Praxis der elektrophoretischen Trennmethoden

299 Pages·1989·9.31 MB·German

by  H. Wagner

Anleitungen
für die chemische Laboratoriumspraxis
Band XXIII
Herausgegeben von
W. Fresenius, lF.K. Huber, E. Pungor,
G.A. Rechnitz, W. Simon, G. Tölg und Th. S. West
Bandherausgeber
Prof. Dr. Horst Wagner, Universität des Saarlandes
Fachbereich 13 - Chemie, Fachrichtung 13.4 - Anorganische Analytik und Radiochemie,
6000 Saarbrücken
Prof. Dr.-Ing. Ewald Blasius t
Herausgeber
Prof. Dr. Wilhelm Fresenius, Institut Fresenius, Chemische und Biologische Laboratorien
GmbH, Im Maisel, D-6204 Taunusstein 4
Prof. Dr. lF.K. Huber, Institut für Analytische Chemie der Universität Wien, Währinger
Straße 38, A-1090 Wien
Prof. Dr. Ernö Pungor, Institute for General and Analytical Chemistry, Gellert-ter 4, H-1502
Budapest XI
Prof. Garry A. Rechnitz, Department ofChemistry, University ofDelaware, Newark, DE 19711,
USA
Prof. Dr. Wilhelm Simon, Eidgenössische Technische Hochschule, Laboratorium für Orga
nische Chemie, Universitätsstraße 16, CH-8092 Zürich
Prof. Dr. G. Tölg, Institut für Spektrochemie, Postfach 778, 4600 Dortmund 1
Prof. Thomas S. West, Macaulay Institute for Soil Research, Craigiebuckler, Aberdeen
AB92QJ, U.K.
Horst Wagner· Ewald Blasius (Hrsg.)
Praxis der
elektrophoretischen
Trennmethoden
Mit 141 Abbildungen und 42 Tabellen
Springer-Verlag
Berlin Heidelberg NewYork
London Paris Toyko
ISBN-13: 978-3-642-73623-0 e-ISBN-13: 978-3-642-73622-3
DOI: 10.1007/978-3-642-73622-3
CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Praxis der elektrophoretischen Trennmethoden / Horst Wagner; Ewald Blasius
(Hrsg.). - Berlin ; Heidelberg ; New York ; London ; Paris; Tokyo : Springer, 1989
(Anleitungen für die chemische Laboratoriumspraxis ; Bd. 23)
ISBN 3-540·19205-0 (Berlin ...)
ISBN 0-387·19205·0 (New York ...)
NE: Wagner, Horst [Hrsg.]; GT
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© by Springer-Verlag Berlin, Heidelberg 1989
Softcover reprint ofthe hardcover 1st edition 1989
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Druck: Kutschbach, Berlin. Bindearbeiten: Lüderitz & Bauer, Berlin
2152/3020-543210 - Gedruckt auf säurefreiem Papier
Autorenverzeichnis
Dr. A. Görg, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechnologie, 8050
Freising-Weihenstephan
Dr.-Ing. S. Günther, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechnologie,
8050 Freising-Weihenstephan
Dipl.-Chem. S. Hoffstetter, Universität des Saarlandes, Fachrichtung Anorganische Analytik
und Radiochemie, 6600 Saarbrücken
Professor Dr. Dr. J. Klose, Freie Universität Berlin, Universitätsklinikum Charlottenburg,
Institut für Toxikologie und Embryonalpharmakologie, Garystraße 5, 1000 Berlin 33
Dr. R. Kuhn, derzeitige Adresse: Analytical Research and Development, Pharma Division,
Sandoz Ltd, Basel, Schweiz
Prof. Dr. W Postei, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechnologie,
8050 Freising-Weihenstephan
Prof. Dr. G. M. Rothe, Johannes Gutenberg-Universität, Fachbereich 21 Biologie, Institut für
Allgemeine Botanik, Postfach 3980, 6500 Mainz
M. Schmid, Techn. Ass., Freie Universität Berlin. Universitätsklinikum Charlottenburg,
Institut für. Toxikologie und Embryonalpharmakologie, Garystraße 5, 1000 Berlin 33
Prof. Dr. H. Wagner, Universität des Saarlandes, Fachrichtung Anorganische Analytik und
Radiochemie, 6600 Saarbrücken
Dr.-Ing. R. Westermeier, Technische Universität München, Allgemeine Lebensmitteltechno
logie, 8050 Freising-Weihenstephan
Dr. K. Ziegler, Universität des Saarlandes, Fachrichtung Anorganische Analytik und Radio
chemie, 6600 Saarbrücken
Vorwort
Dieser Band, entstanden durch die Zusammenarbeit verschiedener Autoren mit
großer praktischer Erfahrung, ist ein wichtiger Beitrag zur Literatur über die Elektro
phorese. Sein Hauptaugenmerk liegt auf den elektrophoretischen Methoden; es wird
daher den Anfängern und Studenten als dringend benötigte Einführung dienen. Die
große Themenbreite und die Güte der Darstellung machen das Werk auch zu einer
wertvollen Referenz für etfahrene Praktiker.
Die Nützlichkeit der Elektrophorese für die Analyse komplexer Proteinmischungen
wurde zum ersten Mal vor 50 Jahren durch Tiselius in seinen mit dem Nobelpreis
ausgezeichneten Arbeiten demonstriert. Sein elegant konstruierter Apparat wurde
jedoch bald durch viel einfachere und breiter anwendbare Methoden, wie Papier
oder Gelelektrophorese, ersetzt. Aus diesen Methoden entwickelten sich die
Molekularsieb-, Disk-, SDS- und Immunelektrophorese und die isoelektrische
Fokussierung. Alle diese Methoden arbeiteten mit einer hervorragenden Auflösung.
Heutzutage ist die zweidimensionale Elektrophorese die ausgefeilteste Methode in
der Proteinanalyse. Darüber hinaus hat sich die Gelelektrophorese vor kurzem als
einzigartiges Werkzeug für die DNA-Sequenzierung erwiesen.
Das Verständnis der theoretischen Aspekte der Elektrophorese verdanken wir zu
einem großen Teil den bahnbrechenden Arbeiten von Kohlrausch vor fast 100 Jah
ren. Die Prozesse sind jedoch zu komplex, um einer mathematisch-analytischen
Lösung zugänglich zu sein. Die diesen Prozessen zu Grunde liegenden Transport
gleichungen und chemischen Gleichgewichte lassen sich am besten durch eine Com
putersimulation verständlich machen. Einige elektrohydrodynamische Effekte sind
nach wie vor zu einem großen Teil unbekannt und bilden gegenwärtig den Gegen
stand aktiver Forschung.
Eine besondere Herausforderung in der modemen Biotechnologie ist die Anpassung
der Elektrophorese an großtechnische Reinigungsverfahren. Die präparative Elektro
phorese in Lösung geht noch auf die Zeit vor Tiselius zurück, das große Potential
dieser Methoden ist jedoch bisher zum größten Teil unbemerkt geblieben. Nur
wenige Zentren widmen sich der systematischen Forschung auf diesem Gebiet,
München, Saarbrücken, Harwell und Tucson, um nur die wichtigsten zu nennen. In
Lehre und Forschung muß noch viel Arbeit bewältigt werden.
Es ist daher offensichtlich, daß die Elektrophorese trotz ihres bewundernswürdigen
Alters eine lebendige Wissenschaft und ein fruchtbarer Boden für innovative For
schung geblieben ist. Ihre Anwendungsbreite reicht von Ionen mit geringem Mole-
VIII Vorwort
kulargewicht bis zu lebenden Zellen, ihren Organellen und sogar intakten Chromo
somen. In der Tat wurden einige der wichtigsten elektrophore tischen Anwendungen
erst in den letzten beiden Jahrzehnten entwickelt, andere werden sich in allernäch
ster Zukunft ergeben. Beispiele für das letztere sind die Elektrophorese im Mikrogra
vitationsfeld einer Raumstation und die Sequenzierung des menschlichen Genoms.
Tucson, USA Milan Bier
Oktober 1988
Inhaltsverzeichnis
Theorie der elektrischen Wanderung
(H. Wagner, R. Kuhn, S. Hoffstetter)
1 Einleitung............................................................... 1
2 Grundlagen .........., . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
3 Einflüsse auf die Wanderungsgeschwindigkeit ............................ 2
3.1 Eigenschaften des geladenen Teilchens............................. .. 3
3.2 Eigenschaften des Mediums ......................................... 5
3.2.1 Einfluß der Ionenstärke... ... .. ... ... ... .... ...... ... ... ... ... . 5
3.2.2 Einfluß des pH-Wertes ......................................... 6
3.2.3 Einfluß der Komplexbildnerkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2.4 Einfluß der Temperatur ........................................ 8
3.2.5 Einfluß des elektrischen Feldes ................................ 9
3.2.6 Einfluß des Trägermaterials .................................... 10
. 3.2.6.1 Ionenwanderung im Träger............................. 10
3.2.6.2 Elektroosmose ......................................... 11
3.2.6.3 Sogströmung ........................................... 11
4 Prinzipien elektrophoretischer Trennmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.1 Zonenelektrophorese ................................................ 11
4.2 Methode der wandernden Grenzflächen ............................. 12
4.3 Isotachophorese ..................................................... 14
4.4 Isoelektrische Fokussierung ......................................... 17
Literatur ................................................................... 19
Praxis der eindimensionalen Gelelektrophorese
(G. M. Rothe)
1 Allgemeines zur Arbeitstechnik.......................................... 21
2 Elektrophoreseapparaturen .............................................. 22
2.1 Geräte für die horizontale Elektrophorese ........................... 22
2.2 Geräte für die vertikale Elektrophorese .............................. 24
x
Inhaltsverzeichnis
3 Die einzelnen Elektrophoreseverfahren ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1 Die Cellogel-und Zelluloseacetat-Elektrophorese .. .... . ............. 25
3.1.1 Die Cellogel-Elektrophorese ................................... 25
3.1.1.1 Anwendungsbeispiele .................................. 29
3.1.1.1.1 Lipoprotein-Muster im Zuge von Hyperlipämien 29
3.1.1.1.2 LDH-Muster .................................. 30
3.1.2 Die Zelluloseacetat-Elektrophorese ............................ 30
3.1.2.1 Vorbereitung der Membranen und Einsatz in der
Elektrophoreseapparatur .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.1.2.2 Anwendungsbeispiele .................................. 33
3.1.2.2.1 Adenylat Kinase .............................. 33
3.2 Die Agar- und Agarose-Elektrophorese .............................. 34
3.2.1 Eigenschaften von Agar und Agarose .......................... 34
3.2.2 Allgemeines zur Agarose-Elektrophorese ...................... 35
3.2.3 Herstellung von Agarose Flachgelen zur Trennung von
DNA-Molekülen nach Schaffner ............................... 36
3.2.4 Aufbau einer Flachgelelektrophorese-Apparatur zur
Trennung von DNA-Molekülen ................................ 38
3.2.5 Probenauftrag ................................................. 38
3.2.6 AnHüben auf DNA ............................................ 39
3.2.7 Bestimmung der Molmasse von DNA-Bruchstücken ........... 40
3.2.8 Elution der DNA aus Agarosegelen ............................ 42
3.2.9 Anwendungsbeispiel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.3 Die Stärkegel-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.3.1 Herstellung von Stärkegelen ................................... 44
3.3.2 Apparative Ausrüstung ........................................ 45
3.3.3 Anwendungsbeispiele .. . .... . . . ... . ....... ... . ... . . . .. ... .. .... 45
3.4 Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese ................................ 47
3.4.1 Allgemeines zur Technik. . . . .... . ... ... .. .. . . .. . . ... . .. . ....... 47
3.4.2 Homogene Gele............................................... 48
3.4.2.1 Bestimmung der Größe von DNA-Bruch-
stücken< 1 Kilobasen .................................. 48
3.4.2.1.1 Abhängigkeit des Fraktionierbereiches
von der Polyacrylamid Konzentration .......... 48
3.4.2.1.2 Herstellung homogener Flachgele ............. 48
3.4.2.1.3 Elektrophoresebedingungen ................... 49
3.4.2.1.4 Elution von DNA aus Polyacrylamidgelen ..... 50
3.4.2.1.5 Herstellung dünner Flachgele ................. 51
3.4.2.2 Die Bestimmung verschiedener Isozym-Typen .......... 52
3.4.2.2.1 Definition des Begriffs Isozym ................ 52
3.4.2.2.2 Herstellen der Gel- und Elektrodenlösungen .. 53
3.4.2.2.3 Eichbeziehungen zur Ermittlung von
ladungs- bzw. molmassenisomeren Isozymen . . . 53
3.4.2.3 Molmassenbestimmung in homogenen SDS-Gelen ..... 54
3.4.2.3.1 Allgemeines zur Technik ...................... 54
3.4.2.3.2 Die Verwendung homogener Gele............. 55
Inhaltsverzeichnis XI
3.4.3 Gradientengel-Elektrophorese ................................. 62
3.4.3.1 Allgemeines zur Technik............................... 62
3.4.3.2 Das Herstellen linearer Gradientengele ................ 63
3.4.3.2.1 Die Herstellung von Glaskassetten ............ 63
3.4.3.2.2 Das Gießen linearer Gelgradienten .. . . . . . . . . . . 65
3.4.3.3 Die Bestimmung der molekularen Größe nativer Proteine 67
3.4.3.3.1 Die Bestimmung der maximalen Wanderungs-
strecke von Proteinen ......................... 68
3.4.3.3.2 Das Trennverhalten ladungsisomerer Proteine.. 74
3.4.3.3.3 Das Trennverhalten molmassenisomerer
Proteine ...................................... 74
3.4.3.3.4 Die Ermittlung des Stokes-Radius nativer
Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.4.3.3.5 Die Bestimmung der Molmasse nativer Proteine 78
3.4.3.3.6 Die Bestimmung der Molmasse SDS-
denaturierter Proteine ........................ 80
3.4.4 Elution von Proteinen aus Polyacrylamidgelen ................. 85
3.4.5 Affinitäts-Elektrophorese ...................................... 87
3.4.5.1 Anwendungsbeispiele .................................. 89
Literatur 89
Praxis der Papier-, Dünnschicht-bzw. Säulenelektrophorese und
Anwendungsbeispiele aus dem Bereich der anorganischen Chemie
(K. Ziegl~r)
1 Allgemeine Gesichtspunkte zur Arbeitstechnik 94
1.1 Trägermaterialien ................................................... 94
1.1.1 Papiere ........................................................ 95
1.1.2 Trägermaterialien für die Dünnschichtelektrophorese .......... 96
1.1.3 Trägermaterialien für die Säulenelektrophorese ................ 96
1.2 Grundelektrolyt ..................................................... 98
1.3 Auftragung der Probe ............................................... 99
1.4 Auswertung der Pherogramme ...................................... 100
1.4.1 Papier-bzw. Dünnschichtelektrophorese ....................... 100
1.4.1.1 Qualitative Auswertung................................ 100
1.4.1.2 Quantitative Auswertung............................... 100
1.4.1.2.1 Direktbestimmungsmethoden ................. 101
1.4.1.2.2 Elutionsmethoden ............................ 101
1.4.2 Säulenelektrophorese .......................................... 101
2 Apparaturen ............................................................ 102
2.1 Papier-bzw. Dünnschichtelektrophorese ............................. 102
2.2 Säulenelektrophorese ............................................... 105