Optical detection of acetyl phosphate and biogenic amines

131 Pages·2010·5.16 MB·English

Optical Detection of Acetyl Phosphate
and Biogenic Amines

DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER
NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER FAKULTÄT
CHEMIE UND PHARMAZIE DER UNIVERSITÄT REGENSBURG

vorgelegt von

Mark-Steven Steiner

aus Wien (Österreich)
im November 2010
Optical Detection of Acetyl Phosphate
and Biogenic Amines

PhD Thesis
by
Mark-Steven Steiner

Für meine Familie
Diese Doktorarbeit entstand in der Zeit von Oktober 2007 bis November 2010 am
Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik an der Universität
Regensburg.

Die Arbeit wurde angeleitet von Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis.

Promotionsgesuch eingereicht am:
Kolloquiumstermin: 08.12.2010
Prüfungsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Frank-Michael Matysik
Erstgutachter: Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis
Zweitgutachter: Prof. Dr. Joachim Wegener
Drittprüfer: Prof. Dr. Jörg Heilmann
Danksagung

Mein erster Dank gilt besonders Herrn Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis für die
Bereitstellung des interessanten Themas, als auch für die hilfreichen Anregungen,
die Betreuung meiner Arbeit und die hervorragenden Arbeitsbedingungen am
Lehrstuhl.
Weiterhin möchte ich mich bei Herrn Dr. Axel Dürkop für die gute Betreuung
und die zahlreichen Diskussionen während meiner Doktorarbeit bedanken.
Außerdem danke ich allen Mitarbeitern des Lehrstuhls für die ausgezeichnete
kollegiale Arbeitsatmosphäre, die Hilfestellungen und fortwährende Unterstützung,
die zur Vollendung der Dissertation beigetragen haben. Vielen Dank auch an meine
ehemaligen Laborkollegen und besonders an Dr. Christian Spangler für die stets
lockere und angenehme Laborzeit. Dem Kaffeerunden-Team danke ich für
willkommene Ablenkung von der täglichen Arbeit und die vielen Übungsstunden in
„Zurückhaltung“. Spezieller Dank gilt Herrn Dominik Grögel für das Teilen desselben
harten Schicksals.
Robert Meier gebührt mein Dank für die vielen hübschen bunten Fotos und
die technische Hilfe bei der Erstellung des RGB-Messsystems. Für die handwerkliche
Arbeit an diesem System danke ich der Elektronik- und Feinmechanikwerkstatt.
Herrn Dr. Alexander Riechers danke ich für die Bereitstellung von Bis Cyclen und
die vielen anregenden Gespräche.
Meinen Azubis Roxane Harteis, Sabine Hofmeister und Matthias
Hautmann danke ich recht herzlich für die nette Laborzeit und großartige Hilfe bei
der Arbeit – ich hoffe ihr hattet genau so viel Spaß wie ich! Vielen Dank auch an
Johannes Reich für die geleistete Arbeit während seiner Bachelor Arbeit. Außerdem
danke ich Frau Sarka Bidmanova und Herrn Gasser Khairy für die interessante
internationale Zusammenarbeit im Rahmen des Projekts EGY 08/004. Frau Benz
(ETH Zürich), Herrn Dr. Stepp (LFL München) und Herrn Dr. Schubert (R-Bio,
Darmstadt) danke ich für die gemeinsamen Arbeiten während des Tumor Vision
Projekts.
Ganz besonders möchte ich mich bei Gisela Hierlmeier und Barbara
Goricnik für die nie endenden Quellen an Py-1 bzw. Zellen und Bakterien, Geduld
und guter Laune bedanken.
Außerdem möchte ich mich bei meinem Kommilitonen, Kumpel, und Personal-
Trainer Thomas Rödl bedanken, der mich durch das gesamte Studium begleitet hat,
mir ein treuer Praktikumspartner war und mit dem es nie langweilig wurde.
Ferner gilt ein ganz spezieller Dank meinen „Homies“ Dr. Heike Mader, Dr.
Christian Spangler, Dr. Corinna Spangler, Dr. Doris Burger, Katrin Uhlmann,
Rebekka Scholz und Claudia Niegel für die unzähligen unterhaltsamen
Spieleabende. Dr. Heike Mader danke ich überdies ganz besonders auch für das
kritische Lesen und gründliche Korrigieren der vorliegenden Doktorarbeit, ihr stets
offenes Ohr für all meine Probleme und die vielen kurzweiligen Filmabende.
Abschließend möchte ich mich allerdings bei meiner Familie bedanken.
Größter Dank gebührt meinen Eltern Andrea und Harold Steiner und meiner
Freundin Andrea Stanik, auf die ich mich allzeit verlassen konnte, die mich ertragen
haben, wie ich bin und die mir immer den Rücken frei gehalten haben. Vater, ich bin
stolz dein Sohn zu sein!
Table of Contents

1 Introduction and Aim of Work 1
1.1 References 4
2 Background 7
2.1. Basic Principles of Luminescent Chemosensors –
Recognition and Signalling 7
2.1.1 Photoinduced Electron Transfer (PET) 9
2.1.2 Internal Charge Transfer (ICT) 10
2.1.3 Excimer/Exciplex Formation 11
2.1.4 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 12
2.1.5 Other Less Common Mechanisms 13
2.2 Ruthenium Ligand Complexes (RMLC) 13
2.2.1 Metal to Ligand Charge Transfer (MLCT) – Mechanism of Emission of
Luminescence 13
2.2.2 Spectral Properties of RMLC 15
2.3 Optical Instrumental Evaluation of Test Strips 16
2.3.1 Evaluation by Reflectometry 16
2.3.2 Evaluation with Red-Green-Blue (RGB) Readout of a Digital Camera 17
2.4 References 21
3 Determination of Acetyl Phosphate (AcP) via Anion-
Probes 25
3.1 Introduction 25
3.2 Results and Discussion 26
3.2.1 Anion Detection via DCFL 26
3.2.2 Anion Detection via EIQD 30
3.2.3 Anion Detection via New Ruthenium Complexes: RuDCFL 32
3.2.4 Anion Detection via New Ruthenium Complexes: RuDPTP 34
3.2.5 Anion Detection via New Ruthenium Complexes: RuDAAP 36
3.2.6 Determination of AcP: Combination of DCFL and Hydrolysis
Promoter Bis-Cyclen (BC) 38
3.3 Conclusions 41
3.4 Experimental 42
3.4.1 Materials 42
3.4.2 Methods 42
3.4.3 Instruments 43
3.4.4 Synthesis 43
3.5 References 49
4 Determination of Acetyl Phosphate via a Luminescent
Ruthenium Ligand Complex 52
4.1 Introduction 52
4.2 Results and Discussion 54
4.2.1 Spectral Properties of RuPDO and Response to AcP 54
4.2.2 Choice of Activating Cation 57
4.2.3 Effect of pH and Reaction Time 57
4.2.4 Mechanism of Fluorogenic Reaction 59
4.2.5 Complex Stoichiometry and Calibration Plots 60
4.2.6 Interference of Other Relevant Phosphates 61
4.2.7 Tests of RuPDO-Zn in Cell Medium Containing NRK Cells 63
4.2.8 Tests of RuPDO-Zn in Lysogeny Broth Medium (LB) Containing E.Coli 64
4.3 Conclusions 68
4.4 Experimental 68
4.4.1 Materials 68
4.4.2 Methods 68
4.4.3 Instrumentation 69
4.4.4 Synthesis 69
4.5 References 70
5 Enzymatic Determination of Acetate via Acetate Kinase
and RuPDO 73
5.1 Introduction 73
5.2 Results and Discussion 75
5.2.1 Outline of the Assay Scheme 75
5.2.2 Effect of Mg2+ and Optimization of Zn2+ Concentration 76
5.2.3 Testing of the Enzymatic Acetate Assay under the Optimized Assay
Conditions 78
5.2.4 Application of the Enzymatic Assay to the Determination of Acetate
in Real Samples 79
5.3 Conclusions 83
5.4 Experimental 84
5.4.1 Materials 84
5.4.2 Methods 84
5.4.3 Instrumentation 85
5.4.4 Synthesis 85
5.5 References 85
6 Chromogenic Sensing of Biogenic Amines Using a
Chameleon Probe and the RGB Readout of Digital
Camera Images 87
6.1 Introduction 87
6.2 Results and Discussion 90
6.2.1 Design and Optimization of the Sensing Spots 90
6.2.2 Testing the Home-Built RGB Readout Setup 94
6.2.3 Testing Conceivable Interferents 97
6.2.4 Application of the Test Strips to the Determination of the Total Amine
Content (TAC) in Real Samples 100
6.3 Conclusions 106
6.4 Experimental 107
6.4.1 Materials 107
6.4.2 Preparation of Sensor Spots 108
6.4.3 Home-built Setup for Fluorescence-Readout via the RGB-Signals of
a Digital Camera 109
6.4.4 Standard Procedure for Determination of Biogenic Amines 111
6.4.5 Preparation of the Real Samples 111
6.4.6 Determination of Total Amine Content (TAC) in Extracts of
Real Samples 111
6.4.7 Data Evaluation 112
6.5 References 114
7 Summary 116
7.1 In English 116
7.2 In German 117
8 Curriculum Vitae 119