Physiological and genomic characterization of thermophilic methanotrophic archaea and their ...

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Physiological and genomic characterization of
thermophilic methanotrophic archaea
and their partner-bacteria

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -

dem Fachbereich Biologie/Chemie
der Universität Bremen
vorgelegt von

Viola Krukenberg

Bremen, November 2015
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 2012 bis November 2015 am
Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie angefertigt.

1. Gutachterin: Prof. Dr. Antje Boetius
2. Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Fischer

1. Prüfer: Prof. Dr. Jens Harder
2. Prüfer: Dr. Gunter Wegener

Tag des Promotionskolloquiums: 11.12.2015
Table of contents
Summary .................................................................................................................................... 1
Zusammenfassung ...................................................................................................................... 3
Abbreviations ............................................................................................................................. 5
Chapter I Introduction ........................................................................................................... 7
1.1. Relevance of microbial processes in the global methane budget ................. 8
1.2. Anaerobic mineralization of organic matter ................................................. 9
1.3. Microbial syntrophy ................................................................................... 12
1.4. Anaerobic oxidation of methane ................................................................ 16
1.5. Research outline and objectives ................................................................. 29
1.6. Material and methods ................................................................................. 31
1.7. Overview of enclosed manuscripts ............................................................. 45
Chapter II Intercellular wiring enables electron transfer between methanotrophic archaea
and bacteria ......................................................................................................... 47
Chapter III Candidatus Desulfofervidus auxilii, a hydrogenotrophic sulfate-reducing
bacterium involved in the thermophilic anaerobic oxidation of methane ........... 79
Chapter IV Comparative analysis of the metabolic potential of different subgroups of
anaerobic methanotrophic archaea of clade 1 ................................................... 127
Chapter V Metabolic capabilities of microorganisms involved in and associated with the
anaerobic oxidation of methane ........................................................................ 165
Chapter VI Discussion and perspectives .............................................................................. 207
6.1. Physiology and interspecies interaction in thermophilic AOM................ 208
6.2. Physiology and genomic profile of the bacterial partner HotSeep-1 ....... 210
6.3. Metabolic potential of ANME-1 .............................................................. 211
6.4. Metabolic capabilities of organisms in AOM enrichments ...................... 213
6.5. Perspectives for future research on AOM ................................................ 215
6.6. Concluding remarks .................................................................................. 217
Bibliography ........................................................................................................................... 219
Acknowledgements ................................................................................................................ 233
Appendix ................................................................................................................................ 235

Summary
Methane is a potent greenhouse gas and its atmospheric concentration is strongly influenced
by microbial processes. In anoxic marine environments 80% of the methane is oxidized by
anaerobic microorganisms leading to reduced oceanic methane emissions. This anaerobic
oxidation of methane (AOM) is coupled to sulfate reduction and is mediated by microbial
consortia of anaerobic methane-oxidizing archaea and partner bacteria. The physiology of the
consortia is incompletely understood but is thought to base on a metabolic interdependency of
the partners, a syntrophy. The research presented in this PhD thesis focused on the physiology
and genomic profile of AOM consortia, in particular on the microorganisms that are active at
elevated temperatures (thermophiles). The thermophilic AOM is performed by a unique
consortium of ANME-1 archaea and HotSeep-1 bacteria. In Chapter II we describe
physiological studies and gene expression experiments with thermophilic AOM consortia and
propose a syntrophy of AOM via direct exchange of reducing equivalents. In support of this
hypothesis we visualized cell-to-cell connections in these consortia that we suggest to
function as conductive nanowires in interspecies electron transfer. For the thermophilic
bacterial partner, HotSeep-1 we obtained an ANME-1-free enrichment culture using hydrogen
as alternative energy source, and by physiological and genomic investigation we show in
Chapter III that this bacterial partner grows as chemolithoautotrophic sulfate reducer. Based
on phylogenetic analysis we propose that HotSeep-1 presents a novel species, Candidatus
Desulfofervidus auxilii. ANME-1, the archaeon participating in thermophilic AOM, belongs
to a large group of uncultured organisms, which are known to have reversed the
methanogenesis pathway to metabolize methane. The metabolic diversity among members of
the ANME-1 group is still widely unexplored. In a comparative genome analysis of different
ANME-1 in Chapter IV we show central aspects of their metabolism including a modified
reverse methanogenesis pathway and abundant cytochromes possibly relevant for electron
transfer. Environments of AOM activity and in vitro AOM enrichments are dominated by
AOM consortia, but other microorganisms sustain as low abundant community whose
function is not well understood. In Chapter V we show the cultivation of methanogens and
sulfur-disproportionating bacteria from AOM enrichments. In conclusion the work of this
PhD thesis has advanced our understanding of the functioning of thermophilic AOM, while
further detailed comparative approaches are necessary to comprehend AOM syntrophy in all
its detail and diversity.

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Zusammenfassung
Methan ist ein wichtiges Klimagas, dessen atmosphärische Konzentration stark von
mikrobiellen Prozessen beeinflusst ist. In sauerstofffreien marinen Sedimenten wird 80% des
Methans durch Mikroorganismen verbraucht, was zu verminderter Methanemission der
Ozeane beiträgt. Diese anaerobe Oxidation von Methan (AOM) ist gekoppelt mit
Sulfatreduktion und findet in Konsortien aus anaerob methan-oxidierenden Archaeen
(ANME) und Partnerbakterien statt. Die Physiologie dieser Konsortien ist unvollständig
verstanden, aber basiert vermutlich auf metabolischer Abhängigkeit der Partner, einer
Syntrophie. Diese Doktorarbeit behandelt die Physiologie und die genomischen Eigenschaften
von AOM Konsortien, speziell solcher die bei erhöhter Temperatur leben (thermophile).
Thermophile AOM wird von einem einzigartigen Konsortium aus ANME-1 Archaeen und
HotSeep-1 Bakterien durchgeführt. In Kapitel II beschreiben wir physiologische Studien und
Genexpressions-Experimente und schlagen vor, dass die Syntrophie von ANME-1 und
HotSeep-1 auf dem direkten Austausch von Elektronen beruht. Diese Hypothese
unterstützend weisen wir Zell-zu-Zell Verbindungen nach, die wir als mikrobielle Drähte
(‚nanowires‘) beschreiben und für den Austausch von Elektronen vorschlagen. Den
bakteriellen Partner HotSeep-1 konnten wir ohne ANME, mit Wasserstoff als alternativem
Wachstumssubstrat, anreichern und zeigen in Kapitel III in physiologischen und
genomischen Untersuchung, dass HotSeep-1 chemolithoautotroph als Sulfatreduzierer wächst.
Zusammen mit phylogenetischen Analysen schlagen wir vor, dass HotSeep-1 eine neue Art
darstellt: Candidatus Desulfofervidus auxilii. Das Archaeum, beteiligt an thermophiler AOM,
gehört zu einer großen Gruppe unkultivierter Organismen, von denen bekannt ist, dass sie den
methanogenen Stoffwechselweg umkehren um Methan zu oxidieren. Die metabolische
Diversität innerhalb der ANME-1 Gruppe ist noch weitgehend unerforscht. In Kapitel IV
zeigen wir mithilfe von vergleichender Genomanalyse zentrale metabolische Aspekte von
ANME-1, u.a. eine modifizierte reverse Methanogenese und häufige Cytochrome, welche
vermutlich relevant für den Elektronentransfer sind. Standorte natürlicher AOM Aktivität und
in vitro AOM Anreicherungen sind dominiert von AOM Konsortien, dennoch überleben auch
andere Mikroorganismen langfristig, deren Funktion kaum verstanden ist. In Kapitel V
zeigen wir, dass aus AOM Anreicherungen Methanogene und Schwefeldisproportionierer
kultivert werden können. Zusammenfassend hat diese Doktorarbeit unser Verständnis der
Physiologie der thermophilen AOM vorangebracht, während weitere vergleichende Analysen
nötig sind, um die AOM Syntrophie im Detail und in aller Diversität zu verstehen.
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Abbreviations
AFM Atomic Force Microscopy
ANME ANaerobe MEthane-oxidizing archaea
AOM Anaerobic Oxidation of Methane
AQDS AnthraQuinone-2,6-DiSulfonate
APS Adenosine-5'-PhosphoSulfate
ATP Adenosine TriPhosphate
CARD-FISH CAtalyzed Reporter Deposition Fluorescence In Situ Hybridization
CFE Carbon Fixation Efficiencies
DAPI 4,6-DiAmidino-2-PhenylIndole
COG Cluster of Orthologous Groups
DBB Desulfobulbus
DIC Dissolved Inorganic Carbon
DIET Direct Interspecies Electron Transfer
DNA DeoxyriboNucleic Acid
DSS Desulfococcus/Desulfosarcina
GC Guanine Cytosine
HRP HorseRadish Peroxidase
IPL Intact Polar Lipids
ORF Open Reading Frame
OTU Operational Taxonomic Unit
PCR Polymerase Chain Reaction
POC Particulate Organic Carbon
RNA RiboNucleic Acid
RT Room Temperature
SEM Scanning Electron Microscopy
SMTZ Sulfate Methane Transition Zone
SRB Sulfate-Reducing Bacteria
TAOM Thermophilic Anaerobic Oxidation of Methane
TEM Transmission Electron Microscopy
TLE Total Lipid Extracts
TPM Transcripts Per Million
T4P Type IV Pili
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