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深圳地区粉尘螨 类变应原基因的多态性分析
!
及其表达蛋白的变应原性鉴定
白 羽，吉坤美，刘志刚!，蔡成郁
（深圳大学生命科学学院，广东深圳 (41&)&）
摘要：粉尘螨!类变应原（I$:E!）是粉尘螨 -./($#’01$*’+2.3 4$/+&$.主要变应原之一，可引发"型变态反应。从深
圳地区挑取活粉尘螨，经形态鉴定后纯培养，提取其总H-3，HJ/KLH扩增出I$:E!基因，克隆到?MI41/J载体后测
序。通过计算机软件分析该基因的多态性。将该目的基因克隆到?5J/N8;表达载体上得到重组质粒?5J/I$: E!。
工程菌经+KJO诱导培养，表达I$:E!目的蛋白，该蛋白主要以包涵体形式存在。重组I$: E!蛋白通过)N8;/C7<蛋
白纯化系统进行分离、纯化，并进行P$;C$:#Q9BC检测该重组蛋白与对粉尘螨过敏患者血清中 +<5的反应性。结果
表明，克隆的(株深圳地区的I$: E! 基因与O$#R7#S公布的I$: E!（3R40((1&T4）核苷酸序列同源性为0)T1U V
00T2U，推导的氨基酸序列同源性为02T1UV01T)U。表达纯化的(种重组I$:E!蛋白经P$;C$:#Q9BC检测，表明都
具有良好的变应原性。
关键词：粉尘螨；I$:E!；变应原；基因多态性；原核表达
中图分类号：W0)) 文献标识码：3 文章编号：&.(./)%0（) %&&’）&)/&()&/&’
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基金项目：国家“1)2”计划（%&&%33%4.&44）；国家自然科学基金项目（2&.’4(&(，2&%’4%%)）；广东省科技重大专项（%&&232&1&(&%）；粤港关键领
域重点突破项目（%&&(.01%%&’）；深圳市科技计划资助项目
作者简介：白羽，男，401%年生，辽宁人，学士，主要从事分子生物学方面的研究，5/6789：67:;<$#$=>8?@4)2@AB6
!通讯作者 3"CDB:EB:AB::$;?B#F$#A$，5/6789：9G<=;G"@$F"@A#
收稿日期 H$A$8>$F：%&&)/&1/&’；接受日期 3AA$?C$F：%&&’/&4/&(
6期 白 羽等：深圳地区粉尘螨!类变应原基因的多态性分析及其表达蛋白的变应原性鉴定 064
变态反应疾病是临床上的常见病和多发病，已 螨特异性 :;<阳性且反应达"级或"级以上的患者
成为危害人们健康的主要问题之一。它是由于人体 血清4/例进行混合，作为阳性血清；另取 4/ 例粉
吸入、食用或接触过敏原引起的。尘螨中粉尘螨 尘螨特异性 :;<阴性的健康人血清4/例进行混合，
!"#$%&’()%*’+,"- .%#+/%" 和屋尘螨 !"#$%&’()%*’+,"- 作为阴性血清。二者分装后T!/Q低温保存备用。
(&"#’/0--+/1- 是最常见的吸入性变应原，其分泌物、排 !"$ 粉尘螨总%&’的提取
泄物以及尸体的降解产物等会造成过敏反应，并可 挑取干净的活粉尘螨约 0// 余只，加液氮研磨
能引发哮喘、鼻炎、异位性皮炎等多种变态反应性疾 后，使用JKG提取试剂盒提取总JKG。
病。美国纽约的一项调查显示，多达!"#$%以上的 !"( %)*+,%扩增及其产物的克隆与鉴定
哮喘病人对尘螨过敏（&’()*+,,+ "& %2-，.//0）。 根据 &2NU+N8 提供的 12’ 3!序列（登录号
粉尘螨!类变应原（12’ 3!）是主要的过敏原成 GU4700!/#4）设计特异性引物，上游引物为 0V@
分之一，其前体由456个氨基酸组成，经过去除信号 +>;+>>>))++++>)>>;>;))>>>)+@"V， 下 游 引 物 为 0V@
肽加工处理后为4.7个氨基酸，分子量为 45 81，无 >>++>)+);;+>>>>+))+>;;;@"V，引物由上海生工公司合成。
糖基化位点（孙劲旅等，.//"）。在$/% 9!/%的尘 反转录反应参数为：0/Q反应 "/ MBN，接着 75Q预
螨过敏患者中，其血清的 :;<结合12’ 3!，并呈现强 变性 0 MBN，再按以下参数进行 =SJ：75Q "/ ?，
阳性反应（=,+>>?@AB,,? "& %2-，477.）。 0!Q 4 MBN，$.Q 4 MBN，"/ 个循环，最后 $.Q反应
尘螨作为世界性分布的物种在不同地区其主要 4/ MBN，=SJ反应采用高保真=3( 1KG聚合酶。将扩
变应原可能存在差异包括基因序列的多态性。国内 增产物电泳后切胶回收纯化，使用 D+W 1KG聚合酶
有关 12’ 3!基因的克隆有少量报道（郝敏麒等， $.Q反应./ MBN加 G碱基末端，并连接到 CA14!@D
.//"；杨庆贵和李朝品，.//5；朱健琦等，.//6），但 载体上。将重组质粒转化进大肠杆菌 5- 6’2+
对同一城市室内粉尘螨 12’ 3!基因多态性进行系 DXC4/LV。通过含GMC、Y@&+,和 :=D&的PU平板进行
统的研究国内外尚未见报道。我们利用基因工程技 蓝白斑和抗氨苄筛选，挑取白色菌落（可能含重组质
术克隆了深圳地区粉尘螨12’ 3! 基因，并分析了该 粒），PUZGMC 培养，碱裂解法提取质粒，并用 56’J#
地区12’ 3!基因的多态性，这将为我国进行具有自 和 3+/F" 酶切鉴定。先后选取 "/ 个酶切片段大小
主区域特色的粉尘螨分子疫苗的研究奠定基础。 正确的质粒进行1KG序列分析（由上海生工公司完
成）。
! 材料与方法 !"- 构建重组表达质粒
根据 &2NU+N8 提供的 12’ 3!序列（登录号
!"! 样品与主要试剂 GU4700!/#4）设 计 表 达 引 物，上 游 引 物 为 0V@
从深圳0个行政区共选 0/ 个室内地点采集活 ;);;;+>))+>;+>>>))++++>)>>;>;))>>>)+@"V，下游引物为 0V@
螨样本，根据形态特征分离获得粉尘螨，并进行人工 ;);;);++;)>>++>)+);;+>>>>+))+>;;;@"V，引物由上海生工公
纯培养。原核表达载体 C<D@EB? 为本研究室保存。 司合成。以上述序列测定正确的12’ 3! )1KG基因
CA14!@D载体、限制性内切酶 3+/F" 与 4%$E#、 为模板进行 =SJ，反应参数为：75Q "/ ?，0!Q 4
D5连接酶、GAH反转录酶等购自 D+I+J+公司。高 MBN，$.Q 4 MBN，.$个循环，最后$.Q延伸4/ MBN。
保真 =3( 1KG 聚合酶购自 L2’M2N>+? 公司。JKG 提 将扩增产物回收纯化，用 4%$E#和 3+/F" 双酶
取试剂盒、1KG 片段纯化试剂盒购自 OB+;2N 公司。 切，并将目的基因连接到 C<D@EB? 表达载体的
KB@KDG ’2?BN 及柱子购自GM2’?*+M =*+’M+)B+ 公司。 4%$E#和 3+/F" 之间，得到重组质粒 C<D@12’ 3
!"# 血清 !。将酶切片段大小正确的质粒再进行 1KG序列
血清取自深圳市第一人民医院变态反应科，选 分析（由上海生工公司完成）。
择临床上经粉尘螨皮试呈阳性的过敏性哮喘和过敏 !". /01 2!基因多态性分析
性鼻炎患者的血清"/例，并选择经粉尘螨皮试呈阴 根据上述测序结果，采用 UBX<FB>软件进行序列
性的健康人血清"/例。其中所有患者无传染病史， 同源性比较，并选用 &2NU+N8 公布的 12’ 3!序列
粪检虫卵阴性。分别采集静脉血各0 MP，经"$Q静 （GU4700!/#4）作为参照。
置5 *，然后 0 ///R ;离心 0 MBN收集上层血清，再 !"3 /01 2! 蛋白的诱导表达
选用法玛西亚SG=变应原自动监测系统，收集粉尘 参照朱健琦等（.//6）方法进行。
O#! 昆虫学报 *"+(!&+#)#,#-%"(.%&%"( O"卷
!"# 包涵体的洗涤、纯化及变复性研究 种基因形态，分别命名为 (P%1QP%1 14I@、(P%1QP%1
参照朱健琦等（!""#）方法进行。 14I!、(P%1QP%1 14IN、(P%1QP%1 14IE和 (P%1QP%1 14IO，
!"$ 重组%&’ (!的变应原性鉴定 这O株粉尘螨F;$@B):)$%& ’!质粒的双酶切电泳结
将上述纯化的重组 $%& ’! 变应原进行 ($() 果见图!。在N"个重组质粒的测序结果中，编号分
*+,-，经胶湿法转膜后进行 .%/0%&1 2340分析，采用 别为(P%1QP%1 14I@、!、N、E和O的分别有B、R、E、O和
上述确诊为粉尘螨过敏患者的人血清混合后作为阳 #个相同的质粒，可见每一种株型至少有 E 个单菌
性血清并以不对尘螨过敏的健康人血清混合后作为 落测序结果一致。将这 O 株 $%& ’! J$C+ 序列与
阴性血清对照，分别用这两种血清作为一抗，生物素 ,%1<=1?公布的 $%& ’!序列（+<@AOOB"S@）比较，其
标记的羊抗人 56-作为二抗，再用链霉亲和素标记 核苷酸的同源性为 A#SBT UAASNT（图 N），推导的
的78*反应，加 7 9 和 :;<显色。.%/0%&1 2340按 氨基酸序列与 ,%1<=1? 公布的 $%& ’!氨基酸序列
! !
(=>2&44? 等（@ABA）方法进行。根据显色结果判断重 （+<@AOOB"S@）同源性为ANSBT UABS#T（图E）。
组$%& ’!蛋白的变应原性。
) 结果
)"! *+,-.*扩增%&’ (!片段
以从活粉尘螨提取的总8C+为模板，利用特异
性引物进行 8:)*D8，产物经琼脂糖凝胶电泳，可见
约E"" 2F 左右的条带，大小与理论预计值相符
（图@）。
图! 粉尘螨F;$@B):)$%&’!（深圳株@UO号）质粒
的 ’()7"V$%&K# 双酶切电泳图谱
GH6I ! -3%J0&4FP4&%/H/4’F&4KLJ0/4’F;$@B):)$%&’!
F3=/>HK/K4L23%JL02W ’()7"V$%&K#
;：$C+相对分子质量 $C+>=&?%&；@UO：分别表示经
’()7"V$%&K#双酶切后F;$@B):)$%&’!（深圳株@UO号）质粒
F;$@B):)$%&’!F3=/>HK（(P%1QP%114I@XO）JL02W ’()7"V$%&K#I
)"1 表达载体 /2+,%&’ (!的构建、酶切及序列鉴
定
图@ $%&’! 的8:)*D8产物电泳图谱 根 据 ,%1<=1? 提 供 的 $%& ’ ! 序 列
GH6I @ 8:)*D8=>F3H’HJ=0H414’$%&’!
;：$C+相对分子质量$C+>=&?%&；@：$%&’!基因8:)*D8 （+<@AOOB"S@），设计了@对表达引物，分别以上述从
产物$%&’! 8:)*D8F&4KLJ0；!：空白对照C%6=0HM%J410&43I 深圳地区克隆的O株$%& ’! 基因为模板，经*D8扩
)") 重组载体 /0%!#,+,%&’ (!的构建、测序和多 增后产物切胶回收纯化，用 ’()7"和 $%&K# 双酶
态性分析 切并将目的基因克隆到 F-:)7H/表达载体 ’()7"
将回收后的 *D8产物连接到 F;$@B):载体上， 和 $%&K# 之间，分别得到 O 种重组质粒 F-:)$%& ’
挑取阳性克隆进行 !"#8"和 $%&K# 双酶切鉴定， !。对阳性克隆进行 $%&K#和 ’()7"双酶切及
所得插入片段与 8:)*D8 产物的电泳分子量一致 琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明，插入的 $%& ’!基
（注：因包含 F;$)@B上的多克隆位点序列，!"#8") 因片段大小为 E"" 2F 左右，与预期的大小相一致
$%&K# 双酶切的小片段理论值为EN" 2F左右）。挑 （图O）。再进行$C+序列分析，以确保插入的 $%& ’
片段序列准确无误。所构建的重组质粒的表达产
选N"个经双酶切鉴定大小正确的重组质粒送上海 !
生工生物工程技术服务有限公司进行 $C+序列测 物带有#组氨酸标签，方便蛋白的纯化。
定。利用 <H4-KH0生物软件分析测序结果，可分为 O
H期 白 羽等：深圳地区粉尘螨!类变应原基因的多态性分析及其表达蛋白的变应原性鉴定 "H!
图! 克隆的深圳地区"株#$%&!基因与’$()*(+公布的#$%&!（,)-.""/01-）核苷酸序列比较结果
2345 ! 236$7#8,9$:;$(7$9<&#$%&! &%<=>?$(@?$(A3BC*(D7<=E*%39<(F3B?
B?$?<=<G<4<;94$($3(’$()*(+（,)-.""/01-）
"U! 昆虫学报 ’()"*&)+#+,+-%(".%&%(" "0卷
图! 克隆的深圳地区"株#$%&!基因与’$()*(+公布的#$%&!（,)-.""/01-）氨基酸序列比较结果
2345 ! 236$*73(8*93:;$<=$(9$;8&#$%&! &%87>?$(@?$(A3BC*(:987D*%3;8(E3B?B?*B8&
B?$?878F848=;4$($3(’$()*(+（,)-.""/01-）
析和复性纯化了"种#$% &!重组蛋白，经>#>IS,’G
显示，本研究获得了纯度较好的来源于深圳地区粉
尘螨物种基因的"种#$% &!重组蛋白（图Y）。
图" 以深圳地区"株粉尘螨基因构建的DGHI#$%&!
质粒的 !"#J"K$%&:#双酶切鉴定
2345 " GF$9B%8D?8%$;3;8&D%8:=9B;8&DGHI#$%&!
DF*;73:;:8=LF$9=BLC !"#J"K$%&:#
M：#N,相对分子质量 #N,7*%+$%；
-O"：分别表示经 !"#J"K$%&:#
双酶切后的DGHI#$%&!（深圳株-O"号）质粒DGHI#$%&! 图U 粉尘螨#$%&!基因原核表达形式的>#>IS,’G分析
DF*;73:（>?$(@?$((85-P"）9=BLC !"#J"K$%&:#5 2345 U >#>IS,’G*(*FC;3;8&B?$$ZD%$;;38(
!"# 重组蛋白的表达和纯化 *(:D=%3&39*B38(8&#$%&!
M：蛋白质分子量标准S%8B$3(78F$9=F*%E$34?B7*%+$%；
含有 DGHI#$% &! 的表达菌株经终浓度为 - -：空白菌对照 N$4*B36$98(B%8F；
778FKQ的 RSH’ 诱导 T ? 后，表达的蛋白进行 >#>I WOU：分别为深圳株-O"号DGHI#$%&!
S,’G，经考马斯亮蓝染色，结果显示 " 个阳性克隆 诱导后菌体 GZD%$;;38(D%8:=9BLCDGHI#$%&!（>?$(@?$((85-P"）5
菌株在-" +# 左右处均有外源蛋白表达的条带出 !"$ 重组蛋白的%&’(&)* +,-(鉴定
现，蛋白分子量与预计值相符（图 U）。这 " 种 #$% & 以对粉尘螨过敏患者的血清作为一抗进行
基因表达量从电泳分析来看，无显著差异。破碎 [$;B$%( LF8B，结果表明这 " 种重组蛋白均能与对粉
!
菌体分别取上清液和沉淀进行可溶性分析，经 >#>I 尘螨过敏患者血清中的 R4G反应，而均不与健康人
S,’G显示，#$% &! 蛋白只在沉淀中大量积累，主要 （指不对尘螨过敏）血清中的 R4G反应，说明诱导表
以包涵体的形式在菌体内表达（图未显示）。利用 达的这"种来源于深圳地区的粉尘螨基因的重组蛋
DGH载体"V端的 U 组氨酸标签，采用 N3WX 柱亲和层 白#$% &! 均具有良好的变应原性（图/）。
O期 白 羽等：深圳地区粉尘螨!类变应原基因的多态性分析及其表达蛋白的变应原性鉴定 FOF
报道的淮南地区的 "#$ %! >"&- 序列与 .#4R34C
（-RDLFFHPSD）报道的序列完全一致。我们对深圳市
室内粉尘螨 "#$ %!基因多态性进行了较系统的研
究，深圳地区 "#$ %!的 >"&-序列与国内外报道的
序列有较大的差别，虽然广州和深圳地理位置相近，
但没有发现郝敏麒等（(PPK）报道的广州地区"#$ %!
多出一段插入序列的基因。通过比较发现郝敏麒等
（(PPK）报道的广州地区"#$ %!多出的这段插入序列
与.#4R34C（-THO(HKH）"#$ %!的内含子序列完全一
致，这段多出的序列是否为内含子尚待讨论，因为
UG+,VU有可能由于提取U&-时污染了基因组 "&-
而出现扩增出含有内含子的基因组 "&-。此外，我
图! 粉尘螨"#$%! 基因原核表达产物经&’()
亲和柱纯化、复性后的*"*+,-./分析 们发现深圳地区粉尘螨"#$ %!基因的 >"&-序列在
0’12 ! *"*+,-./343567’78%9:$’%’#;"#$%! 9$8<#’4 DDP位均为天冬酰胺（-74）、D(H 位均为异亮氨酸
=6&’() >?#53<’41$#7’4
（J5#），这种特殊的基因多样性特征是否为深圳地区
@：蛋白质分子量标准,$8<#’4A85#>:53$B#’1?<A3$C#$；
DEF：分别为深圳株DEF号9/G+"#$%!原核表达产物 粉尘螨物种的区域特征，还有待进一步研究。另外，
经&’()亲和柱纯化的蛋白 我们还发现其序列在!D，!N，!F，!O，HP，L(，LK，DPF和
,:$’%’#;"#$%!9$8<#’4=6&’() >?#53<’41$#7’42 DKF位氨基酸残基处有多态性。这些变异是否位于
G细胞和 R细胞的识别区域，从而影响人体免疫应
答，还有待进一步研究。
本实验中，我们采用了 0#$A#4<37公司的高保真
,%: "&-聚合酶进行 ,VU扩增，该酶可以校正扩增
过程中产生的碱基突变。我们克隆的每一种株型的
"#$ %!至少有 N个单菌落测序结果一致，从而排除
了,VU反应过程中出现的突变而误导基因多态性
的分析（孙劲旅等，(PPK）。
本实验克隆表达了深圳地区粉尘螨 "#$ %! 基
因，这将为我国进行具有自主区域特色的粉尘螨变
图H I#7<#$4=58<检测重组蛋白"#$%!与血清中J1/的结合 应原基础研究以及分子疫苗、免疫诊断等临床应用
0’12 H "#<#><’848%<?#=’4;’418%"#$%!B’<?J1/’47#$3%$8A
研究奠定基础。
93<’#4<7355#$1’><8 !"#$%&’()%*’+,"-.%#+/%" =6I#7<#$4=58<
@：蛋白质分子量标准,$8<#’4A85#>:53$B#’1?<A3$C#$；
参 考 文 献（"#$#%#&’#(）
D，K，F，!，L：分别代表深圳株DEF号"#$%!纯化后的蛋白
与阳性血清反应（)）"#$%! $#3><’84B’<?J1/%$8A987’<’M#7#$3；
(，N，O，H，DP：分别代表深圳株DEF号 "#$%!纯化后的 .$:>?3553U*，,841$3>’> T，,53:< @，/M347 U，W’74#77 V@，I35<#$ @，
蛋白与阴性血清反应（Q）
<’M#>84<$852 V$3’4/0，X3<<34@，@8$134IT，*<#’4=3>?*，*<8:<T，@35’4;Y3C.，
*A3$<< /，@’<>?#55 Z，(PPFS J44#$ >’<6 37<?A3 7<:;6：$#53<’847?’97
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! 讨论
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Z38@\，]: T，^?841 &*，(PPKS >"&->584’41 34; 7#_:#4># 343567’78%
尘螨是自由生活的螨类，呈世界性分布，不同地 A3‘8$355#$1#48% !"#$%&’()%*’+,"- .%#+/%"（"#$ %(）’4 78:<? V?’432
区的尘螨物种的主要变应原可能存在差异包括序列 4)+/"-"0’6#/%2’.7%#%-+&’2’*3%/,7%#%-+&+8!+-"%-"-，(D（K）：DOPQ
的多态性。国外报道"#$ %!的>"&-序列在!O，LL， DOKS［郝敏麒，徐军，钟南山，(PPKS 华南地区粉尘螨主要变应原
"#$%(的>"&-克隆及序列分析2中国寄生虫学与寄生虫病杂
DDD 和 D(F 氨基酸残基处有多态性（孙劲旅等，
志，(（D K）：DOPQDOK］
(PPK）。国内郝敏麒等（(PPK）报道的广州地区粉尘
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原分子生物学特性@ 国外医学：寄生虫病分册，AK（N）：45OP >’2"0","&%*+-%’%*+，T（5 J）：J4APJ467［朱健琦，刘志刚，高波，
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6"7#’+, "5 8’47% 9’%:$#.%2; "5 -*%$’*$ +’) <$*4’","&;（=+27#+, （责任编辑：黄玲巧）
