Papel de la horquilla amino-terminal como elemento clave en la funcionalidad de las ribotoxinas ...

174 Pages·2004·7.73 MB·Spanish

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I

PAPEL DE LA HORQUILLA AMINO-TERMINAL COMO
ELEMENTO CLAVE EN LA FUNCIONALIDAD DE LAS
RIBOTOXINAS DE ASPERGILLUS

MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE
DOCTOR POR
Lucía García Ortega

Bajo la dirección de los Doctores:

Álvaro Martínez del Pozo
José G. Gavilanes Franco

Madrid, 2004

ISBN: 84-669-2662-3
Universidad Complutense de Madrid
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular I

PPaappeell ddee llaa hhoorrqquuiillllaa aammiinnoo--tteerrmmiinnaall ccoommoo
eelleemmeennttoo ccllaavvee eenn llaa ffuunncciioonnaalliiddaadd ddee llaass
rriibboottooxxiinnaass ddee AAssppeerrggiilllluuss

Lucía García Ortega
Tesis Doctoral
Madrid, 2004

Universidad Complutense de Madrid
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular I

PPaappeell ddee llaa hhoorrqquuiillllaa aammiinnoo--tteerrmmiinnaall ccoommoo
eelleemmeennttoo ccllaavvee eenn llaa ffuunncciioonnaalliiddaadd ddee llaass
rriibboottooxxiinnaass ddee AAssppeerrggiilllluuss

Lucía García Ortega
Tesis Doctoral
Madrid, 2004

Índice

Abreviaturas, siglas y símbolos ………………………………..……………….. I

Introducción ……………………………………………………………..…………… 1
La superfamilia de la barnasa ……………………..…………………………........ 4
La familia de la RNasa T1 …………………………………………….…………... 7
Características estructurales …………………………………………………. 8
Mecanismo catalítico …………………………………………………………. 8
Función biológica ……………………………………………………………… 10
La ribonucleasa U2 …………………………………………………………………. 11
Características estructurales ………………………………………………… 11
Mecanismo catalítico …………………………………………………………. 12
Función biológica ……………………………………………………………... 13
Expresión heteróloga …..…………………………………………………….. 13
Las ribotoxinas ………………………………………………………….……… 14
Las ribotoxinas como RIP …………………………………………………….. 15
Características generales …………………………………………………….. 19
Características estructurales ………………………………………………… 21
Mecanismo catalítico …………………………………………………………. 22
El ribosoma como sustrato de las ribotoxinas ………………………………... 23
Interacción con membranas ………………………………………………… 27
Citotoxicidad …………………………………………………………………. 28
Función biológica ……………………………………………………………… 29
α-Sarcina ……………………………………………………………………… 29
Restrictocina …………………………………………………………………. 31
Asp f 1 ………………………………………………………………………….. 32
Inmunoterapia con ribotoxinas ………………………………………………… 36

Objetivos ………………………………………………………………………………. 37

Resultados 1 ………………………………………………..………………………… 41
The solubility of the ribotoxin α-sarcin, produced as a recombinant
protein in Escherichia coli, is increased in the presence of thioredoxin.
García-Ortega et al, 2000 ……………….…………………………………….. 45
Ribonuclease U2: cloning, production in Pichia pastoris and affinity
chromatography purification of the active recombinant protein.
Martínez-Ruiz et al, 2000 ……………………………………………………... 51
RNase U2 and α-sarcin: a study of relationships.
Martínez-Ruiz et al, 2001 …………………………………………………….. 57
Optimización de la producción heteróloga de la ribonucleasa U2 en
Pichia pastoris. …………………………………………………………………. 75
Resultados 2 …………………………………………………………………...……... 81
Involvement of the amino-terminal β-hairpin of the Aspergillus ribotoxins
on the interaction with membranes and nonspecific ribonuclease activity.
García-Ortega et al, 2001 …………………………………………………….. 85
Deletion of the NH -terminal β-hairpin of the ribotoxin α-sarcin
2
produces a nontoxic but active ribonuclease.
García-Ortega et al, 2002 …………………………………………………….. 97

Resultados 3 …………………………………………………………………………... 105
Production and characterization of a non-cytotoxic deletion variant of the
Aspergillus fumigatus allergen Asp f 1 with reduced IgE-binding ability.
García-Ortega et al, 2004 …………………………………………………….. 109

Discusión …………………………………………………………………………….... 119
Producción heteróloga de formas recombinantes de α-sarcina y RNasa U2 .. 121
La horquilla amino-terminal de las ribotoxinas ……………………………………. 122
La interacción con el ribosoma …………………………………………………….. 128
Las ribotoxinas como alergenos ………………………………………………… 136
Consideraciones finales …………………………………………………………. 141

Conclusiones ………………………………………………………………………….. 143

Bibliografía ……………………………………………………………..…………… 147
I

Abreviaturas, siglas y símbolos

A, C, G, U : adenina, citidina, guanina, uracilo
aa : aminoácido
ABPA : aspergilosis broncopulmonar alérgica
ADP : 5’-difosfato de adenosina
APC : célula presentadora de antígeno
ApA (C, G, U) : adenilil (3’→5’) adenosina (citosina, guanosina, uracilo)
β-MetOH : 2’-mercaptoetanol
cAMP : 2’,3’-monofosfato cíclico de adenosina
CF : fibrosis cística
CIB : Centro de Investigaciones Biológicas
CNB : Centro Nacional de Biotecnología
CSIC : Centro Superior de Investigaciones Científicas
Ct/Nt : extremo carboxilo terminal/amino terminal de una secuencia peptídica
DEAE : dietilaminoetilo
DTT : ditiotreitol
EF-G (eEF-2) : factor de elongación G (factor de elongación homólogo en eucariotas)
EF-Tu (eEF-1) : factor de elongación Tu (factor de elongación homólogo en eucariotas)
ELISA : enzimoinmunoanálisis
GpA (C, G, U) : guanilil (3’→5’) adenosina (citosina, guanosina, uracilo)
GTP : 5’-trifosfato de guanosina
GTPasa : enzima que cataliza la hidrólisis de GTP en GDP +P
i
ID : concentración de agente tóxico necesaria para producir el 50% de la muerte celular
50
IF-2 : factor de iniciación 2
IgE, IgG : inmunoglobulina tipo E, tipo G
k : constante catalítica
cat
(K)Da : (Kilo)Dalton
K : constante de Michaelis
M
LDL : liposoma de baja densidad
(m)(r)(t)RNA : RNA (mensajero) (ribosomal) (de transferencia)
PDB : base de datos Protein Data Bank
pI : punto isoeléctrico
poli(A)/(G)/(I)/(U) : ácido poliadenílico/poliguanílico/poliinosínico/poliuracílico
PS : fosfatidilserina
Pu, Py : base púrica, pirimidínica
RI : inhibidor de ribonucleasas
RIP : proteína(s) inactivante(s) de ribosomas
RMN resonancia magnética nuclear
RNasa(s) : ribonucleasa(s)
scFv : cadena sencilla de la fracción variable de un anticuerpo
SDS-PAGE : gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico
siRNA : RNA pequeño de interferencia
SRL : lazo sarcina/ricina
Th1(Th2) . célula T ayudante de clase 1(2)
UCM : Universidad Complutense de Madrid
UV : ultravioleta

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