papel de adenosina en la resistencia múltiple a drogas en células iniciadoras de gliomas de alto ...

98 Pages·2014·1.11 MB·Spanish

by  Ana Maria Zarraga

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Profesor Patrocinante
Dra. Claudia A. Quezada M.
Instituto de Bioquímica y Microbiología
Facultad de Ciencias

PAPEL DE ADENOSINA EN LA RESISTENCIA MÚLTIPLE A
DROGAS EN CÉLULAS INICIADORAS DE GLIOMAS DE
ALTO GRADO

Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al Título
Profesional de Bioquímico

ALESSANDRA ISABELLA DELLAROSSA MACHUCA

VALDIVIA – CHILE
2014
i

A mis papis, gracias Flaquito!
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AGRADECIMIENTOS
Esta tesis de pregrado, ha sido financiada bajo el proyecto FONDECYT 1121121 de mi tutora y
patrocinadora Dra. Claudia A. Quezada M., a quien debo agradecer la paciencia y gestión de estar
tantos años trabajando bajo su experiencia, desde que era una pequeña alumna de taller en
pregrado siendo parte de su equipo de trabajo, en una investigación de punta y premiada
nacionalmente. Junto a ella, debo incluir al Dr. San Martín quien también ha sido parte de todo
esto. No puedo dejar afuera a todo el clan “RCQ”, el apoyo tanto científico, moral, amistoso y
profesional recibido en estos años de laboratorio no se olvidarán, gracias por su tan grata
compañía; debo hacer una mención especial para Yessica, Ricardo, Dellis, Wallys, Karin,
Cristopher y el profe Carlitos Oyarzún.
Gracias a mi familia, que me brindó el apoyo en esta carrera “tan rara” desde el primer día que
entré a la Universidad, su paciencia y energías para seguir luchando y seguir adelante: Hemela,
Tonejo, Guatón, Rulín y Goddito, muchas muchas gracias, que sin su esfuerzo simplemente no
estaría donde estoy hoy, bajo el manto de nuestro Flaquito.
Mis bichas, mis ángeles, Dany Valy, Tia Rosita y Felipe Vives, gracias. Mis M.F.E gracias por
este último caminar.
Y dejo para el final a mi marido, quien me acompaña en mi vida, feliz de haber alcanzado a
compartir este momento tan importante siendo tu mujer, Maximiliano.

A cada uno de Uds. muchas gracias.
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INDICE GENERAL

1. RESUMEN .................................................................................................................................. 1
1.1 Summary .................................................................................................................................. 2
2. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 3
2.1 Marco teórico y formulación de hipótesis. .............................................................................. 3
2.1.1 Gliomas y Glioblastoma Multiforme Humano. ................................................................... 3
2.1.2 Múltiple resistencia a drogas ............................................................................................... 5
2.1.3 Stem Like Cells en Glioblastoma………………………….……………………………....8
2.1.4 Adenosina y Cáncer………………………………………………………………….......11
2.2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................................................................................. 16
2.2.1 Hipótesis ............................................................................................................................ 16
2.2.2 Objetivo general ................................................................................................................ 16
2.2.3 Objetivos específicos ......................................................................................................... 16
3. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………..17
3.1 Materiales .............................................................................................................................. 17
3.1.1 Líneas celulares ................................................................................................................. 17
3.1.2 Reactivos ........................................................................................................................... 17
3.1.3 Equipos ……………………………………………………………………………..........19
3.2 Métodos ................................................................................................................................. 20
3.2.1 Cultivo celular ................................................................................................................... 20
3.2.2 Producción de células iniciadoras de tumor (stem like cell) .............................................. 20
3.2.3 RT-PCR ............................................................................................................................. 21
iv

3.2.4 PCR .................................................................................................................................... 22
3.2.5 Electroforesis en gel de agarosa ........................................................................................ 24
3.2.6 Western blot ....................................................................................................................... 24
3.2.6.1 Extracción de proteínas ................................................................................................. 24
3.2.6.2 Cuantificación de proteínas ........................................................................................... 25
3.2.6.3 Electroforesis de las proteínas en gel de poliacrilamida................................................ 25
3.2.6.4 Transferencia ................................................................................................................. 26
3.2.6.5 Inmunodetección ........................................................................................................... 27
3.2.7 Actividad de transporte MRP1 .......................................................................................... 27
3.2.8 Actividad CD73 ................................................................................................................. 28
3.2.9 Ensayo MTT de viabilidad…………………………………………………………….…29
3.2.10 Ensayo viabilidad por kit……………………………………………………………….29
3.2.11 Inmunofluorescencia……………………………………………………………………29
3.2.12 Fijación y marcaje de células para citometría de flujo …………………….…………..30
3.2.13 Análisis estadístico .......................................................................................................... 31
4. RESULTADOS ......................................................................................................................... 32
4.1 Montaje de cultivo de células iniciadoras de glioma de alto grado a partir de células de glioma
de rata C6. ...................................................................................................................................... 32
4.1.1 Medio de cultivo y suplementos para cultivo de células iniciadoras de glioma de alto grado
a partir de C6……………………………………………………………………………………..32
4.1.2 Cinética de cultivo en células iniciadoras de glioma de alto grado, a partir de células de
glioma de rata C6…………………………………………………………………………………34
v

4.1.3 Marcadores para células tipo Stem en células iniciadoras de glioma de alto grado a partir de
cultivo de células de glioma de rata C6.
……………………………………………………………………………………………………38
4.2 Montaje de cultivo de células iniciadoras de Glioblastoma de alto grado a partir de células de
Glioblastoma multiforme U87. ...................................................................................................... 41
4.2.1 Medio de cultivo y suplementos para cultivo de células iniciadoras de glioblastoma de alto
grado a partir de U87……………………………………………………………………………..41
4.2.2 Marcadores Stem Cell en cultivo de NE a partir de la línea celular U87…………………..44
4.3 Expresión de MRP1, CD73 y RAA en células iniciadoras de tumor a partir de C6 y U87…44
3
4.4 Bloqueo de CD73 y RAA y su impacto en la expresión y actividad de MRP1……..……....52
3
4.4.1 Actividad de la enzima 5´ectonucleotidasa en cultivos celulares diferenciados y NE a partir
de C6 y U87, bajo el efecto de su inhibidor AOPCP. ................................................................... 52
4.4.2 Expresión de MRP1 frente a AOPCP y MRS1220……………………………..………….55
4.4.3 Actividad de MRP1 bajo el efecto del inhibidor de CD73 (AOPCP) y el antagonista de
RAA (MRS1220). ........................................................................................................................ 60
3
4.5 Efecto de moduladores farmacológicos de CD73 y RAA sobre la citotoxicidad de drogas
3
antitumorales sustratos del transportador MRP1. .......................................................................... 65
5. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………..72
6. BIBLIOGRAFÍA……………….……………………………………………………………..81
vi

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Montaje de cultivo de células iniciadoras de tumor a partir de células de glioma de rata
C6.
Figura 2: Cinética de cultivo en células iniciadoras de glioma de alto grado, a partir de células de
glioma de rata C6.
Figura 3: Marcadores Stem Like Cell en células iniciadoras de tumor en gliomas de alto grado.
Figura 4: Montaje de cultivo de células iniciadoras de tumor de alto grado a partir de células de
Glioblastoma multiforme.
Figura 5: Marcadores Stem Cell en cultivo de neuroesferas a partir de U87.
Figura 6: Expresión de MRP1, CD73 y Rae4A en NE de C6 y U87.
3
Figura 7: Actividad de CD73 y su bloqueo mediante AOPCP.
Figura 8: Bloqueo de CD73 y RAA y su efecto en la expresión de MRP1.
3
Figura 9: Actividad MRP1 bajo los efectos de CD73 y MRS1220.
Figura 10: Viabilidad celular en cultivos de NE a partir de células C6 y U87, bajo los efectos de
Taxol, Etopósido y Vincristina, bloqueando el transportador MRP1.
vii

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I: Secuencia de los partidores utilizados y tamaños de producto de PCR obtenidos para
cada gen estudiado.
viii

LISTA DE ABREVIATURAS
AB/AM: Antibiótico y antimicótico (penicilina-streptomicina)
ABC: ATP binding cassette
bFGF: basic fibroblast growth factor (factor de crecimiento de fibroblastos)
BSA: Albúmina de suero de bovino.
CFDA: 5-carboxifluoreaceina diacetato
CYP: Citocromo P450
DAPI: 4´,6-diamidino – 2- fenilindol
DMEM: medio de cultivo “Dulbecco Modified Eagle´s médium”
DMEM-F12: medio de cultivo “Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12”
DMSO: Dimetil sulfóxido
EGF : Epidermal growth factor (factor de crecimiento epidermal)
IF: Inmunofluorescencia.
LIF: Factor inhibidor de leucemia.
MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol.
NE: Neuroesferas.
OMS: Organización Mundial de la Salud.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.
PI: Ioduro de propidio, del inglés Propidium Iodide.
ix

PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonio (inhibidor de proteasas).
PSA: Persulfato de amonio.
RA: Receptor(es) de adenosina.
RT-PCR: Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (Transcripción reversa - reacción en
cadena de polimerasa).
SDS: Dodecil sulfato de sodio
SNC: Sistema Nervioso Central.
TAE: Tampón Tris, Acetado y EDTA.
TEMED: N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina.
TO: Naranjo de Tiazol, del inglés Orande Thiazole
WB: Western Blot