Pinus pinaster Ait.

319 Pages·2014·23.89 MB·French

UNIVERSITÉ D’ORLÉANS

ÉCOLE DOCTORALE SANTE, SCIENCES BIOLOGIQUES ET CHIMIE DU VIVANT

INRA Centre Val de Loire
Unité Amélioration, Génétique et Physiologie Forestières

THÈSE
présentée par :
Alexandre MOREL

Soutenance publique le 20 mars 2014

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université d’Orléans
Discipline/ Spécialité : Biologie Végétale et Forestière

Physiologie moléculaire du développement
des embryons somatiques de pin maritime
(Pinus pinaster Ait.) : approches
transcriptomique et protéomique

THÈSE dirigée par :
Marie-Anne LELU-WALTER Directrice de Recherches INRA Orléans

RAPPORTEURS :
Pierre COUTOS-THEVENOT Professeur Université Poitier
Hervé ETIENNE Chercheur (HDR) CIRAD Montpellier
__________________________________________________________________

JURY :
Françoise CORBINEAU Professeur Université Pierre et Marie Curie Paris VI
Eric LAINE Professeur Université Orléans
Caroline TEYSSIER Chargée de Recherches INRA Orléans
Remerciements

Je tiens à remercier en premier lieu tous les membres de mon jury d’avoir accepté d’évaluer
mon travail.

J’exprime toute ma gratitude à Marie-Anne LELU-WALTER pour m’avoir permis de réaliser
mes travaux au sein de son équipe. Pour les responsabilités qui m’ont été confiées durant mon
séjour au laboratoire, témoignage de sa confiance, pour sa passion envers les "bébés plantes"
qu'elle a su me transmettre avec générosité, ainsi que pour sa grande expérience de chercheur
qui m'a permis de tenir le cap et d'achever ce projet.

Je remercie Caroline TEYSSIER d’avoir accepté de co-encadrer mes travaux de recherche,
pour son implication de tous les instants, ses critiques constructives, sa patience et sa
gentillesse sans faille apportées tout au long du projet.

J’exprime toute ma reconnaissance à Philippe Label qui a toujours répondu présent et été de
très bon conseil, de par ses réflexions pertinentes et sa rigueur.

Je tiens à adresser tous mes remerciements à Gilles Pilate de m'avoir accueilli au sein de
l'Unité AGPF et toutes les personnes qui ont partagé ma présence dans l'unité, et en particulier
à Claire Le Metté, Kevin Ader et Nathalie Boizot pour leur aide précieuse dans la réalisation
de mes différentes manips. Un grand merci à Patricia Montes, Brigitte Viguier, Franck
Rogeon et Jean-Léandre Haton pour leur grande disponibilité, parce qu'il n'y a pas que la
paillasse dans la vie.

Merci aussi à toutes les équipes de recherche avec qui j'ai eu le privilège de travailler tout au
long de ce projet :

Jean-François Trontin du FCBA de Bordeaux, pour sa participation active et son aide
précieuse dans mon projet, ainsi que Isabelle Reymond.

Françoise Corbineau, de part le grand intérêt qu'elle a porté à mon travail et pour sa
disponibilité, et son équipe du LCMP de Jussieu, en particuliers Dominique Vinel et Alain
d'Harlingue.

Martin Vágner et son équipe de l'Institut expérimental de botanique à Prague, et en particulier
Kateřina Eliášová et Bedřich Pešekc.

Martin Cadene et Martine Beaufour du CBM à Orléans, Stéphane Claverol et Anne-Marie
Lomenech de l'équipe Protéome au CGFB de Bordeaux.

Sans oublier une pensée particulière à ma famille et mes proches pour leur soutien.
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Table des matières

ABREVIATIONS.....................................................................................................................1
INTRODUCTION GENERALE............................................................................................6
CHAPITRE I - Etat de l’art....................................................................................................8
Partie I - Le pin maritime......................................................................................................8
I.1. Habitat du pin maritime...............................................................................................8
I.2. Importances agronomique et industrielle du pin maritime........................................10
I.3. Caractéristiques botaniques.......................................................................................12
I.4. Reproduction sexuée du pin maritime.......................................................................14
I.4.1. La proembryogenèse...........................................................................................16
I.4.2. Embryogenèse précoce.......................................................................................19
I.4.3. Embryogenèse tardive.........................................................................................19
I.4.4. Maturation et déshydratation..............................................................................20
I.5. Programme d’amélioration et variétés améliorées du pin maritime..........................22
I.6. Effets post-tempêtes...................................................................................................26
Partie II - Multiplication végétative du pin maritime........................................................28
II.1. Bouturage horticole..................................................................................................29
II.2. Greffage horticole.....................................................................................................29
II.3. Embryogenèse somatique.........................................................................................30
II.3.1. Initiation des masses embryogènes....................................................................32
II.3.2. Multiplication des masses embryogènes...........................................................32
II.3.3. Cryoconservation des masses embryogènes......................................................33
II.3.4. Développement et maturation de l’embryon somatique cotylédonaire.............34
II.3.5. Germination de l’embryon somatique cotylédonaire et développement en plant
......................................................................................................................................35
II.3.6. Essais au champ de plants de pin maritime.......................................................35
II.3.7. Place de l'embryogenèse somatique dans les programmes d'amélioration........37
II.3.7.1. Appui des biotechnologies pour maximiser le gain génétique...................37
II.3.7.2. Association de l'embryogenèse somatique et de la cryoconservation........38
Partie III - Marqueurs moléculaires du développement des embryons somatiques et
zygotiques.............................................................................................................................40
III.1. Embryogenèse précoce............................................................................................49
III.1.1. Expression des gènes dans le suspenseur.........................................................49
III.1.2. Evénements précoces de mort cellulaire programmée.....................................49
III.1.3. Gènes régulant le cycle cellulaire et la paroi cellulaire....................................50
III.1.4. Les gènes de régulation du développement embryonnaire..............................51
III.1.4.1. Gènes Leafy Cotylédon (LEC)..................................................................51
III.1.4.2. Gènes de type WUSCHEL et WUSCHEL-related homeobox (WOX)....52
III.1.4.3. Récepteur kinase de l'embryogenèse somatique (SERK).........................52
III.1.5. Protéines extracellulaires..................................................................................53
III.1.5.1. Arabinogalactane protéines, chitinases et lipochitooligosaccharides........53
III.1.5.2. Protéines transporteur de lipides non-specifiques (LTPs).........................53
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III.1.5.3. Germines et Germin-Like Proteins (GLP)................................................54
III.2. Embryogenèse tardive.............................................................................................55
III.2.1. Protéines de réserve..........................................................................................55
III.2.1.1. 11S globuline ou legumine-like................................................................56
III.2.1.2. 7S globuline ou viciline-like.....................................................................57
III.2.1.3. 2S albumine...............................................................................................57
III.2.2. Glucides et amidon...........................................................................................57
III.2.2.1. Métabolisme des glucides lors de l'embryogenèse....................................58
III.2.2.2. Oligosaccharides non-réducteurs..............................................................59
III.2.3. Acide abscissique (ABA).................................................................................60
III.2.4. Protéines abondantes de l'embryogenèse tardive (LEA)..................................61
III.2.5. Les protéines de réponse au choc thermique (HSP).........................................62
Partie IV - Méthodologies de la physiologie moléculaire..................................................63
IV.1. Approche de transcriptomique globale...................................................................65
IV.1.1. Séquençage par terminaison cyclique réversible d’Illumina/Solexa...............65
IV.1.2. Difficultés de l’assemblage..............................................................................67
IV.2. Approche de protéomique globale..........................................................................70
IV.2.1. L'électrophorèse bidimensionnelle (2DE)........................................................70
IV.2.2. Limites de la protéomique bidimensionnelle...................................................74
IV.3. Annotations des séquences......................................................................................74
IV.4. Physiologie moléculaire et intégrative....................................................................75
Partie V - L'embryogenèse somatique du pin maritime aujourd’hui : problématique et
objectifs................................................................................................................................78
Références............................................................................................................................82
CHAPITRE II - Événements moléculaires précoces impliqués dans le développement
des embryons somatiques de Pinus pinaster Ait. en réponse à la disponibilité réduite de
l'eau : analyses transcriptomique et protéomique..............................................................97
II.1. Présentation de la publication....................................................................................97
II.2. Publication.................................................................................................................100
Résumé...........................................................................................................................100
Summary........................................................................................................................101
Abbreviations.................................................................................................................101
Introduction....................................................................................................................102
Material and Methods.....................................................................................................103
Pinus pinaster somatic embryogenesis.......................................................................103
Fresh Weight (FW), Dry Weight (DW), and water content of EMs..........................103
Histology and microscopy..........................................................................................103
ABA and abscisic acid glucose ester (ABA-GE) measurements...............................104
Sample preparation and determination of ABA and ABA-GE..............................104
ABA determination by GC-MS..............................................................................104
ABA-GE determination by LC-MS.......................................................................104
Determination of carbohydrate and total protein content...........................................104
Carbohydrate and starch assay...............................................................................104
Total protein assay.................................................................................................104
Transcriptomic analysis..............................................................................................105
Sequencing.............................................................................................................105
Functional characterization and gene ontology (GO) annotation..........................105
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Functional Classification by KEGG.......................................................................105
2-D gel proteomic analysis.........................................................................................105
2-D PAGE..............................................................................................................105
Gel spot processing................................................................................................105
NanoLC-MS/MS analysis......................................................................................105
Protein identification by database sequence assignment........................................106
Statistical analysis......................................................................................................106
Results............................................................................................................................106
Histological and biological characteristics of maritime pine EMs.............................106
ABA content...............................................................................................................106
Carbohydrate and total protein contents.....................................................................107
Transcriptomic analysis..............................................................................................107
Data annotation by enrichment analysis and functional classification ..................107
Transcript expression levels...................................................................................108
2-D gel proteomic analysis.........................................................................................109
Discussion......................................................................................................................109
Does gellan gum concentration control maturation of somatic embryos?.................111
What happens in EMs when somatic embryo maturation is hindered?.....................112
Which components appear during maturation of somatic embryos?.........................112
Conclusions....................................................................................................................114
Author contributions..................................................................................................114
References......................................................................................................................114
Supporting information..................................................................................................118
CHAPITRE III – Les embryons somatiques cotylédonaires de Pinus pinaster [Ait.] se
développent de façon similaire à des embryons zygotiques cotylédonaires frais :
approches physiologique, biochimique et protéomique....................................................156
III.1 Présentation de la publication..................................................................................156
III.2 Publication................................................................................................................159
Abstract..........................................................................................................................163
Introduction....................................................................................................................163
Material and Methods.....................................................................................................165
Plant material..............................................................................................................165
Cotyledonary somatic embryos (SEs)....................................................................165
Cotyledonary zygotic embryos (ZEs)....................................................................165
Dry weight, water content of SEs and ZEs............................................................166
Determination of carbohydrate and total protein content...........................................166
Carbohydrates.........................................................................................................166
Total protein assay.................................................................................................166
1D gel electrophoresis................................................................................................166
2-D gel proteomic analysis.........................................................................................166
Proteomic study design..........................................................................................166
2-D PAGE..............................................................................................................166
Mass spectrometry and data analysis.....................................................................167
Statistical analysis......................................................................................................167
Results............................................................................................................................168
Dry weight and water content of cotyledonary SEs and maturing cotyledonary ZEs
....................................................................................................................................168
Carbohydrate content in cotyledonary SEs and maturing cotyledonary ZEs............ 168
TTaabbllee ddeess mmaattiièèrreess

Quantitative and qualitative changes in protein contents in cotyledonary SEs and
maturing cotyledonary ZEs........................................................................................168
Cotyledonary SEs vs. maturing cotyledonary ZEs: a synthesis of quantitative
biological and biochemical data.................................................................................169
2-D gel proteomic analysis of cotyledonary SEs and fresh maturing cotyledonary ZEs
....................................................................................................................................169
Identification of candidate protein markers of the fresh, cotyledonary stage of embryo
....................................................................................................................................169
Discussion......................................................................................................................170
Different embryogenic lines produced similar quality standard of cotyledonary SEs.....
....................................................................................................................................170
Quality of cotyledonary SEs did not vary as a function of the duration of maturation
....................................................................................................................................170
Cotyledonary SEs resemble fresh, maturing cotyledonary ZEs.................................171
Proteomics revealed similar protein profiles in somatic vs fresh zygotic embryos...171
Protein markers of the fresh cotyledonary embryos stage during somatic and zygotic
embryogenesis............................................................................................................172
Conclusions....................................................................................................................173
References......................................................................................................................175
Figure legends................................................................................................................179
Supplementary data legends...........................................................................................180
Figures............................................................................................................................181
Supplementary Figures...................................................................................................196
III.3 Résultats complémentaires.......................................................................................210
III.3.1 Evolutions physiologique et biochimique de l’EZ de pin maritime au cours de sa
maturation.......................................................................................................................210
III.3.2 Evolutions physiologique et biochimiques du mégagamétophyte de pin maritime
au cours de la maturation de la graine............................................................................211

III.3.2.1 Mesures physiologiques...............................................................................211
III.3.2.2 Contenu en sucres solubles..........................................................................213
III.3.2.3 Contenu en protéines totales et en protéines de réserve...............................214
CHAPITRE IV – Discussion générale................................................................................216
IV.1 La diminution de la disponibilité en eau n’est pas perçue comme une contrainte par
les ES indifférenciés.......................................................................................................216
IV.2 La diminution de la teneur en eau impacte-elle le métabolisme des sucres ?........217
IV.3 Les processus cellulaires et moléculaires clés impliqués dans le développement
précoce des embryons somatiques.................................................................................219
IV.4 Comparaison du développement de l’EZ et de son mégagamétophyte au cours de la
maturation de la graine de pin maritime.........................................................................238
CHAPITRE V – Conclusions et Perspectives....................................................................240
V.1 Conclusions.............................................................................................................240
V.2 Perspectives.............................................................................................................243
BIBLIOGRAPHIE...............................................................................................................247
ANNEXES.............................................................................................................................269
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1. Somatic embryo maturation in maritime pine (Pinus pinaster): contribution of a 2-DE
proteomic analysis for a better understanding................................................................270

2. De novo assembly of maritime pine transcriptome: implications for forest breeding
and biotechnology..........................................................................................................282

3. L'embryogenèse somatique : une méthode de multiplication végétative du pin
maritime pour demain ?..................................................................................................302

4. Composition des milieux de culture...........................................................................311
AAbbrréévviiaattiioonnss

Abréviations

µM ─ Micromolaire
2,4-D ─ Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (auxine)
2DE ─ Electrophorèse bidimensionnelle
4G ─ 4 g L-1, 4 grammes de gélifiant par litre de milieu de maturation
9G ─ 9 g L-1, 9 grammes de gélifiant par litre de milieu de maturation
ABA ─ Acide abscissique
ABI3 ─ ABA insensitive 3
ACP ─ Analyse en composantes principales
ADH ─ Alcohol dehydrogenase
ADN ─ Acide désoxyribonucléique
ADNc ─ Acide désoxyribonucléique complémentaire
AFLPs ─ Amplified fragment length polymorphism
AFOCEL ─ Laboratoire de Biotechnologie, Association Forêt-Cellulose, ancien FCBA
AGP ─ Arabinogalactan protein
AIB ─ Acide Indole Butyrique
AK ─ Adenosine kinase
AOS ─ Active oxygen species
APRT ─ Adenine phosphoribosyltransferase
APX ─ Ascorbate peroxydase
ARN ─ Acide ribonucléique
ARNi ─ ARN interférent
ARNm ─ ARN messager
BA ─ Benzyl adénine (6-benzylaminopurine)
Chi-1 ─ Chitinase 1
CHIA4 ─ Class IV chitinase
COV ─ Composés d'origine volatile
CPFA ─ Centre de Productivité et d’Action Forestière Aquitaine
CPPU ─ Cytokinine-1-(2-chloro-4-pyridyl)-3-phenylurée
DIGE ─ Differential in gel-electrophoresis
ES ─ Embryon(s) somatique(s)
1
AAbbrréévviiaattiioonnss

EST ─ Expressed Sequence Tag
EZ ─ Embyon(s) zygotique(s)
F-actin capping protein ─ Filament-actin capping protein
FAO ─ Food and Agriculture Organization of the United Nations
FCBA ─ Institut technologique chargé de la Forêt, de la Cellulose, du Bois-construction et
de l'Ameublement.
FPKM ─ Fragments per kilobase per million reads sequenced
fru ─ Fructose
FT ─ FLOWERING LOCUS
FUS3 ─ FUSCA3
GA2OX ─ Gibberelline 2-oxidase
Gb ─ Giga paires de bases, 1.109 paires de bases
GC/MS ─ Gas chromatography/Mass spectrometry
GC/TOF-MS ─ Gas chromatography/Time-of-flight mass spectrometry
GER1 ─ Germin protein 1
GIS ─ Groupement d’Intérêt Scientifique
GLP ─ Germin-like protein
glu ─ Glucose
Glu-1 ─ β-1,3-glucanase 1
GO ─ Gene Ontology
GS1 ─ Glutamine synthetase 1
GTPase ─ Guanosine triphosphate hydrolase
HD-Zip I ─ Homeodomain-leucine zipper I
HR ─ Humidité Relative
HSP ─ Heat Shock Protein, Protéine de réponse au stress thermique
IAA11 ─ Indole-3-acetic acid inducible 11
IEF ─ Isoélectrofocalisation
IFN ─ Inventaire Forestier National
IK ─ Inosine kinase
INRA ─ Institut National de la Recherche Agronomique
IRSTEA ─ Institut de Recherche en Sciences et Technologies pour l'Environnement et
l'Agriculture
kDa ─ Kilodalton
2
AAbbrréévviiaattiioonnss

L1L ─ LEAFY COTYLEDON 1-like
LBD12/ASL5 ─ LOB domain-containing protein 12/ASYMMETRIC LEAVES 2-like protein 5
LC-MS/MS ─ Liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry
LCOs ─ Lipochitooligosaccharides
LEA ─ Late embryogenesis abundant protein
LEC1 ─ LEAFY COTYLEDON 1
LMW HSPs ─ Low molecular weight HSP
LRR ─ Leucine-rich-repeat protein
LTP ─ Lipid transfer protein
m/z ─ Ratio masse/charge
MAAPRAT ─ Ministère de l’Agriculture, de l’Alimentation, de la Pêche, de la Ruralité et de
l’Aménagement du Territoire
MC9 ─ Metacaspase de type 9
mcII-Pa ─ Metacaspase de type 2 de Picea abies
Méga. ─ Mégagamétophyte
MEs ─ Masses embryogènes
MF ─ Masse fraîche
MM ─ Masse Moléculaire
MS ─ Masse sèche
MYB77 ─ Myeloblastosis transcription factor type 77
NARS2 ─ NAC-regulated seed morphology 2
NCBI ─ National Center for Biotechnology Information
NIP ─ Nodulin-like intrinsic protein
NOD factor ─ Nodulation factor
NPA ─ N-1-naphthylphthalamic acid
ONF ─ Office National des Forêts
p34cdc2 ─ Cell division cycle protein 2 homolog
Pa1-18 ─ Gènes de Picea abies
PaHB1 ─ Homeobox1de Pice abies
Pavp 1 ─ Transcription factor viviparous 1 de Picea abies
pb ─ Paire de bases
PCD ─ Programmed cell death (mort cellulaire programmée)
PCR ─ Polymerase chain reaction
3