Produção, purificação e propriedades bioquímicas de lipase ácida de Candida viswanathii ALEX ...

216 Pages·2013·0.93 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
unesp
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
(MICROBIOLOGIA APLICADA)
Produção, purificação e propriedades bioquímicas de lipase ácida
de Candida viswanathii
ALEX FERNANDO DE ALMEIDA
Tese apresentada ao Instituto de
Biociências do Câmpus de Rio
Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor
em Microbiologia Aplicada.
Junho - 2012
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
unesp
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO

Produção, purificação e propriedades bioquímicas de lipase ácida
de Candida viswanathii
ALEX FERNANDO DE ALMEIDA
Orientadora: Profa. Dra. Sâmia Maria Tauk-Tornisielo
Co-orientadora: Profa. Dra. Eleonora Cano Carmona
Tese apresentada ao Instituto de
Biociências do Câmpus de Rio
Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor
em Microbiologia Aplicada.
Junho - 2012
547.758 Almeida, Alex Fernando
A447p Produção, purificação e propriedades bioquímicas de
lipase ácida de Candida viswanathii / Alex Fernando Almeida.
- Rio Claro : [s.n.], 2012
212 f. : il., figs., gráfs., tabs.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista,
Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Sâmia Maria Tauk Tornisielo
Co-Orientador: Eleonora Cano Carmona
1. Enzimas. 2. Triacilglicerol acil hidrolase. 3.
Imobilização de enzima. 4. Caracterização de enzima. I.
Título.
Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP
Campus de Rio Claro/SP
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Dedico
este trabalho à minha família
pelo amor, carinho, apoio e fortaleza
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Observei outra coisa debaixo do sol:
Não é o mais veloz que ganha a corrida, nem o mais forte que vence na batalha. O pão não é
para os mais sábios, nem as riquezas para os mais inteligentes, nem o favor para os mais cultos,
porque tudo depende do tempo e do acaso.
(Eclesiastes 9, 11).
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AGRADECIMENTOS

À DEUS, que na sua infinita bondade e sabedoria, concedeu todos os meios
necessários para que este trabalho fosse realizado. Agradeço pelos seus ensinamentos
íntimos à minha alma, instruindo-me a ter paciência nos momentos de tribulações, a não
deixar o barco e esperar sempre Nele, para que Nele eu encontrasse o descanso e o meu
destino.

À Profa. Dra. Sâmia Maria Tauk-Tornisielo pela orientação, confiança, dedicação, amizade e
carinho durante todos estes anos de convivência.
À Profa. Dra. Eleonora Cano Carmona pela co-orientação, dedicação e ensinamentos durante
todo o trabalho.
À Profa. Dra. Rosa dos Prazeres Melo Furriel Inocentes, do Departamento de Química,
FFCRLRP/USP, pelas sugestões, colaboração e auxílio em várias etapas de realização deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. João Atílio Jorge, do Departamento de Biologia, FFCRLRP/USP, pela
colaboração no desenvolvimento deste trabalho.
À Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis, pelo auxílio durante o período sem bolsa de
estudos e por ceder a linhagem de Candida viswanathii para este estudo.
À Profa. Dra. Valéria Marta Gomes de Lima, do Departamento de Ciências Biológicas,
UNESP, campus de Assis, pela metodologia de determinação de atividade lipase por titulação.
Ao Prof. Dr. César Rafael Franchini Terrasan, pelas leituras dos textos, sugestões e ajuda no
laboratório com gratuidade e atenção.
Ao Centro de Estudos Ambientais e ao Departamento de Bioquímica e Microbiologia por
ceder os laboratórios para a realização dos experimentos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Microbiologia Aplicada, UNESP e
seus coordenadores Prof. Dr. Fernando Carlos Pagnocca e Sandra Mara Martins Franchetti.
Às técnicas de laboratório Eleni, Francisca e Amanda, do Centro de Estudos Ambientais pela
amizade e assistência técnica.
À Carmen Silva Casonato de Souza pela assistência técnica, paciência e amizade durante o
trabalho.
Ao Anderson Rodrigues, técnico do Departamento de Biologia, pela sua contribuição com os
géis de eletroforese.
Às empresas cervejaria Baungartner pela doação do bagaço de cevada, Nestlé pela doação de
material de coleta de micro-organismos e Frigorífico Fricock pela doação da gordura de
frango.
Aos funcionários do Centro de Estudos Ambientais-CEA, Jorbson, Reginaldo, Jorge, Marcos
pelos momentos de descontração.
À Sara Cristina Galvão (in memoriam) por toda sua contribuição neste trabalho, momentos de
descontração e atenção e que agora nos deixa a saudade da convivência e a alegria de
podermos ter conhecido alguém que se doou sem pedir algo em troca.
À Ana Carolina Cerri da Silva por toda ajuda e paciência dispensada durante o trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e Microbiologia, da Biblioteca e aos
demais docentes e colegas que de alguma forma contribuíram com o desenvolvimento do
trabalho.
Aos amigos do Mestrado, Doutorado, Iniciação Científica e estágio do Departamento de
Bioquímica e Microbiologia.
Aos amigos do laboratório de Bioquímica de Micro-organismos Adriana Knob, Beatriz
Temer, Cárol C. Terrone, Daniela Turati, Danielle B. Pedrolli e Fabiana C. F. Novaes.
Ao Ministério de Música Católica Luz Divina pelos momentos de oração, partilha e convívio.
Ao Fabrício Coutinho de Paula pela amizade, convivência e as conversas produtivas durante
estes anos de convívio.
Aos amigos Sidnei Kuerten, Aguinaldo Silva, Fabrício Corradini, Frederico Gradela e César
F. Terrasan, e Marcela Satow (eterna agregada), pelos anos de convivência na república do
Genáro. Levaremos em nossa memória momentos inesquecíveis que não foram registrados
em fotografias ou filmes, mas que serão relembrados quando nos encontrarmos com muita
alegria e saudade dos velhos tempos.
À minha noiva Erika Carolina Vieira que me acompanhou durante todo o trabalho. Acolheu-
me em seus braços com amor e ternura. Soube esperar e abdicar de suas vontades durante os
quatro anos de trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão
da bolsa de estudo.
A todos meu
Muito Obrigado
SUMÁRIO

Lista de Tabelas....................................................................................................... i
Lista de Figuras....................................................................................................... iii
Abreviações............................................................................................................. ix
Resumo.................................................................................................................... xi
Abstract................................................................................................................... xiii
INTRODUÇÃO...................................................................................................... 21
OBJETIVOS........................................................................................................... 23
Capítulo 1. REVISÃO DA LITERATURA........................................................... 24
1 Lipases: definição e mecanismo de ação............................................................. 25
2 Métodos para seleção de novas fontes de lipase................................................. 34
3 Produção de lipases microbianas........................................................................ 36
3.1 Fermentação submersa................................................................................... 36
3.2 Fermentação em substrato sólido..................................................................... 37
3.3 Fatores nutricionais....................................................................................... 39
4 Purificação de lipases microbianas.................................................................. 40
5. Imobilização de lipases microbianas............................................................... 44
6 Caracterização de lipases microbianas............................................................ 48
61. Agregação de lipases..................................................................................... 48
6.1 Propriedades bioquímicas de lipases microbianas........................................ 49
7 Aplicações de lipases microbianas................................................................... 53
8 Fontes produtoras de lipases............................................................................ 56
9 Candida viswanathii: descrição, fisiologia e aplicações biotecnológicas....... 58
10 Referências........................................................................................................ 59
CAPÍTULO 2: Influence of carbon and nitrogen sources on lipase production by
a newly isolated Candida viswanathii strain……………………………………... 79

CAPÍTULO 3: Production and biochemical properties of a new extracellular
acid lipase from Candida viswanathii……………………………………………. 108
CAPÍTULO 4: Produção de lipase ácida de Candida viswanathii por
fermentação sólida em subprodutos agroindustriais e propriedades da enzima..... 137

CAPÍTULO 5: Purificação, imobilização e caracterização bioquímica de uma
lipase ácida de Candida viswanathii....................................................................... 167
CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................. 211
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LISTA DE TABELAS

Capítulo 1
Tabela 1. Purificação de lipases microbianas 42
Tabela 2. Propriedades bioquímicas gerais de lipases microbianas 51
Tabela 3. Novas linhagens de micro-organismos produtoras de lipases 57

Capítulo 2
Table 1. Total microorganisms selected for screening of lipase producers. 99
Table 2. Evaluation of lipase production from selected filamentous fungi and 100
yeasts.
Table 3. Lipase production and growth of Candida viswanathii in different pure 101
carbon sources.
Table 4. Lipase production and growth of Candida viswanathii in different natural 102
mixtures of triacylglycerols.
Table 5. Lipase production and growth of Candida viswanathii with different 103
nitrogen sources.
Table 6. Effect of olive oil concentrations in lipase production by C. viswanathii 104
in ammonium nitrate and yeast extract.
Table 7. Parameters of the fermentation for lipase production by C. viswanathii 105
using 1.5% (w/v) olive oil, 0.2% (w/v) yeast extract, 180 rpm and at 28 ºC.

Capítulo 3
Table 1. Analysis of the lipase production parameters by C. viswanathii after 72 126
h of cultivation.
Table 2. Effect of culture pH on growth and lipase production by C. viswanathii 127
Table 3. Effect of the emulsifiers on growth and lipase production by C. 128