Organisch-chemische Methoden : in Biochemie, Biologischer Chemie, Molekularbiologie und Medizinischer Chemie

228 Pages·2017·3.05 MB·German

by  Daniel Krois (auth.)

Daniel Krois
Organisch-chemische
Methoden
in Biochemie, Biologischer Chemie,
Molekularbiologie und
Medizinischer Chemie
Organisch-chemische Methoden
Daniel Krois
Organisch-chemische
Methoden
in Biochemie, Biologischer Chemie,
Molekularbiologie und Medizinischer Chemie
Daniel Krois
Institut für Chemische Katalyse
Universität Wien
Wien , Österreich
ISBN 978-3-662-53012-2 ISBN 978-3-662-53013-9 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-662-53013-9
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Vorwort
Zur Entstehung dieses Lehrbuchs Dieses Lehrbuch hat sich aus einer Vorlesung mit

dem Titel „Organisch-chemische Methoden in der Molekularbiologie und Biochemie“
entwickelt, die ich an der Universität Wien für Studentinnen und Studenten der Chemie,
Molekularbiologie, Mikrobiologie und Genetik sowie Biologischen Chemie seit dem Jahr
1999 jedes zweite oder dritte Semester gehalten habe. So ist es auch zu verstehen, dass ich
mich bisweilen direkt an die Leserinnen und Leser wende oder die Formulierung „wir…“
verwende.
Mich, als organischen Chemiker mit großem Interesse an der Biochemie, aber auch an
physikalisch-chemischen und spektroskopischen Methoden, hat das Gebiet der bioorgani-
schen Chemie, wie man es nennen könnte, schon lange fasziniert, sicher auch stark beein-
fl usst durch einen längeren Forschungsaufenthalt am Max-Planck-Institut für Biochemie,
Martinsried, in den Jahren 1986–1987. Daher hatte ich mich entschlossen, eine Vorlesung
zu konzipieren, die die Bedeutung der Organischen Chemie für biologische und medizini-
sche Themen beleuchtet und die für Studierende beider „Lager“ (Chemie und Biologie)
geeignet sein kann.
I ch möchte noch einen anderen Aspekt hervorheben, der die Entstehung dieser Vorle-
sung und daher auch dieses Buches wesentlich geprägt hat. Schon seit meinem Studium
der Chemie (1974–1981) an der Universität Wien ist mir ein Manko an unserem univer-
sitären System immer wieder bewusst geworden: Man ist als Student(in) lange Jahre
geplagt, sich seit Langem angehäuftes Wissen zu eigen zu machen und erst spät gelangt
man an die „Forschungsfront“. Am Anfang des 20. Jahrhunderts war das wohl noch ganz
anders. Damals wurden in Grundvorlesungen noch richtungsweisende Experimente
g emacht – diesen Eindruck hat man zumindest. Aber es ist mir auch immer bewusst ge-
wesen, dass es nötig ist, ein gewisses Maß an Grundwissen zu haben, bevor man anfan-
gen kann, wissenschaftlich mitzudenken und zu diskutieren. Da dieses Grundwissen
immer größer wird, wächst auch dieses Dilemma immer mehr. Eine ideale Lösung dafür
habe auch ich nicht gefunden. In dieser Vorlesung aber, die ja schon ein gewisses Grund-
wissen der Chemie, speziell der organischen Chemie und der Biochemie, voraussetzen
kann, da sie ursprünglich für den zweiten Studienabschnitt eines Diplomstudiums und
jetzt für Master-Studiengänge gedacht ist, sollte diese Möglichkeit gegeben sein. Aus
v
vi Vorwort
diesem Grund ist sie in zwei Teile gegliedert: einen methodischen ersten Teil, der aber
auch schon neueste Entwicklungen in sich integriert, und einen zweiten Teil, in dem he-
rausgegriffene Themen, Anwendungsbeispiele organisch-chemischer Methodik, anhand
von Original literatur verfolgt und diskutiert werden.
Z ur Thematik des Lehrbuches D ie Chemie, die hinter den Lebensprozessen steckt, hat

nichts an ihrer Faszination eingebüßt, auch wenn wir heutzutage viel mehr davon verste-
hen als vor 50 Jahren. Man könnte sagen – im Gegenteil – es ist vieles noch spannender
geworden, und wir sind sicher noch lange nicht am Ende dieser aufregenden Entdeck-
ungsreise angelangt. Neu gewonnene Erkenntnisse müssen in der Folge in neue medizini-
sche Therapien oder neue Wege in der Landwirtschaft umgesetzt werden, und die
Aufklärung der Gehirnfunktionen wird sich auch in der Computertechnik auswirken. Und
alles gemeinsam wird unser Verständnis von der gesamten Natur und der Menschheit im-
mer wieder neu beeinfl ussen. Kein Wunder, dass die Studien der Biochemie, der Bioorga-
nischen Chemie, der Biologischen Chemie, der Molekularbiologie, der Mikro biologie und
Genetik, der Medizinischen Chemie – und wie sie auch immer heißen mögen – immer
mehr Interessenten fi nden. 2003 zum Beispiel wurde von Herbert Wald mann die Faszina-
tion des Gebietes der „Biologischen Chemie“ in einem Review [Waldmann, H.: At the
crossroads of chemistry and biology. B ioorganic & Medicinal Chemistry 1 1 , 3045–3051
(2003).] formuliert.
Die Grundlage all dieser Wissenszweige ist einerseits die Chemie, und hier im Beson-
deren die Organische Chemie (die Chemie der Kohlenwasserstoffderivate), und anderer-
seits die Biologie. In diesem Lehrbuch nun soll versucht werden, die wesentlichen
Konzepte und Methoden der Organischen Chemie, die für diese Forschungsrichtungen
relevant sind, vorzustellen und eingehender zu behandeln (Teil 1) und dann beispielhafte
Anwendungen dieser Methodik aus der neueren Literatur zu diskutieren (Teil 2). Das soll
einerseits Chemikern die Möglichkeiten der Methodenentwicklung für diese biologischen
Fragestellungen aufzeigen und näherbringen und andererseits den Anwendern auf der eher
biologisch orientierten Seite die Hintergründe und die Kapazitäten dieser Methoden vor
Augen führen.
Inhaltsverzeichnis
1 Kurze Wiederholung grundlegender Konzepte der Allgemeinen
und Organischen Chemie .................................................................................. 1
1.1 Basizität — Azidität <–>Nucleophilie — Electrophilie.............................. 1
1.2 Resonanz und Tautomerie ........................................................................... 2
1.3 Aromatizität und Heterocyclen ................................................................... 4
1.4 Konfi guration – Konformation .................................................................... 6
Literatur................................................................................................................ 8
Teil I Organisch-chemische Methoden, die allgemein in biologischen
Fragestellungen Anwendung finden ................................................................. 9
2 Chemische Eigenschaften der „Biomoleküle“ – eine
Zusammenfassung.............................................................................................. 11
2.1 Aminosäuren, Peptide, Proteine .................................................................. 11
2.2 Kohlenhydrate ............................................................................................. 14
2.3 Nucleinsäuren .............................................................................................. 18
2.4 Lipide .......................................................................................................... 20
Literatur................................................................................................................ 22
3 Methoden zur Synthese und Analyse von Peptiden und Proteinen ............... 23
3.1 Synthese von Peptiden ................................................................................ 23
3.1.1 Schutzgruppen in der Peptidsynthese ............................................. 24
3.1.2 Herstellung der Peptidbindung („ Kupplung“ ) ................................ 28
3.1.3 Strategien zur Synthese längerer Peptide ........................................ 31
3.1.4 Abspaltung der Schutzgruppen und Reinigung .............................. 39
3.1.5 Multiple Peptidsynthesen und Herstellung
von „ Peptidbibliothek en“ ................................................................ 39
3.2 Analyse von Peptiden und Proteinen .......................................................... 45
3.2.1 Methoden zur Überprüfung der Homogenität (Reinheit) ............... 45
3.2.2 Massenspektrometrische Methoden ................................................ 46
3.2.3 Aminosäureanalyse (ASA) [a mino acid analysis , AAA] ............... 48
vii
viii Inhaltsverzeichnis
3.2.4 Peptidsequenzierung durch Edman-Abbau ..................................... 49
3.2.5 Analyse der Struktur von Peptiden und Proteinen .......................... 53
3.3 Ein illustratives Anwendungsbeispiel für SPPS und Edman-Abbau .......... 54
Literatur................................................................................................................ 5 6
4 Oligosaccharide (Kohlenhydrate) ..................................................................... 61
4.1 Oligosaccharidsynthesen ............................................................................. 61
4.1.1 Schutzgruppe n für die Hydroxylfunktionen von
Aldosen und Ketosen ...................................................................... 62
4.1.2 Herstellung der glycosidischen Bindung ........................................ 64
4.1.3 Automatisierte Oligosaccharidsynthesen ........................................ 66
4.2 Analyse von Oligosacchariden .................................................................... 68
4.2.1 Zusammensetzung von Kohlenhydraten (g lycosyl composition ) .... 68
4.2.2 Verknüpfungsanalyse ...................................................................... 69
4.2.3 Sequenz von Oligosacchariden ....................................................... 70
4.2.4 Anomere Konfi guration .................................................................. 70
4.2.5 Strukturanalyse von Oligosaccharidketten...................................... 70
Literatur................................................................................................................ 7 1
5 Glycokonjugate, Glycoproteine ........................................................................ 75
5.1 Glycolipide .................................................................................................. 75
5.2 Glycopeptide und Glycoproteine ................................................................ 77
5.2.1 Glycoproteintypen........................................................................... 77
5.2.2 Synthese von Glycopeptiden und Glycoproteinen .......................... 78
5.2.3 Biosynthese der N -Glycoproteine ................................................... 80
Literatur................................................................................................................ 8 2
6 Oligonucleotide und Nucleinsäuren ................................................................. 85
6.1 DNA Sequenzierung ................................................................................... 85
6.1.1 DNA Sequenzierung nach Maxam-Gilbert ..................................... 85
6.1.2 Sanger-Methode .............................................................................. 88
6.1.3 Neuere Sequenzierungsmethoden (n ext-generation
sequencing , NGS ) ........................................................................... 89
6.2 Oligonucleotidsynthese n ............................................................................. 92
6.2.1 Temporäre und permanente Schutzgruppen der
Oligonucleotidsynthese ................................................................... 93
6.2.2 Die „Phosphoramidit“- Methode ..................................................... 94
6.2.3 Die „Hydrogenphosphonat“- Methode ............................................ 96
6.2.4 Synthese zyklischer Oligonucleotide .............................................. 98
6.3 Modifi zierte Nucleinsäuren ......................................................................... 99
6.3.1 Modifi zierungen am Kohlenhydratanteil ........................................ 99
6.3.2 Peptidnucleinsäuren (PNA). ............................................................ 99
Inhaltsverzeichnis ix
6.3.3 Modifi zierungen an den Nucleobasen ............................................. 100
6.3.4 Unnatürliche Nucleinsäuren (XNA) ............................................... 102
Literatur................................................................................................................ 102
7 Methoden zur Herstellung von Konjugaten .................................................... 107
7.1 Derivatisierung von Aminogruppen ............................................................ 108
7.1.1 Amidbildung v ia Aktivester ............................................................ 108
7.1.2 Thioharnstoffverknüpfung mit Isothiocyanat en .............................. 108
7.1.3 Weitere Methoden ........................................................................... 109
7.2 Derivatisierung von Thiol-Funktionen (z. B. Cystein ) ................................ 110
7.2.1 Herstellung stabiler Thioether......................................................... 110
7.2.2 Reversible Verknüpfung als Disulfi de ............................................. 110
7.3 Derivatisierung von Alkoholen und Carbonylverbindungen....................... 112
7.3.1 Markierung von Alkoholen – direkt oder nach Transformation ..... 112
7.3.2 Markierungen für Aldehyde und Ketone ........................................ 113
7.4 Selektive Verknüpfung von Aziden mit terminalen
Alkinen („ Click“-Reaktion) ........................................................................ 114
7.5 Konjugation über Aktivierung durch UV- oder sichtbares Licht ................ 115
7.5.1 Photoaffi nitätsmarkierung en (p hotoaffi nity labeling ) ..................... 115
7.5.2 Photochemische Konjugation an feste Oberfl ächen ........................ 119
7.6 Bifunktionelle Konjugationsreagenz ien ...................................................... 119
7.6.1 Synthetische Anwendungen ............................................................ 119
7.6.2 Analytische Anwendungen (in der MS) ......................................... 122
7.7 Biotin -Avidin (bzw. - Streptavidin ), ein unzertrennliches Paar ................... 123
7.8 Beispiele und Zusammenfassung ................................................................ 126
Literatur................................................................................................................ 129
Teil II Ausgewählte Beispiele für die Anwendung organisch-chemischer
Methoden in biologisch bedeutenden Fragestellungen ................................... 133
8 Synthese von Lipopeptiden und Proteinkonjugaten zur
Funktion des N -Ras-Proteins ............................................................................ 135
8.1 Synthese von Lipopeptid en des N -Ras-Proteins ......................................... 136
8.2 Semisynthese fl uoreszenzmarkierter N -Ras-Proteine ................................. 141
8.3 Pepticinnamin E : ein natürlicher Inhibitor der
Ras-Farnesyl-Transferase ............................................................................ 144
Literatur................................................................................................................ 146
9 Entwicklung synthetischer Vakzine auf Peptidbasis gegen Malaria ............. 149
9.1 Allgemeine Einleitung ................................................................................ 149
9.1.1 Kurze immunologische Einleitung ................................................. 149
9.1.2 Plasmodium falciparum – der Erreger der Malaria ........................ 150
9.1.3 Synthetische Vakzine auf Peptidbasis ............................................. 151
x Inhaltsverzeichnis
9.2 Zwei Ansätze für ein Vakzin gegen das Circumsporozoit- Protein (CSP) ........ 152
9.2.1 Ein total synthetisches Vakzin auf Basis von Dendrimeren ............ 152
9.2.2 Kombination eines konformationell eingeschränkten
CS- Antigens mit hoch immunogenen Virosomen .......................... 155
9.3 Peptidbasierte Vakzine gegen Merozoiten .................................................. 156
9.3.1 Proteine der Merozoiten und ihre Funktion .................................... 156
9.3.2 Mechanismen der Immunevasion der Merozoiten .......................... 157
9.3.3 Der Versuch, konservierte essenzielle Bereiche der
Merozoitenproteine immunogen zu machen ................................... 157
9.4 Methoden zur Bestimmung der Immunreaktivität von
Antisera und Antikörper .............................................................................. 158
Literatur................................................................................................................ 161
10 Anwendungen modifizierter Oligonucleotide .................................................. 163
10.1 Gezielte Modifi zierungen an den Nucleobasen zum besseren Verständnis
der DNA-Doppelhelix nach dem Modell von Watson und Crick ................... 163
10.2 Nachweis von RNA (und DNA) durch speziell modifi zierte
Oligonucleotide (M olecular Beacons u. a.) ................................................. 168
10.2.1 Hybridisierung mit fl uoreszierenden Reagenzien ........................... 168
10.2.2 Templatgesteuerte Reaktion bringt Fluorophor zum Leuchten ......... 170
10.3 Modifi zierte Oligonucleotide zum Studium von Radikalen in der DNA ........ 174
Literatur................................................................................................................ 178
11 Methoden zur Modifizierung von Proteinen – Einführung
nicht-natürlicher Aminosäuren ........................................................................ 181
11.1 Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren über ein I n-vitro -
Proteinbiosynthese-System ......................................................................... 182
11.1.1 Prinzip der Methode ........................................................................ 182
11.1.2 Ein frühes Anwendungsbeispiel: Modifi zierung eines
Ras-Protein s .................................................................................... 184
11.1.3 Weitere Beispiele für I n-vitro -Expression modifi zierter Proteine........ 184
11.2 Gezielter Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in Proteine
durch I n-vivo- Expression ............................................................................ 186
11.2.1 Prinzip der Methode ........................................................................ 186
11.2.2 Einbau einer Aminosäure für gezielte photochemische
Vernetzung (p hoto-cross-linking ) ................................................... 188
11.2.3 Einbau eines Serinanalogons mit reversibel blockierter
Hydroxyfunktion zur Kontrolle der Proteinphosphorylierung ........ 190
11.2.4 Spezifi sche Einführung von posttranslationalen
Modifi zierungen am Lysin .............................................................. 191
11.3 Weiterentwicklungen der I n-vivo -Expression gezielt modifi zierter
Proteine ....................................................................................................... 192
Literatur................................................................................................................ 193