PARTE V Ejemplos de aplicaciones de la biotecnología vegetal

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PARTE V
Ejemplos de aplicaciones
de la biotecnología vegetal
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 377
378 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
V. CAPÍTULO 1 secuencias y permiten realizar estudios de
mapeo y de distribución física de secuencias,
analizar relaciones evolutivas entre especies y
Aportes de la citogenética al
estudiar la organización del genoma y la arqui-
estudio de genomas vegetales
tectura nuclear. Los resultados que se obtienen
mediante la aplicación de estas técnicas faci-
Lidia Poggio, González Graciela,
litan estudios de sistemática, filogenia, biodi-
Ferrari María Rosa, García Ana María,
versidad, evolución, mejoramiento y biotecno-
Wulff Arturo, Greizerstein Eduardo,
logía.
Tómas Pablo y Schrauf Gustavo.
Las técnicas de hibridación in situ (ISH) se
refieren al FISH (Fluorescent In Situ Hybridiza-
Dedicado a la memoria del Dr. Carlos Alberto
tion) o GISH (Genomic In Situ Hybridization),
Naranjo.
según que se utilicen como sonda secuencias
particulares o ADN genómico total, respectiva-
1.- Introducción
mente, y serán explicadas en el apartado 5 de
La Citogenética fue definida como la discipli-
éste capítulo.
na que estudia el comportamiento y la estruc-
Resultados obtenidos por nuestro grupo de
tura de los cromosomas y su relación con la
trabajo, que se expondrán en el presente ca-
transmisión y recombinación de los genes. La
pítulo, ejemplifican como la citogenética permi-
citogenética clásica proporciona diferente nivel
te profundizar en el conocimiento del origen y
de análisis que la citogenética molecular, y am-
evolución de cromosomas y genomas comple-
bas contribuyen a los estudios taxonómicos,
tos, localizar genes o regiones cromosómicas
evolutivos y de genómica estructural y funcio-
de interés agronómico y resolver problemas
nal, aplicables en procesos de mejoramiento
sistemático-evolutivos. Estos aportes contribu-
genético convencionales o biotecnológicos.
yen al desarrollo de programas de conserva-
Los principales estudios de la citogenética
ción de recursos genéticos y biodiversidad.
clásica se basan en la determinación de las ca-
racterísticas del cariotipo y la identificación cro-
2.- Análisis del cariotipo
mosómica mediante técnicas de tinción con-
El complemento cromosómico de una espe-
vencionales y bandeo cromosómico. También,
cie, o cariotipo, se refiere a la apariencia feno-
se evalúa el tamaño del genoma y se analiza el
típica de los cromosomas en metafase mitótica
comportamiento meiótico de los cromosomas
tomando en cuenta las siguientes característi-
en razas, especies, híbridos y poliploides.
cas:
Los estudios citogenéticos permiten anali-
• Número básico (x), número gamético (n)
zar la presencia de cromatina introgresante en
y número somático (2n).
cultivos y especies naturales, contribuyendo al
• Tamaño absoluto y relativo de los cromo-
estudio de la transferencia de genes en progra-
mas de mejoramiento. En el área agronómica, somas.
por ejemplo, facilitaron la construcción de va- • Posición de los centrómeros.
liosos stocks de trigo como monosómicos, dite- • Número, tipo y posición de las regiones
losómicos, dobles ditelosómicos, nulisómicos organizadoras del nucleolo.
y líneas con deleciones que fueron útiles para • Cantidad y distribución de heterocromati-
realizar estudios genéticos y mapas físicos. na (detectada por bandeo cromosómico).
En planes de conservación de la biodiversi- • Tamaño del genoma.
dad la citogenética evalúa los daños genéticos • Identificación cromosómica mediante la
que los taxones puedan sufrir por el sistema de localización física de secuencias (FISH).
preservación de las semillas o por el impacto
de la polución ambiental. El número básico (x), es el número menor de
Las técnicas de citogenética molecular (hi- cromosomas necesario para que el organismo
bridación in situ) combinan información citoló- sea viable y representa el mínimo de cromo-
gica clásica con información molecular de las somas de una serie poliploide. El número ga-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 379
mético (n), es el número de cromosomas que como poliploide serían, en muchos casos, la
llevan las gametas y puede coincidir o no con causa del surgimiento de nuevos números bá-
el número básico, de acuerdo con el nivel de sicos. Brassica napus (2n =38) posee un nú-
ploidía de la especie que se trate. El número mero básico derivado (x=19) y se originó por
somático (2n), es el número de cromosomas el cruzamiento entre B. campestris (x=10) y B.
que llevan las células somáticas. oleracea (x=9) y posterior poliploidización.
Las características del cariotipo son general- Es interesante destacar que los rearreglos
mente constantes en un grupo de especies y estructurales mencionados, al modificar la po-
aún de géneros, pero a menudo ocurren varia- sición de los genes, pueden cambiar también la
ciones estructurales y/o numéricas que pueden funcionalidad de éstos aunque no se detecten
cambiar el número, tamaño y posición centro- cambios notorios en la morfología del cariotipo.
mérica de los cromosomas y concomitante- Distintas especies pueden estar aisladas
mente, la simetría del cariotipo. reproductivamente si el híbrido entre ellas po-
Los principales rearreglos cromosómicos see rearreglos en condición heterocigota que
responsables de las diferencias cariotípicas ocasionen disturbios en el apareamiento meió-
entre grupos taxonómicos pueden modificar tico, que determinen esterilidad. Estas espe-
la forma de los cromosomas sin cambiar su cies pueden poseer pocas diferencias a nivel
número como, por ejemplo, translocaciones, bioquímico, molecular o morfológico pero sus
inversiones pericéntricas no simétricas, dupli- diferencias cromosómicas las mantendrían ais-
caciones y deficiencias. También ocurren rea- ladas reproductivamente (especies crípticas).
rreglos que modifican tanto la forma como el Cuando se realizan estudios cromosómi-
número y tamaño de los cromosomas sin alte- cos comparados no hay leyes o principios que
rar la información genética, como las fusiones permitan inferir características ancestrales o
y las fisiones cromosómicas. Estos cambios derivadas del cariotipo, ya que se pueden en-
se denominan disploides, a diferencia de los contrar grandes diferencias cariotípicas entre
aneuploides que producen perdida o ganancia especies relacionadas. Estas variaciones son
de cromosomas enteros. Por ejemplo, en la fa- dinámicas y no están relacionadas con com-
milia Asteraceae el número básico ancestral es plejidad genética u organística.
x = 9, pero hay géneros en la tribu Astereae Un análisis más preciso de la variación cario-
con grupos de especies que tienen x = 8, 6, 5 típica se obtiene empleando técnicas de ban-
y 4, originadas por cambios disploides. Si es- deo cromosómico (C o DAPI, entre otros) que
tos rearreglos, en condición heterocigota, po- revelan secuencias de ADN altamente repeti-
seen menor valor adaptativo que en condición das y regiones organizadoras del nucléolo, las
homocigota, estos últimos se pueden fijar en que pueden utilizarse como marcadores cro-
poblaciones pequeñas con elevada endocría, mosómicos. La heterocromatina constitutiva es
dando lugar a procesos de especiación cromó- un componente aditivo del genoma y presenta,
somica. en muchos grupos, variación intra e interespe-
El número cromosómico también puede va- cífica, la cual puede revelarse por las diversas
riar por poliploidía manteniéndose constante el técnicas de bandeo cromosómico. Aunque las
número básico. El trigo (x=7) ejemplifica una regiones heterocromáticas no contienen genes
serie poliplóide compuesta por especies con activos podrían tener importancia en eventos
2n=14, 28 y 42. regulatorios y en el desarrollo y la disposición
En la familia Fabaceae los procesos de dis- espacial de los cromosomas en el núcleo (Fi-
ploidía creciente y decreciente, tanto a nivel gura 1 A y B).
diploide como poliploide originaron números Las técnicas de bandeo cromosómico ofre-
básicos secundarios y series poliploides modi- cen marcadores que permiten identificar geno-
ficadas. mas y/o cromosomas, sin embargo no es posi-
Las fusiones y fisiones cromosómicas, así ble conocer las secuencias comprendidas en
como hibridación entre taxones con distinto dichos marcadores. Por lo tanto, las bandas C
número cromosómico, tanto a nivel diploide que son similares en tamaño y posición pueden
380 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
diferir en la composición de sus secuencias, y “2C” a la cantidad de ADN genómico que se
las cuales pueden ser discriminadas utilizando encuentra en el núcleo de células somáticas no
técnicas de hibridación in situ (Figura 2 E y F). replicadas.
Dado que la poliploidia es un importante
modo de especiación y muchas plantas con-
sideradas diploides (maíz, Arabidopsis) han
mostrado ser poliploides antiguos, los terminos
“valor C” y tamaño del genoma pueden resul-
tar ambiguos en estos casos. En un diploide
ambos términos serían sinónimos. Sin em-
bargo, en un poliploide el “valor C” represen-
ta el contenido de ADN de todos los genomas
ancestrales que lleva el núcleo gamético. En
estos casos es necesario conocer el conteni-
do de ADN del genoma básico “Cx” ya que la
poliploidía sólo aumenta el “valor C” pero no el
“Cx”. Lo esperado en un poliploide es que el
“valor C” aumente en forma directa con el nivel
de ploidía y que el “Cx” permanezca constan-
te. Sin embargo, en muchos poliploides se ob-
servó que el “Cx” tiende a disminuir a medida
que aumenta el nivel de ploidía. Esto sugiere
que ocurre disminución del tamaño del geno-
ma luego de la formación del poliploide y que
este fenómeno podría estar relacionado con el
proceso de diploidización cromosómica y ge-
Figura 1: A: Bandeo C en Metafase mitótica de
nómica.
Z. m. ssp. mexicana. La flecha indica una banda
Las principales causas de variación (intra o
C. B: Bandeo DAPI en centeno. La flecha muestra
una banda de heterocromatina telomérica. C: Dos interespecífica) del contenido de ADN, descar-
grupos de 5 bivalentes Diacinesis de maíz. B: Cro- tando la variación en el nivel de ploidía, son:
mosoma B. N: nucleolo. D: Configuración meiótica aneuploidía, polimorfismo numérico para cro-
en Diacinesis de maíz x Z. perennis (F1), se obser- mosomas accesorios (cromosomas B), rees-
van 5 I + 5 II + 5 III y agrupación espacial de los tructuraciones cromosómicas con pérdida o
II. I: univalentes, II: bivalentes y III: trivalentes. E:
duplicación de material genético y variación en
Dos grupos asincrónicos de 5 II cada en Anafase
el número de copias de secuencias no codifi-
I de maíz. F: Puentes y fragmentos en Anafase I
cantes.
de tricepiro. Las flechas muestran los fragmentos y
El tamaño del genoma es muy variable en-
las cabezas de flecha indican los puentes. G: Aso-
tre grupos de plantas. En Angiospermas oscila
ciación secundaria de bivalentes en Metafase I de
Senecio madagascariensis. La flecha muestra dos entre 0,05 pg en Cardamine amara y 127,4 pg
II agrupados. H: Desinapsis en Profase I de Z. luxu- en Fritillaria assyriaca, variación que no se en-
rians x Z. m. ssp. mexicana (F1). N: nucleolo. Barra: cuentra necesariamente relacionada con nivel
10 um en Fig. A-F y H. Barra: 3 um en Fig. G. de ploidía. La variación del tamaño del geno-
ma se encuentra, a grandes rasgos, relaciona-
da con diferencias en la complejidad organís-
3.- Contenido de ADN. Variación intra e mica, los virus, por ejemplo, tienen genomas
interespecífica en el tamaño del genoma más pequeños que las bacterias y éstas a su
El contenido de ADN se evalúa en general vez menores que los eucariotas. Sin embargo,
por microdensitometría con tinción de Feulgen en organismos superiores se encontró que el
o por citometría de flujo. Se denomina “valor- aumento en el valor C no es explicable por la
C” al contenido de ADN del gameto haploide existencia de mayor número de genes funcio-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 381
Figura 2: A: GISH hibridando ADN genómico de centeno sobre Metafase mitótica de tricepiro. La sonda de
centeno marcada con digoxigenina y revelada con antidigoxigenina-FITC hibridó sobre 14 cromosomas de
tricepiro (verde brillante). B: FISH hibridando la secuencia ribosomal 45s (pTa71) sobre Metafase mitótica
de tricepiro. La pTa71 marcada con biotina y revelada con Cy3 hibridó sobre 5 cromosomas de tricepiro
(señales naranja). El resto de los cromosomas fueron contrateñidos con ioduro de propidio (rojo). La flecha
señala una de las regiones ribosomales hibridadas con pTa71. C: GISH hibridando ADN genómico de Bro-
mus setifolius sobre Metafase mitótica de B. pictus (2n=70). La sonda genómica de B. setifolius, marcada
con biotina y revelada con Cy3, hibridó sobre los 28 cromosomas más largos de B. pictus (rojo), mientras
que los cromosomas restantes (azul) no hibridaron, a excepción de mínimas translocaciones. D: FISH hi-
bridando la secuencia repetitiva pSc119.2, marcada con biotina y revelada con Cy3, sobre Metafase mitóti-
ca de Elymus scabrifolious. Se observa un patrón de bandeo FISH. La flecha indica una de las señales de
hibridación. E: Bandeo DAPI que denota las regiones de heterocromáticas denominadas “knobs” (DAPI+)
en cromosomas mitóticos de Z. m. ssp. parviglumis. F: FISH hibridando la secuencia repetitiva de 180pb-
knob sobre la misma célula de Z. m. ssp. parviglumis de la figura E. La sonda fue marcada con digoxigeni-
na y revelada con antidigoxigenina-FITC (señales verde brillante). Las señales de hibridación muestran a
aquellos “knobs” constituidos por la secuencia de 180pb. En E y F, las flechas indican los “knobs” (DAPI+)
que no fueron hibridados con la secuencia 180pb-knob. G: Diacinesis del híbrido F1 maíz x Z. perennis
(2n=30). Con tinción DAPI se observa su configuración meiótica: 5 I + 5II + 5 III. El FISH hibridando la
célula con la secuencia ribosomal 45s (pTa71), marcada con biotina y revelada con Cy3, muestra tres se-
ñales de hibridación (rojo) sobre un III (flecha). H: Detalle de I, II y III en Diacinesis del híbrido F1 maíz x Z.
perennis (2n=30). H-I: GISH utilizando como sonda ADN genómico de maíz marcado con digoxigenina y
revelado con antidigoxigenina-FITC. En H se observan un I con señal de hibridación (verde brillante) y un II
sin señal de hibridación. En I la flecha muestra a un III con sólo un cromosoma hibridado (verde brillante).
J y M: FISH utilizando la secuencia ribosomal 45s (pTa71), marcada con biotina y revelada con
Cy3. En J se observan una señal de hibridación (rojo) sobre un I y dos señales sobre un II. En M
se revelan tres señales de hibridación sobre un III. J-L: Contratinción DAPI. Barra: 10 um.
382 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
nales, ya que el contenido de ADN de un alga existen mecanismos moleculares que generan
unicelular puede ser igual al de una angiosper- ADN repetido no codificante que actúa como
ma leñosa. Esta “paradoja del valor-C” fue re- mutágeno y/o agente regulador.
suelta cuando estudios moleculares mostraron La variación intraespecífica en el conteni-
que gran parte del genoma consiste en ADN re- do de ADN es aún un tópico discutido aunque
petido que tiene el potencial de cambiar rápida- existen casos, como el del género Zea, donde
mente en número de copias y alterar el tamaño ha sido demostrada inequivocamente. En maíz
del genoma en respuesta a eventos bióticos (Zea mays ssp. mays) las diferencias en el ta-
y abióticos. Actualmente, está demostrado que maño del genoma radican, principalmente, en
cambios en el tamaño del genoma involucran el número de cromosomas accesorios (cromo-
pérdida o ganancia de secuencias repetidas somas B) y en el contenido de heterocromatina
(elementos transponibles, retroelementos, mi- de los cromosomas del complemento regular,
crosatélites, macrosatélites, etc). Estas se lo- que está representada en gran parte por blo-
calizan en regiones intergénicas y pueden es- ques heterocromáticos denominados “knobs”.
tar dispersas en el genoma o en arreglos en Estudios citogenéticos clásicos realizados, por
tandem. Aunque los elementos transponibles nuestro grupo de investigación en razas nati-
son transcripcionalmente inactivos pueden ac- vas del Noroeste argentino (NOA), revelaron
tivarse en condiciones de variación o estrés la existencia de una correlación positiva entre
ambiental. El estrés genómico producido por cromosomas B y altitud de cultivo, sugiriendo
la hibridación interespecífica y la poliploidiza- un significado adaptativo para estos cromoso-
ción, en la naturaleza o como consecuencia de mas accesorios. Además, el análisis de la va-
prácticas de mejoramiento, puede, en algunos riabilidad microsatélite en estas razas de maíz
casos, producir la amplificación de elementos confirmó la participación de fuerzas selectivas
transponibles. en el mantenimiento de la correlación descripta.
En general, la relación “ADN génico, no gé- La presencia de cromosomas accesorios,
nico” disminuye con el aumento del tamaño del que son heterocromáticos, no codificantes y
genoma y en algunas Angiospermas con eleva- sin funciones vitales para el organismo, son
do contenido de ADN las secuencias repetidas frecuentes en razas nativas de plantas cul-
pueden representar hasta el 90% del ADN total. tivadas tales como maíz y centeno. El modo
Esta relación plantea interrogantes acerca del particular de herencia de estos cromosomas,
origen y función del ADN repetido no codifican- con mecanismos de impulso que hacen que se
te. Se han analizado las relaciones que existen hereden con mayor frecuencia que la esperada
entre el contenido de ADN y algunas caracte- por herencia mendeliana, abre un nuevo cam-
rísticas celulares y organísmicas, denominán- po de investigación en lo que se refiere a su
dose parámetros nucleotípicos a aquellos as- utilización como portadores de genes útiles en
pectos del ADN nuclear que afectan al fenotipo programas de mejora.
independientemente del ADN codificante. En Es interesante señalar que no hay relación
varios grupos de plantas se ha observado que entre especiación y contenido de ADN. Por
las variaciones en el contenido de ADN nuclear ese motivo se postuló que la especiación de-
están correlacionadas positivamente con: vo- pendía fundamentalmente de cambios en los
lumen y/o longitud cromosómica, área y/o vo- genes codificantes. Sin embargo la genómica
lumen celular, porcentaje de heterocromatina, comparativa ha revelado constancia en es-
longitud del complejo sinaptonémico, duración tos genes informacionales. En las gramíneas,
del ciclo mitótico y meiótico, latitud y altitud de por ejemplo, el contenido de genes y el orden
crecimiento. Se han encontrado datos que per- de los mismos están altamente conservados,
miten suponer que diferencias en el tamaño del mientras que la cantidad de ADN repetido ha
genoma poseen significado adaptativo en la cambiado considerablemente. Estos hallazgos
evolución, diversificación y adaptación a distin- llevan a investigar el rol de las secuencias de
tos ambientes. Algunos autores postulan que ADN repetido en los procesos de especiación.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 383
4.- Análisis meiótico en híbridos y etc.; los cuales se observarían también en el
poliploides poliploide derivado. En estos casos la meiosis
Una especie diploide con reproducción irregular y la esterilidad no estarían reflejando
sexual es fértil si posee un comportamiento necesariamente falta de homología entre ge-
meiótico normal, o sea buen apareamiento nomas parentales. Por lo antes mencionado se
entre cromosomas homólogos, el cual se ve deduce que el grado de irregularidades meióti-
reflejado en la formación de bivalentes (II) en cas observadas en el híbrido sería una estima-
meiosis (Profase I). Ello determina que exista ción de diferencias génicas y/o estructurales
buena segregación y formación de gametos que poseen las entidades progenitoras.
balanceados y fértiles. El grado de aparea- Un fenómeno frecuente en híbridos diploi-
miento meiótico es una medida de la homo- des entre distintas especies es que, aunque
logía que existe entre los cromosomas. Por presenten formación regular de bivalentes y
lo cual la homología genómica entre dos en- desarrollo normal de los estados II de la meio-
tidades puede evaluarse estudiando el com- sis, posean elevada esterilidad. Podemos en-
portamiento meiótico de sus híbridos F1. Si el contrar ejemplos de este fenómeno en híbri-
híbrido analizado posee formación de II y es dos entre distintas especies de los géneros
fértil se puede concluir que hay afinidad (homo- Amaranthus, Prosopis, Hypochaeris y Bromus,
logía) entre sus genomas parentales. Sin em- entre otros. Stebbins (1971) ha denominado a
bargo, podría ocurrir que aunque las especies este fenómeno "hibridez estructural críptica"
parentales tuvieran una elevada homología en que puede ocurrir cuando las especies proge-
cuanto a las secuencias de ADN, los híbridos nitoras se diferencian en pequeños rearreglos
fueran estériles, con formación de univalentes estructurales. En estos casos si bien se forman
(I) en su meiosis. Esta esterilidad podría de- bivalentes, se segregan combinaciones géni-
berse a la acción de genes que interfieren con cas inviables a los gametos. Esto indica que
el proceso normal de aparea miento (formación la formación de bivalentes no se debe nece-
del complejo sinaptonémico, ocurrencia y/o sariamente a que los genomas parentales que
posición de sobrecruzamientos) o que alteran conforman un híbrido interespecífico sean ho-
la disposición espacial de los genomas en el mólogos.
núcleo provocando, de esta manera, asinap sis El estudio meiótico de híbridos entre taxo-
o desinapsis (Figura 1F). La esterilidad podría nes con distinto nivel de ploidía aporta mayor
deberse también al comportamiento meiótico información que el realiza do en híbridos diploi-
irregular causado por diferencias en rearreglos des. En la naturaleza podemos encontrar auto
estructurales entre las especies progenitoras y alopoliploides. En los autopoliploides recien-
de un híbrido. Por lo tanto, si el híbrido entre tes se espera una elevada frecuencia de mul-
dos taxones es estéril habrá que anali zar si el tivalentes mientras que en los alopoliploides
aislamiento reproductivo postcigótico obedece ésta depende de si se trata de alopoliploides
a causas génicas o cromosómicas. Si las cau- típicos (formados por hibridación entre espe-
sas fueran cromosómicas se observaría forma- cies con genomas muy diferentes y posterior
ción de I y el poliploide derivado tendría meiosis autoduplicación) o alopoliploides segmentarios
regular con formación de II. Configuraciones (originados por hibridación entre especies muy
meióticas anormales como I, II heteromórficos afines y posterior autoduplicación). Las confi-
o multivalentes en Profase-Metafase I (Figuras guraciones meióticas (frecuencia de I, II y mul-
1D y 2G) y, en estadios posteriores (puentes, tivalentes) permite estudiar la relación entre los
fragmentos, cromosomas con cromátidas des- genomas parentales de un alopoliplóide. Sin
iguales, micronúcleos, etc.), pueden deberse a embargo, el apareamiento cromosómico en
heterocigosis para distintos tipos de rearreglos poliploides puede estar afectado por factores
estructurales (Figura 2F). Si la esterilidad fuese que aumentan o disminuyan la frecuencia de
de origen génico podrían observarse disturbios multivalentes, independientemente de la afini-
meióticos de distinto tipo como asinapsis, desi- dad de los genomas, como por ejemplo, genes
napsis, alteración en la formación del huso, similares al gen Ph de trigo, que inhiben el apa-
384 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
reamiento homeólogo, o genes que afectan la poli plóide de Zea (Figura 1E). En Zea y otros
sinapsis y la frecuencia y/o localización de so- poliploides como Senecio se observó asocia-
brecruzamientos. ción secundaria de II, sugiriendo la existencia
En el género Zea el análisis de las asocia- de homeología entre los genomas ancestrales.
ciones meióticas en especies e híbridos ha En el presente apartado se ha ejemplificado
revelado la naturaleza alotetraploide del maíz cómo el análisis meiótico permite dilucidar el ori-
(2n=20) y de sus especies silvestres relacio- gen y postular los modos de especiación de al-
nadas (teosintes), con un número básico x=5. gunas especies. Además de la utilidad en estu-
Las especies con 2n=20 presentan 10 II en dios taxonómicos y evolutivos, el conocimiento
Profase-Metafase I, mientras que Zea peren- de la meiosis es de importancia fundamental en
nis (2n=40) muestra, con frecuencia elevada, estu dios aplicados, ya que en la producción de
5 IV + 10 II. En híbridos con 2n=30 cromoso- híbridos o poliploides de importancia agronómi-
mas (Z. diploperennis (2n=20) x Z. perennis, ca se debe lograr un máximo de fertilidad y esto
Z. luxurians (2n=20) x Z. perennis (2n=40) y está relacionado con el comportamiento cromo-
Z. mays ssp mays x Z. perennis), realizados sómico durante la formación de sus gametos.
artificialmente por nuestro grupo de investi-
gación, la configuración meiótica observada 5.- Citogenética molecular
mas frecuentemente fue 5 III + 5 II + 5I. Estas La Citogenética Molecular (ISH: Hibridación
configuraciones meióticas indicaron la presen- In Situ) combina información acerca de la mor-
cia de dos genomas ancestrales (A y B), de 5 fología nuclear o cromosómica con la informa-
cromosomas cada uno, y permitieron postular ción molecular de las secuencias, y permite
las fórmulas genó micas para los taxones de realizar estudios de mapeo y de distribución
Zea con 2n=20 (AxAx BxBx), para Zea peren- física de las mismas, analizar relaciones evo-
nis (ApApAp’Ap’ Bp1Bp1 Bp2Bp2) y para los lutivas entre especies y estudiar la organiza-
híbridos 2n=30 (ApA´pAx BpB´p Bx). Nuestro ción del genoma y la arquitectura nuclear. Por
grupo de investigación ha encontrado además, lo tanto la citogenética molecular aporta impor-
en teosintes, razas nativas de maíz e híbridos tantes resultados a los estudios de sistemáti-
con 2n=20, formación frecuente de dos grupos ca, filogenia, biodiversidad, evolución, mejora-
de 5 II cada uno, muchas veces asociados a miento y biotecnología.
husos acromáticos distintos. Este doble huso Las técnicas de ISH consisten en hibridar
sería una evidencia de la existencia de geno- cromosomas con secuencias de ADN marca-
mas ancestrales con 10 cromosomas cada das con fluorocromos. Estas técnicas, aplica-
uno. Este fenómeno está asociado a una leve das desde 1969, utilizaban métodos de mar-
asincronía de los dos grupos de 5 II durante cación y detección radioactivos. En plantas,
el desarrollo meiótico (Figura 1E). Este fenó- se comenzaron a aplicar a fines de la década
meno ha sido observado con alta frecuencia del 80 debido a la gran disponibilidad de se-
en líneas aloplásmicas obtenidas por nuestro cuencias clonadas para ser utilizadas como
grupo de trabajo cruzan do maíz como proge- sonda, y a los nuevos sistemas no radioacti-
nitor masculino y teosinte (Z. mays ssp. mexi- vos de marcación y detección. Esta metodo-
cana) como progenitor femenino. Estas líneas logía es útil en estudios de la estructura, fun-
aloplásmicas presentaron comportamiento ción, organización y evolución de los genomas
meiótico regular con formación de 10 II que se y permite conocer su composición, a nivel de
distribuyeron en dos grupos de cinco II cada secuencias. Para realizar esta técnica se pue-
uno. Esto sugiere que la interacción "citoplas- den utilizar una gran variedad de sondas: des-
ma de teosinte-núcleo de maíz" influencia la de ADN genómico total (GISH: Hibridación In
distribución espacial de los cromosomas en el Situ Genómica), hasta secuencias específicas
núcleo promoviendo la separación de los dos FISH (Hibridación In Situ Fluorescente), tales
genomas ancestrales de 10 cromosomas cada como sondas de cromosomas individuales o
uno. La presencia de dos grupos asincrónicos fragmentos cromosómicos (obtenidas por mi-
de 5 II cada uno permitió inferir la naturaleza crodisección), secuencias de ADN repetido en
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 385
tandem, retrotransposones, secuencias de ge- y posición de copias insertas y su correlación
nes únicos o de bajo número de copias. con la expresión y la regulación.
Una de las aplicaciones del FISH es la ob- Para los casos en que las secuencias a de-
tención de mapas físicos, funcionales y estruc- tectar son muy cortas (menores a 300pb) se
turales de los genomas, mediante la localiza- han desarrollado distintas modificaciones de
ción cromosómica de secuencias de distinto la técnica de FISH que consisten en sistemas
origen. El análisis de la localización de secuen- de amplificación de las señales de hibridación,
cias diversas permite identificar cromosomas, FIISSHH ssoobbrree fifi bbrraass ddee AADDNN,, FFIISSHH ssoobbrree ccrroommoo--
analizar la arquitectura nuclear del genoma y somas paquiténicos o descondensados. Ade-
verificar hipótesis acerca de la relación entre más, se han utilizado variantes como PRINS
posición y función de determinadas secuen- (Primed In Situ Hybridization) y C-PRINS (Cy-
cias. Aplicando esta metodología se pueden cling PRINS), entre otras. La técnica de PRINS
obtener cariotipos FISH para determinadas se basa en el apareamiento de oligonucleótidos
especies y detectar los rearreglos intergenómi- iniciadores a secuencias complementarias en
cos que ocurrieron en su evolución. Por otra cromosomas desnaturalizados in situ, segui-
parte, los experimentos de FISH permiten de- do de la elongación debida a la incorporación,
terminar la distribución y posición de material mediante una ADN polimerasa, de nucleótidos
cromosómico extraespecífico, la existencia de marcados. En el C-PRINS intervienen una se-
apareamiento y recombinación intergenómico, rie de ciclos termales análogos a la reacción en
y la segregación preferencial de determinados cadena de la polimerasa.
cromosomas o segmentos cromosómicos. En estudios realizados en nuestro labora-
Por su parte, el GISH, en el que se utiliza torio, la hibridación in situ permitió revelar la
ADN genómico total como sonda, revela homo- composición genómica del trihíbrido tricepiro,
logías específicas del ADN, principalmente en que es un cereal sintético de origen trigenérico:
lo que respecta a secuencias repetidas. Esta trigo, centeno y agropiro, y cuya composición
técnica facilita, por ejemplo, el reconocimiento genómica y cromosómica, luego de varios años
de especies parentales y el análisis de la or- de selección, era desconocida. El tricepiro se
ganización nuclear en híbridos y poliploides, y originó por el cruzamiento de triticale (2n=42) x
la determinación de la naturaleza de su apa- trigopiro (2n=56) cuya F1 poseía 2n=49; luego
reamiento meiótico (auto o alosindético). Ade- de varias generaciones de selección este hí-
más permite detectar cromosomas o segmen- brido se estabilizó en 2n=42. Los estudios de
tos cromosómicos introgresantes en híbridos y GISH realizados sobre los cromosomas de tri-
generaciones segregantes, lo cual es de gran cepiro Don René INTA empleando sondas de
utilidad en planes de mejoramiento, pues es ADN genómico de centeno (Figura 2A) y de
posible realizar el seguimiento de los segmen- Thinopyrum mostraron 14 cromosomas perte-
tos o cromosomas introgresados a lo largo de necientes al genoma R de centeno y pequeñas
generaciones segregantes, retrocruzadas y en zonas de introgresión de Thynopyrum. Con la
líneas recombinantes. Por otra parte, es útil en finalidad de identificar la totalidad de los cro-
el análisis de afinidades genómicas interespe- mosomas del tricepiro se emplearon las son-
cíficas, en estudios evolutivos y taxonómicos. das pSc119.2 (aislada de centeno y que hibri-
Es importante señalar que las relaciones ob- da con patrones característicos sobre todos los
tenidas mediante GISH no son afectadas por cromosomas de los genomas R y B de trigo y
genes que producen disturbios en el aparea- sobre algunos cromosomas de los genomas A
miento meiótico (asinapsis, desinapsis, apa- y D de trigo), pAs1 (aislada de Aegilops squa-
reamiento homeólogo o heterólogo), siendo de rrosa y que hibrida sobre los cromosomas del
gran utilidad para analizar homologías de híbri- genoma D de trigo), y pTa71 (aislada de trigo
dos o poliploides que presentan esterilidad gé- y que revela zonas organizadoras del nucléo-
nica. Además, el FISH y el GISH proporcionan lo porque contiene genes ribosomales). Estos
información acerca de la localización cromosó- experimentos mostraron la presencia de 6 zo-
mica y genómica de loci transgénicos, número nas de ADN ribosomal, 2 en cromosomas de
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