Observation of infection process of Metarhizium anisopliae on Plutella xylostella larvae with transmission electron microscopy

2006·1.2 MB·

by  Yin, Wang

昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#"$%"&’(()，*（+ )）：,(*’-,(*. /001(*.*2)’+)
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绿僵菌侵染小菜蛾幼虫过程的透射电镜观察
王 音,，雷仲仁,，!，张青文’，问锦曾,
（,M中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 ,(((+*；
’M中国农业大学农学与生物技术学院，北京 ,(((+*）
摘要：利用透射电镜观察了绿僵菌 -.#$/0+1+2($&+3’4)+$.对小菜蛾5)2#.))$ 67)’3#.))$幼虫的侵染过程。结果表明：接
种后’’ ?最早观察到绿僵菌穿透到寄主表皮层中，在穿透表皮过程中伴随着机械力和酶的活动。菌体进入寄主血
腔后，以菌丝出芽生殖、菌丝分隔及菌丝段分隔I种方式大量增殖，主要形成颗粒状的菌丝段在寄主体腔内扩散，
也形成少量的丝状菌丝。
关键词：小菜蛾；绿僵菌；增殖；侵染过程；透射电镜
中图分类号：N+).M= 文献标识码：4 文章编号：(*.*2)’+（) ’(()）()2,(*’2(*
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小菜蛾 5)2#.))$ 67)’3#.))$ 是十字花科蔬菜的重 骏和\78:"&，’(((），未涉及绿僵菌对小菜蛾致病机理
要害虫，因其严重的抗药性单纯依靠化学药剂已难 的研究，不清楚绿僵菌和小菜蛾的相互作用关系。
以控制其危害（0?"8C@: .# $)A，,++I；[6:G":%"&< .# 近年来，通过大量生物测定实验作者筛选到 ’ 个对
$)A，,++=）。目前寻找替代防治技术和措施已成为 小菜蛾有高致病性的绿僵菌菌株 R!). 和 R])=，为
小菜蛾治理研究的热点之一，生物防治以其良好的 了明确其对小菜蛾的侵染过程，探讨其致病机理，在
环境相容性和无公害性尤其受到重视。绿僵菌 利用扫描电镜研究寄主体表结构对绿僵菌入侵行为
-.#$/0+1+2( $&+3’4)+$. 是虫生真菌的主要类群之一， 的影响及绿僵菌侵染小菜蛾体表过程（王音等，
目前已广泛用于防治甘蔗、牧草、林木及卫生害虫。 ’((.）的基础上，进一步利用透射电镜详细观察了绿
关于用绿僵菌防治蔬菜害虫的研究较少，针对小菜 僵菌侵入小菜蛾幼虫体内及在寄主体内增殖的过
蛾的绿僵菌研究仅限于室内毒性测定和初步的田间 程。
防治试验（06:C76<@，,++,；R7B，,++*；\6，’(((；马
基金项目：国家“十五”科技攻关项目（’((,34.(+3()）；“十一五”国家科技支撑计划项目
作者简介：王音，女，,+)*年生，博士，副研究员，主要从事蔬菜害虫综合治理研究，52$678：97:;6:<=’.>96?@@A#@$A#:
!通讯作者 4BC?@&D@&#@&&"EF@:G":#"，H"8A：(,(2)’=,.+I(；52$678：8"7J?&>E7:6A#@$
收稿日期 K"#"7L"G：’((.2,’2’)；接受日期 4##"FC"G：’(()2(.2(+
3期 王 音等：绿僵菌侵染小菜蛾幼虫过程的透射电镜观察 ’"-$
无隔或有’个隔。可观察到菌丝段的产生有$种方
! 材料与方法 式：菌丝出芽生殖、菌丝分隔及菌丝段本身直接分隔
增殖。一些菌丝段刚形成时无明显的液泡，随时间
!"! 试虫和菌株 增加及增殖活动的进行才出现明显的液泡（图版!：
供试小菜蛾和绿僵菌菌株来源同王音等 ’"），液泡内有一些管状内含物和脂质体。除了菌丝
（!""#）。 段外，体腔内还有少量丝状菌丝，菌丝的细胞壁由较
!"# 接种及取样方法 薄的电子致密外层和稍厚的电子透明内层组成，菌
接种及取样方法同王音等（!""#）方法。 丝分隔与细胞壁内层结构相似，并与其相连（图版
!"$ 透射电镜样品制备及观察 !：’’）。接种后$ 天，体内大量繁殖产生的菌丝开
样品用 $%戊二醛前固定过夜，"&’ ()*+, 磷酸 始突出体表向体外生长（图版!：’!）。
缓冲液冲洗- .。’%锇酸后固定’ .，"&’ ()*+,磷酸
缓冲液冲洗 "&# .。$"% / ’""%系列酒精逐级脱 $ 讨论
水，每级脱水0 (12。国产3’4环氧树脂浸透、包埋、
聚合。瑞典 ,567$型超薄切片机切片，醋酸铀、柠檬 A>:B>=C99=;等（’@@@）报道，绿僵菌!0#和 A$4菌
酸铅双染色，日立870#""透射电镜观察绿僵菌接种 株在侵染西花蓟马 !"#$%&’$’(&&# )**’+($,#&’- 过程中，
不同时间后对小菜蛾组织的侵染情况，并拍照。 接种后 $" . 开始产生侵染钉；89::92 和 <.9=2*>?
（’@4@）研究表明，绿僵菌 DE’ 菌株侵染烟草天蛾
# 结果与分析 .#$+/*# -(0,# 约在接种后 !- . 开始进入表皮。本
实验首次研究绿僵菌侵入小菜蛾体内的过程，在接
透射电镜观察结果（图版!）显示，绿僵菌 ! 个 种后!! .即观察到穿透菌丝进入到寄主表皮层中，
菌株对小菜蛾侵染过程相同。接种后0 .，分生孢子 至!4 .穿透已普遍发生，说明绿僵菌 ,F34 和 ,G3#
已牢固附着于寄主表皮上（图版!：’）。接种后 !! 菌株对小菜蛾具有较快的侵染速度。
.，可看到大量分生孢子萌发产生芽管和附着胞（图 一般认为，虫生真菌穿透昆虫表皮是机械压力
版!：!），此时在超薄切片中首次观察到菌体穿透 和酶降解联合作用的结果（<.9=2*>?，’@4-）。昆虫表
到寄主表皮层中，至!4 .穿透已较为普遍。穿透菌 皮主要成分是蛋白质、几丁质和脂类，产生各种胞外
丝周围特别是前端出现电子密度很低的光晕，光晕 酶是病原真菌具有的降解寄主表皮的策略之一（王
区片层结构消失（图版!：$，-），这一现象说明穿透 海川和尤民生，’@@@）。作者曾报道利用扫描电镜观
过程伴随着组织溶解（89::92 92; <.9=2*>?，’@4@）； 察到绿僵菌在侵染小菜蛾过程中，穿刺点处出现明
在穿透菌丝附近，寄主表皮层的片层结构发生变形 显圆形小孔及附着胞周围发现分泌物等酶活动证据
（图版!：-），说明穿透行为还涉及机械力的作用； （王音等，!""#），本研究在透射电镜超薄切片中发现
穿透菌丝内含有大量线粒体和脂质体，表明其代谢 穿透菌丝周围表皮组织被溶解，进一步证实了绿僵
活动旺盛。 菌在侵入小菜蛾体内的过程中有酶的活动存在。这
侵入到表皮层的穿透菌丝很快产生大小、形状 一系统研究说明绿僵菌在分生孢子附着、开始穿透
各异的菌丝段（或称虫菌体，常呈颗粒状）和菌丝，使 及穿透过程中均伴随着酶的活动，通过对寄主表皮
表皮层整体也发生变形，内缘呈波浪状起伏（图版 的局部酶解作用实现了对寄主最终的成功入侵。另
!：#）；菌丝在表皮层内常平行于片层结构延伸 外，本实验观察到穿透菌丝使寄主表皮片层结构发
（图版!：3）。位于表皮层的穿透菌丝或直接垂直 生扭曲变形，证实了穿透过程中还存在着机械压力
向下（图版!：0）或在菌丝末端侧向出芽向皮细胞 作用。
层穿透（图版!：4），经一定时间后表皮层和皮细胞 王音等（!""-）研究表明，绿僵菌在小菜蛾体内
层分离。垂直向下穿透的菌丝使表皮层片层结构完 主要以产生颗粒状菌丝段的形式大量增殖，与组织
全被打乱，极大地破坏了表皮层的固有结构。菌体 病理观察结果一致，菌丝段的产生方式与 H9I.9=JK
从表皮层进入到皮细胞层中（图版!：@），随后进入 （’@0’）在叩头甲幼虫体内观察到的情况类似。菌丝
血腔，并在血腔内大量增殖，寄主组织逐渐解体。 段有利于菌体随寄主血淋巴的循环快速扩散至寄主
血腔内的菌体以颗粒状的菌丝段为主，菌丝段 各组织器官，使侵染更富有效率。这可能也是虫生
+H.. 昆虫学报 C1#$@+#-*-/-9’1$A’+’1$ .,卷
真菌战胜寄主昆虫的策略之一。 V#%9’%<’$4?M，L"’&73%)@，U2&1’(UN，Q#C31@，+,,-/ )11’11C’%738
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参 考 文 献（!"#"$"%&"’） （B’629367’$#：0&:7’&&29#’）3%5$:528’$1/ 3/ @1-+/ @+#-*-//，,（+ P）：
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染小菜蛾体表过程的显微观察/ 昆虫学报，.（- E）：+--F+,P］
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EHHH/ 绿僵菌对小菜蛾的感染反应分析/ 中国生物防治，+（R +）：
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+KF+-］
［王音，雷仲仁，张青文，问锦曾，黄虹，EHH./ 小菜蛾感染绿僵菌
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后的病征及组织病理变化/ 中国生物防治，E（H P）：+KRF+RH］
$+’,-./’$"（@’715"%2O388）/ 0"2&2662%’1D%2;’$127(，B31S#%31，!3&&’4’，
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（责任编辑：黄玲巧）
图 版 说 明J\6&#%#723%380&#7’
+]菌株B[R-分生孢子附着于寄主表皮上（G"）!3%292#（!）38B[R-#77#5"’93%7"’5:725&’（!:）（G"）；E] B[R-分生孢子萌发产生芽管和附着胞（EE
"）W’$C2%#7’953%292#38B[R-4#;’$21’734’$C7:<’#%9#66$’113$2（# )）（EE"）；P]表皮层B[R-穿透菌丝前端出现电子密度很低的光晕（箭头处）（E-
"）!&’#$2%4^3%’1#66’#$’92%7"’5:725&’#$3:%96’%’7$#%7"(6"#’（0I）38B[R-（#7#$$3=）（E-"）；.] B[R-已侵入到寄主表皮层（E-"），箭头示表皮片
层结构发生变形>%;#123%38B[R-2%5:725&’#%99’83$C#723%387"’&#C’&&#’（#7#$$3=）（E-"）；K] B[R-侵入寄主表皮层后使表皮层发生变形（E-"）
M’83$C’95:725&’<(2%;#123%38B[R-（E-"）；R]平行于表皮层层状结构生长的BMRK菌体（.-"）I(6"#’（I）38BMRK4$’=6#$#&&’&737"’&#C’&&#’38"317
5:725&’（.-"）；G] 表皮层中垂直向下穿透的B[R-菌体，表皮层与皮细胞层分离（.- "）I(6"#’ 38 B[R- 2% 7"’ 5:725&’ 4$’= ;’$725#&&(，#%9 5:725&’
1’6#$#7’98$3C’629’$C21（.-"）；-]位于表皮层的BMRK菌丝段端部侧向向皮细胞层穿透（.-"）J%938"(6"#’38BMRK2%7"’5:725&’4$’=2%73’629’$C21
&#7’$#&&(（.-"）；,]进入到皮细胞层的B[R-菌丝段（E-"）I(6"#&<39(（IS）38B[R-2%7"’’629’$C21（J）（E-"）；+H] B[R-菌丝段在体内大量增殖，
菌丝以出芽方式产生菌丝段（箭头处）或菌丝段自行分隔增殖（RH "）I(6"#& <392’1 38 B[R-，="25" 9’;’&36’9 8$3C "(6"#’ <( <:992%4 3$ <( 92$’57
1’67#723%7"’C1’&;’1，6$3&28’$#7’92%<39(5#;27(（RH"）；++]体腔内的B[R-菌丝体（GE"）I(6"#’38B[R-2%<39(5#;27(（GE"）；+E]体内增殖的BMRK菌
丝正穿出表皮（GE"）I(6"#&72638BMRK6:1"2%43:7=#$97"$3:4"5:725&’（GE"）/
王音等：绿僵菌侵染小菜蛾幼虫过程的透射电镜观察 图版
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图版说明见文后 ;<45/’/0&1’/007,,’=120,<0