oluşabilecek şı:
kırılmalar rasgelelikten uzaklaşır, bu da dizi anali-
zini güçleştirir. Yukarıdaki benzetmeyi sürdürürsek,
Araştırıcılar 1990’ların başından itibaren
Sanger dizi analizinde belirli bazı dizilerdeki birkaç
peptit dizileme probleminin, çözümü çok daha ko-
nükleotidde hiç terminasyon olmamasının yarata-
lay bir veri tabanı karşılaştırma problemine dönüş-
cağı sorunlara benzer nitelikte sorunlar meydana
türülebileceğini fark ettiler. Aslında üç saatlik bir
gelebilir). Aslında prolin’in karboksi terminalinin ve
MS analizinde, her saniye 4 fragment spektrumu-
aspartat’ın amino terminalinin kırılması, enerji ola-
nun alınıp toplamda 43.000 spektruma ulaşıldığı
rak elverişsizdir. Bu bölgelerde daha az kırılma gö-
gerçeği bile dizileme çalışmalarında kompleks ya-
rülmesinin ve diğer taraftaki bağların daha karar-
zılımlar kullanmanın önemini ortaya koyar (bir in-
sızca davranmasının sebebi de budur (şe-
ternet sitesinde belirtildiği gibi; “eğer her bir deney
kil.31/b’deki 457,26 ve 359,19 olarak sıralanan m/z
için yüz tane lisans üstü öğrenciniz yoksa, bilgisa-
değerlerine ilişkin piklerin şiddetlerini kıyaslayı-
yar kullanmanız önerilir”). Fakat veri tabanı karşı-
nız!).
laştırma tekniğini de novo dizilemeden daha kolay
kılan asıl gerçek, doğada bulunabilecek amino asit
Bir diğer sorun belirli bir bölgeden itibaren dizilerinin ancak aşırı ölçüde küçük bir kesiminin
tüm spektrumu değiştirebilir. Eğer çeşitli yan zincir gerçekte var olduğudur. Yani bir proteinden elde
modifikasyonları varsa (serin / treonin edilen bir peptit parçasının amino asit dizisi o pro-
fosforilasyonu ve/veya metiyonin oksidasyonu gibi) teine ilişkin tüm verileri içermese de onun kimliğini
bu modifikasyonu taşıyan fragment iyonları “uydu bir veri tabanı karşılaştırması ile ortaya koyabile-
iyonlar” (satellite ions) diye anılacak şekilde bekle- cek kadar “tek” olabilir. Burada unutulmaması ge-
nenden farklı kütlelerde ortaya çıkarlar (örneğin reken, veri tabanı karşılaştırmasının ancak bir veri
fosfat grubu için 98Da ve –CH3SOH için 64Da’luk tabanı oluşturulabilecek şekilde genom dizilemesi
farklar şeklinde ortaya çıkarlar). Uydu iyonların yapılmış bulunan canlılar için uygulanabilir oldu-
verdiği piklerin şiddeti ile beklenen piklerin şiddeti ğudur. Genomik diziler sayesinde olası polipeptit
arasındaki göreli oran, modifikasyonun sıklığına ürünleri belirlenebilir ve bunlara ilişkin teorik birer
işaret eder. Burada unutulmaması gereken şey MS ve MS2 spektrumu geliştirilip karşılaştırma için
modifiye amino asidi içeren tüm fragmentlerin uydu kullanılabilir. Bu durumda ilgili canlının her hangi
iyon şeklinde davranacağıdır. Böylece modifikas- bir protein izolatı için genel protein içeriği tarama-
yon noktasından itibaren tüm spektrum, bu modifi- sı, veri tabanı ile karşılaştırılan polipeptit parçası
dizileri ile sağlanabilir. MS2 spektrumunu pek çok Temel olarak üç değişik yaklaşımdan bahsedilebi-
farklı algoritmaya göre veri tabanı ile karşılaştırıp lir. “Peptide Sequence Tags” (PST) olarak da bili-
sonuç üreten çeşitli yazılımlar mevcuttur (Peptide- nen bir yaklaşım ve ilgili algoritma, ilk olarak
Search, Sequest, Mascot, Sonar ms/ms, ve Pro- “PeptideSearch” programı tarafından kullanıma
teinProspector gibi). EST (expressed sequence- sunulmuştur. Bu teknik 90’ların ortasında,
tag) projeleri bitmiş canlılar için daha düşük bir de- EMBL’nin Heidelberg Almanya’daki ‘Protein ve
recede olsa da veri tabanı karşılaştırması yapılabi- Peptit Grubunda’ çalıştıklar sırada Matthias Mann
lir. Böyle bir durumda evrimsel olarak yakın akraba ve Matthias Wilm tarafından geliştirilmiştir. Bura-
ve dizileme çalışmaları tamamlanmış olan türlerin daki temel mantık, parçalanma spektrumu içinde
proteomları ile gösterilen yoğun homoloji, kullanışlı çoğu zaman için kolayca tespit edilebilecek dizile-
bir araç haline gelir. Bazen bilinen genomlara ait rin küçük bir serisinin var olduğu gerçeğidir. Örne-
proteom analizinde “mass fingerprinting” veya ğin Şekil.32’deki gibi seriler bir ‘amino asit etiketi’
“peptide mass fingerprinting (PMF Analysis)” deni- içerirler. Bu etiket ilgili piklerinden kolayca tanım-
len bir parmak izi analizi kullanılır. “MALDI- lanabilecek iki veya üç amino asitlik bir bölgedir.
fingerprinting” de denilen bu yaklaşım temel olarak Böylece bir PST tipik olarak üç bölgeden oluşur.
veri tabanındaki her protein için triptik peptitleri be- Merkezi amino asit etiketi ve bu etiketin her iki ta-
lirleyip bunlar için teorik bir spektrum üreterek bu rafında bulunan birkaç amino asitlik bölgelere iliş-
spektrumu elde edilen MS spektrumu (Şekil.26) ile kin kütle verisi (Şekil.32/a’da m1 ve m3) (Doğal
karşılaştırma mantığına dayanır. Fakat pek çok du- olarak böyle bir analizden önce ilgili peptidin nötral
rumda daha özgül ve duyarlı bir tanımlama metodu kütlesi olağan MS spektrumundan tespit edilmeli-
olan “LC-tandem-MS (MS2)” peptit dizilemeye (Şe- dir). Sonuç olarak bu özellikte ve bu sırayla dizil-
kil.9 ve 28) ihtiyaç duyulur. miş üç bölgeye sahip olan veri tabanı dizisi ile ya-
pılacak kıyaslama ile tespit gerçekleştirilmiş olur.
Veri tabanı karşılaştırmasının da kendine Yöntemin gücü şekil.32/b’nin incelenmesi ile daha
has zorlukları ve sınırlamaları vardır. Örneğin bir- net görülebilir. Burada karmaşık bir spektrumun,
kaç farklı peptit istatistiksel olarak önemli ölçüde nasıl belirtildiği gibi üç ana bölümden oluşan ve
yüksek bir güvenilirlikle aynı proteine işaret ediyor- kolay kıyaslanabilir bir yapı haline dönüştürülebil-
sa daha ileri çalışmalara gerek duyulmaksızın ilgili diği daha açık olarak izlenmektedir. Bu şekilde,
proteinin tanımlanmış olduğu kabul edilir. Fakat nötral kütlesi 1378,8 olan atasal peptide ilişkin
görünüşte önemli ölçüde yüksek bir skor veren eş- spektrum, (772,4)LVV(1083,6) şeklinde bir dizi eti-
leştirmeler, bazı çok büyük proteinlerin tespitinde keti halinde organize edilmiştir. Bu yöntem aynı
hatalı sonuçlar üretebilmektedirler. Bunun sebeple- zamanda bir homoloji tarama yöntemi olarak da
ri, büyük proteinlerin hem çok fazla sayıda teorik işlev görür. Eğer program üç bölgeden ikisi için eş-
peptit oluşturup son derece karmaşık bir spektrum lik aranacak şekilde çalıştırılır veya normal olarak
üretmesi hem de pek çok korunmuş dizisine ilişkin böyle sonuç verirse, bir ekson veya domain shuf-
spektrumların başka proteinlerce de oluşturulabilir fling (karıştırma) olayı tespit edilebilir. Ayrıca bu
olmasıdır. Dahası özellikle 7 amino asitten daha yöntem uzunca bir süre boyunca eldeki ilk ve tek
küçük peptitler veri tabanında birden fazla sayıda ücretsiz yazılım olduğu için yoğun olarak kullanıl-
proteinle uyuşup sorun yaratabilirler (7 a.a. = 21 mış ancak pek çok uygulamanın manüel olması,
nükleotid; daha kısa polipeptitlerin genom içinde yaygınlığını ve popülaritesini azaltmıştır. Son za-
tek bir bölgeye özgü olma ihtimalinin azalışı bu manlarda bu tekniği kullanan yazılımların otomas-
mantıkla daha kolay takip edilebilir). Tüm bu se- yon düzeyi artmıştır.
bepler, gerçek durumu burada anlatıldığından da-
ha karmaşık hesaplamalar gerektirecek hale ge- İkinci temel yaklaşım ise Sequest algorit-
tirmektedir (Şekil.41). ması adı altında piyasaya sunulmuştur. Buradaki
temel mantık deneysel olarak elde edilmiş MS2
Bir diğer kısıtlama da genelde sadece “tam spektrumunun, eldeki veri tabanında bulunan
triptik” peptitlerin veri tabanı taramasında kullanı- polipeptitlerin triptik kesim ürünlerinin verebileceği
labilir oluşudur. Böylece oluşan tüm peptit parçala- teorik spektrumlar ile karşılaştırılmasına dayanır.
rının karboksi terminalinde arjinin veya lizin amino Yapılan otokorelasyon ile geliştirilen her teorik
asidinin olacağı önceden bilinir. Bunun nedeni spektruma bir skor verilir. Diğerlerinden istatistik-
tripsin’in tam olarak dizi özgül bir proteaz olması sel olarak anlamlı kabul edilebilecek kadar yüksek
ve son derece az sayıda ‘kısmi-triptik’ ürün oluşu- bir skor alan spektruma ilişkin dizi deneysel spekt-
muna sebep olmasıdır. Bu sayede teorik spekt- ruma kaynaklık eden polipeptidin dizisi olarak ka-
rumların oluşturulması ve farklı uygulamalar ara- bul edilir. (Şekil.33) Bu teknik özellikle düşük sin-
sında bir kalibrasyon sağlanması kolaylaşır. yal/gürültü oranına sahip spektrumlardan sonuç
üretilmesinde güçlü bir uygulamadır. Zira böyle
düşük çözünürlüklü bir spektrumun aksine yüksek
Veri tabanı aracılığıyla tanımlama bir birin-
çözünürlüklü bir spektrumun kullanılması duru-
den farklı yaklaşımlarla yapılır. Her bir yöntemin
munda, ilgili algoritma tarafından gerçekleştirilme-
uygulanışında kullanılan algoritmalar da farklıdır.
Description:spectrometry – MS), proteomik çalışmalarının te- mel analitik yöntemidir. Bu teknik ile proteinlerin kütlelerinin belirlenmesi çok büyük bir hassasiyetle.
