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NTE INEN 2639 (2012) (Spanish): Método de
Ensayo para la Determinación de la
Biodegradación Anaeróbica de Materiales
Plásticos en Presencia de Lodos de Aguas
Residuales Municipales.
Quito - Ecuador
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 2639:2012
MÉTODO DE ENSAYO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA
BIODEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE MATERIALES
PLÁSTICOS EN PRESENCIA DE LODOS DE AGUAS
RESIDUALES MUNICIPALES.
Primera Edición
TEST METHOD FOR DETERMINING THE ANAEROBIC BIODEGRADATION OF PLASTIC MATERIALS IN THE PRESENCE OF
MUNICIPAL SEWAGE SLUDGE.
First Edition
DESCRIPTORES: Industria del caucho y plástico, productos plásticos, plásticos en general, biodegradación anaeróbica, ensayos.
PL 03.01-308
CDU: 678.5:620.171.5
CIIU: 3560
ICS: 83.080.01
CDU: 678.5 :620.171.5 CIIU: 3560
ICS: 83.080.01 PL 03.01-308
MÉTODO DE ENSAYO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA
Norma Técnica NTE INEN
BIODEGRADACIÓN ANAERÓBICA DE MATERIALES PLÁSTICOS
Ecuatoriana 2639:2012
EN PRESENCIA DE LODOS DE AGUAS RESIDUALES
Voluntaria 2012-07
MUNICIPALES.
1. OBJETO
1.1 Esta norma describe el método de ensayo para determinar el grado y la velocidad de
biodegradación anaeróbica de los materiales plásticos sintéticos (incluyendo aditivos de formulación)
en la exposición al lodo de un digestor anaeróbico de aguas residuales municipales de una planta de
aguas residuales, en condiciones de laboratorio.
1.2 Este método de ensayo está diseñado para determinar los índices aplicables a los materiales
plásticos que son más o menos biodegradables en relación a un estándar positivo dentro de un
ambiente anaeróbico.
2. ALCANCE
2.1 Este método de ensayo se aplica a todos los materiales plásticos no inhibidores de los
microorganismos presentes en los lodos de depuración anaeróbica de aguas residuales.
3. RESUMEN DEL MÉTODO DE ENSAYO
3.1 Este método consiste en seleccionar el material plástico para ensayo, obtener el lodo de un
digestor anaeróbico en una planta de tratamiento de residuos, exponer el material plástico al inóculo
obtenido del lodo de aguas residuales, medir la producción total de gas, de dióxido de carbono y de
metano (CO y CH ), generados en función del tiempo; el carbono orgánico soluble (COS), y peso
2 4
residual de polímero a la terminación del ensayo, y la evaluación del grado de biodegradabilidad.
3.2 El porcentaje de producción teórica de gas basado en el contenido de carbono medido o
calculado se reporta con respecto al tiempo a partir del cual se evalúa el grado de biodegradabilidad.
4. DEFINICIONES
4.1 Para los efectos de esta norma, se adoptan las definiciones contempladas en la terminología de
la NTE INEN 2636.
5. DISPOSICIONES GENERALES
5.1 Los valores indicados en unidades del Sistema Internacional, SI, deben ser considerados como
los estándares.
5.2 Esta norma no tiene el propósito de contemplar todo lo concerniente sobre seguridad, si es que
hay algo asociado con su uso. Es responsabilidad del usuario de esta norma establecer prácticas
apropiadas de seguridad y salud, y determinar la aplicabilidad de las limitaciones reglamentarias
previo a su uso. Los riesgos específicos se encuentran especificados en la Sección 8.
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DESCRIPTORES: Industria del caucho y plástico, productos plásticos, plásticos en general, biodegradación anaeróbica,
ensayos.
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5.3 Significancia y uso
5.3.1 El grado y velocidad de biodegradabilidad anaeróbica de un material plástico por este método
de ensayo puede predecir el tiempo requerido para eliminar el plástico del medio ambiente,
dependiendo de las similitudes de los ambientes. Debido al creciente uso de plásticos, el desecho de
los mismos es un asunto trascendente. Este método de ensayo es útil para obtener un estimado del
grado y persistencia de los plásticos en los sitios de desecho anaeróbicos biológicamente activos.
Este método de ensayo determina el índice y grado de biodegradación anaeróbica, mediante la
medición del volumen generado del dióxido de carbono y del metano, como función del tiempo de
exposición al lodo del digestor anaeróbico de aguas residuales.
5.3.2 El lodo del sistema alcantarilla-digestor aeróbico proveniente del tratamiento lodos de
depuración de una planta de tratamiento de aguas residuales que trata principalmente residuos
municipales, es un entorno anaeróbico activo aceptable (disponible en un área geográficamente
amplia) en el cual realizar los ensayos de una amplia gama de materiales plásticos. Este método de
ensayo puede considerarse un ensayo acelerado si se compara con un entorno anaeróbico típico,
como los sitios de relleno sanitario a los cuales los plásticos son conducidos en los métodos
habituales de disposición de desechos debido a la población microbiana altamente activa del digestor
anaeróbico de lodos.
5.4 Correspondencia. Esta norma INEN es la versión oficial, en español, para el Ecuador, de la
Norma ASTM D 5210-02 (2007).
6. EQUIPO
6.1 El gas generado será recogido ya sea con un cilindro invertido graduado sumergido en agua,
agua acidificada con ácido sulfúrico a un pH <3, una jeringa con émbolo de libre movimiento, u otros
dispositivos adecuados para medir el volumen de gas, como un transductor de presión.
6.2 Un cromatógrafo de gas, u otro equipo, provisto de un detector adecuado y columna(s), debe
utilizarse para cuantificar la evolución del metano y del dióxido de carbono, mediante un
procedimiento analítico específico para estos gases.
6.3 Una incubadora con capacidad suficiente para almacenar las botellas de ensayo a 35 ± 2°C, en
un ambiente oscuro en el tiempo que dure el ensayo.
6.4 Aparato de manejo del medio que permita mantener las condiciones anaeróbicas durante la
preparación e inoculación del medio (ver figura 1).
6.5 Botellas de suero, con capacidad suficiente para el experimento, con tapones de caucho butílico
y abrazaderas de pinza para sostener los tapones de goma.
6.6 Balanza analítica, para pesar las muestras antes y después del ensayo.
6.7 Instrumento analítico, para medir el contenido de carbono orgánico soluble del medio acuoso
antes y después del ensayo.
(Continúa)
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FIGURA 1. Diagrama esquemático de un aparato adecuado para el mantenimiento de las
condiciones anaeróbicas durante la preparación del medio y la inoculación
Pipeta
volumétrica de
punta abierta
graduada de
100 ml
Medio Cañería de Succión
definido descargas
Agitador Botella de Sello de agua
magnético suero
7. REACTIVOS Y MATERIALES
7.1 En todos los ensayos deben utilizarse productos químicos de grado reactivo.
7.2 Pureza del Agua. A menos que se indique lo contrario, la pureza del agua debe entenderse
como agua de grado reactivo medio tal como está definido por el Tipo IV en la Especificación ASTM D
1193.
7.3 Las soluciones madres se preparan como se indica en la tabla 1.
7.4 Hasta 1 ml de HCl concentrado puede añadirse a la Solución Madre S-3 para mejorar la
solubilidad de las sales. Agitar bien antes de usar con el fin de distribuir cualquier material no disuelto
en la solución.
8. PELIGROS
8.1 Este método de ensayo involucra el uso de productos químicos peligrosos. Evitar el contacto con
los productos químicos utilizados y seguir las instrucciones del fabricante y de las hojas de
información de seguridad del material, MSDS.
_________
NOTA 1. Precaución: Este método implica el uso de lodos de una planta de tratamiento de residuos. Evitar el
contacto con estos lodos mediante el uso de guantes y otros equipos adecuados de protección. Aplicar una buena
higiene personal para minimizar la exposición a agentes microbiológicos potencialmente dañinos.
(Continúa)
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TABLA 1: Soluciones Madre para el Ensayo de Biodegradación Anaeróbica
Cantidad,
Concentración
Concentración, mL,
Solución madre Compuesto en el medio, m
g/L añadida
moles
por 4 L
S-1 Resazurin 0,5 8 …
S-2 KH PO 69,0 … 1,0
2 4
K HPO 88,0 … 1,0
2 4
(NH ) HPO 10,0 8 0,15
4 2 4
NH CI 100,0 … 3,7
4
S-3A Mg Cl · 6H O 60,0 … 3,0
2 2
FeCl · 4H O 20,0 … 1,0
2 2
KCI 10,0 … 1,3
CaCl 10,0 … 0,90
2
KI 1,0 … 0,060
MnCl · 4H O 0,40 … 0,020
2 2
CoCI · 6H O 0,40 40 0,017
2 2
NiCl , 6H O 0,050 … 0,0021
2, 2
CuCl 0,050 … 0,0037
2
ZnCl 0,050 … 0,0037
2
H BO 0,050 … 0,0081
3 3
Na MoO ·H O 0,050 … 0 0018
2 4 2
NalO · nH O 0,050 … 0,0041
3 2
Na SeO 0,010 … 0,00054
2 3
S-4 Na S · 9H 0 50,0 8 0,40
2 2
Bicarbonato NaHCO … 16,8 g 50,0
3
A S-3 puede formar una pequeña cantidad de precipitado en reposo, agitar bien antes de usar.
9. INÓCULO - ORGANISMOS PARA ENSAYO
9.1 El inóculo está constituido por el lodo de un digestor anaeróbico de lodos de aguas residuales
bien operado con un nivel total de sólidos orgánicos de por lo menos el 1% al 2% (P/ V). La planta de
tratamiento de aguas residuales no debe recibir más del mínimo efluente proveniente de la industria, y
el tiempo de retención de los sólidos por parte del digestor deberá ser de 15 a 30 días. Al momento
de la recolección, se debe filtrar los lodos con un tamiz de 2 mm o una capa de estopilla (tela filtrante
de tramado poco tupido).
9.2 Para el ensayo se puede utilizar lodo fresco, pero este puede almacenarse hasta por dos
semanas a 4°C antes de su uso sin una pérdida significativa de actividad. De preferencia, el lodo es
digerido anaeróbicamente durante otros 7 a 14 días a 35°C para reducir la actividad de fondo, la cual
podría interferir con el ensayo.
9.3 Tener cuidado de minimizar la exposición del lodo al oxígeno durante la recolección,
manipulación y almacenamiento.
10. MUESTRA DE ENSAYO
10.1 La muestra del ensayo debe tener un peso conocido y un contenido de carbono suficiente para
producir volúmenes de dióxido de carbono y de metano que puedan ser medidos de forma adecuada
por los dispositivos de captura descritos en este método de ensayo. Es factible modificar dichos
dispositivos para facilitar la manipulación de materiales plásticos.
(Continúa)
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10.2 La muestra puede estar en forma de películas, piezas, fragmentos o artículos formados.
Registrar esta información en la Sección de Informe.
10.3 Opcionalmente se puede medir el peso molecular antes y después del ensayo de acuerdo con
el Método de Ensayo ASTM D 3593. Registrar los datos en la Sección de Informe.
11. PROCEDIMIENTO
11.1 Medio de inóculo
11.1.1 Preparar el medio pre-reducido a partir de las soluciones madre en la Tabla 1. Añadir 8 ml de
Solución Madre S-1, 8 ml de S-2, y 40 ml de S-3 en aproximadamente 3500 ml de agua de grifo libre
de cloro, agua de Tipo IV o mejor, en un frasco Erlenmeyer o Florencia de 4 litros. Calentar a
ebullición mientras se agita con una barra de agitador magnético, y opcionalmente se puede rociar
una mezcla de 30% de dióxido de carbono y 70% de nitrógeno. En caso de usarse, esta mezcla
puede comprarse o elaborarse mezclando los dos gases utilizando medidores de flujo calibrados u
otros dispositivos apropiados. Puede utilizarse nitrógeno comercial con un contenido de oxígeno
menor a 10 ppm y dióxido de carbono comercial con un contenido de oxígeno menor a 200 ppm de
oxígeno, siendo gases fácilmente disponibles en el mercado.
11.1.2 Colocar el frasco que contiene el medio en un baño de hielo y continuar rociando gas hasta
que la temperatura alcance los 35ºC.
11.1.3 Retirar el frasco que contiene el medio y añadir 16,8 g de bicarbonato de sodio, 400 ml de
inóculo de lodo, y 8 ml de Solución S-4. Este volumen debe ser aproximadamente de 4 L.
11.2 Muestra de ensayo y control
11.2.1 Añadir la muestra de ensayo y el control a las botellas de suero, con cuidado de mantener una
atmósfera inerte previamente a la adición del medio inoculado. Los pesos de la muestra deben ser
observados con exactitud.
11.2.2 Realizar la preparación de las botellas de muestra, de los blancos y de los controles por
triplicado.
11.2.3 Muestrear todas las botellas para el análisis del contenido de carbono soluble.
11.3 Llenado de las botellas de ensayo
11.3.1 Transferir anaeróbicamente porciones de 100 mL del medio inoculado a botellas de suero con
capacidad total de aproximadamente 160 mL, o cantidades proporcionalmente mayores, en caso de
utilizar botellas de mayor tamaño para dar cabida a muestras plásticas más grandes. La figura 1
ilustra un aparato adecuado para mantener las condiciones anaeróbicas durante la preparación del
medio y la transferencia. También se puede utilizar otros dispositivos apropiados. Las válvulas V1 y
V2 se utilizan para controlar el paso del medio a las botellas de suero. Extraer el medio inoculado en
la pipeta por succión, luego mover la pipeta e insertar la punta en una botella de suero. Durante estos
procesos, rociar continuamente la botella de suero y el cuello del frasco del medio con una mezcla de
nitrógeno y dióxido de carbono de la composición indicada anteriormente.
11.3.2 Descargar el medio contenido en la pipeta dentro del frasco de suero.
11.3.3 Insertar un nuevo tapón de caucho butílico para botellas de suero, en el cuello de la botella
mientras la cañería utilizada para rociar el contenido de nitrógeno y dióxido de carbono es retirada. Se
puede utilizar una pequeña cantidad de lubricante de silicona para facilitar la inserción del tapón.
Mantener el tapón en su lugar con un sello de aluminio prensado.
11.4 Incubación
11.4.1 Al inicio de la incubación, se debe liberar cualquier presión de gas en cada botella para llevarla
a la presión atmosférica.
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11.4.2 Incubar las botellas en la oscuridad a 35 ± 2°C hasta que la evolución de gas (biodegradación)
del compuesto de ensayo se haya detenido. Esto se identifica cuando se tienen dos semanas
consecutivas sin producción significativa de gas en exceso respecto a la del blanco. Sin embargo, si
no se observa producción de gas en los materiales de ensayo, continuar con la incubación siempre y
cuando los cultivos anaeróbicos permanezcan activos según se indica en la producción de gas de los
controles.
11.4.3 Las botellas que contengan resazurina oxidada (color rosa) deben ser desechadas.
11.5 Mediciones analíticas:
11.5.1 Realizar una cantidad suficiente de mediciones de volumen de gas a fin de establecer la
tasa de producción de gas en función del tiempo. En las primeras etapas podrán requerirse lecturas
más frecuentes.
11.5.2 Medir la producción de gas en cada botella usando una jeringa u otro dispositivo adecuado
como se indica.
11.5.3 Si se utiliza una jeringa para medir el volumen, mantener la jeringa en posición horizontal
durante la medición, teniendo cuidado de mantener la aguja en el espacio de cabeza de la botella de
suero. Para determinar la producción de gas, permitir que el émbolo de la jeringa se mueva
libremente para igualar las presiones del frasco de suero y la atmosférica. En caso de usar un
transductor de presión, es necesario liberar la presión de gas para llevar a la presión atmosférica tras
la medición.
11.5.4 Determinar la producción de metano y dióxido de carbono mediante el uso de métodos
analíticos adecuados para la detección y cuantificación de estos gases, tales como la cromatografía
de gases con un detector apropiado.
11.5.5 Una vez que la evolución de gas se detenga, tal como se especifica en 11.4.2, realizar el
muestreo de la fase acuosa para medir el contenido orgánico soluble para el cálculo del balance de
masa.
11.5.6 Tamizar los contenidos del frasco para aislar los polímeros insolubles restantes, los cuales
deben lavarse, secarse y ser pesados para el cálculo del balance de masa. Además se podrá obtener
el peso molecular.
12. CÁLCULO
12.1 Determinar por cálculo o por análisis elemental el carbono orgánico total en la muestra de
ensayo. Esto determina la cantidad de muestra añadida a la botella de suero y los requisitos de
tamaño y volumen para el dispositivo de medición de volumen de gas empleado para este método de
ensayo, y la evolución teórica del volumen de gas para la biodegradación total.
12.2 Calcular el volumen de gas promedio acumulativo (de los tres resultados) obtenido en la
biodegradación anaeróbica del material de ensayo, restando la producción en volumen de gas
promedio acumulativo de producción de los controles en blanco.
12.3 Calcular el porcentaje de volumen teórico de gas producido dividiendo el volumen de gas
promedio acumulativo del material de ensayo para la producción teórica máxima de gas y
multiplicando por 100.
12.4 La producción teórica máxima de gas (dióxido de carbono más metano) de una sustancia
química orgánica se calcula como se indica a continuación, sobre la base de 1 mmol (= 12 mg) de
carbono orgánico añadido como la muestra; transformación química:
C + 2H CH (1)
2 4
C + 0 CO
2 2
Una milimol de carbono gaseoso ocupa 22,4 mL en condiciones normales de temperatura y presión, a
35°C (temperatura de reacción) y volumen, corregido por la presión de vapor a 35°C, es tal como se
indica a continuación:
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= 26,71 mL1 (2)
(La corrección también será requerida para la variación de la presión atmosférica durante el ensayo).
Este es el volumen teórico de gas que puede ser generado por mmol de carbono añadido a la botella
de suero.
13. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
13.1 La información sobre la toxicidad del material plástico puede ser útil para la interpretación de
biodegradabilidad baja o insignificante. (El conocimiento anticipado puede indicar toxicidad a un cierto
nivel del material en este ensayo, y este nivel no debería ser superado. En caso de ausencia de
información, un resultado bajo puede ser un indicativo de que deberían evaluarse niveles más bajos
del material para evitar posibles efectos de toxicidad. Se debe tener cuidado de mantenerse dentro de
los niveles del material que produzcan suficiente evolución de gas y medir con exactitud, de tal
manera que la biodegradabilidad pueda ser evaluada).
13.2 Cuando se investigue un material plástico, es necesario utilizar una sustancia de referencia o
de control que se conozca como biodegradable en condiciones anaeróbicas (por ejemplo, celulosa,
almidón), esto con el fin comprobar la actividad del inóculo. Si en la sustancia de referencia se
observa menos del 70% de biodegradación (sobre la base de CO y CH ), el ensayo debe
2 4
considerarse como inválido y debe repetirse con inóculo fresco.
13.3 El nivel de meseta en la producción de gas por este método de ensayo, junto con el peso de la
muestra restante y el contenido medido de carbono orgánico disuelto, indicarán mediante el balance
de carbono el grado de biodegradabilidad de los materiales plásticos en este método de ensayo.
13.4 La humectación del material plástico puede influir en los resultados obtenidos, por lo tanto, el
procedimiento puede estar limitado a comparar materiales plásticos de estructura química similar.
14. REPORTE
14.1 Reportar los siguientes datos e información:
14.1.1 Información sobre el inóculo, incluyendo la fuente, el porcentaje de sólidos volátiles, la fecha
de recolección y el uso, el tiempo y condiciones de almacenamiento, la manipulación y la aclimatación
potencial para el material de ensayo.
14.1.2 Contenido de carbono del material plástico.
14.1.3 Registrar la evolución acumulativa de gas con el tiempo, hasta alcanzar el nivel de meseta, y
representar gráficamente, no solamente como resultado final, ya que la fase de latencia y la
pendiente (tasa) también son importantes.
14.1.4 Reportar el análisis de gases como porcentaje de metano y dióxido de carbono en cada lectura
de gas.
14.1.5 El porcentaje de la evolución teórica de gas junto con la forma de presentación del material
plástico; es decir, lámina, polvo, gránulos, etc., tanto para el material de ensayo como para el control
estándar.
14.1.6 La desviación estándar para cada conjunto de réplicas de botellas (por lo menos tres).
14.1.7 Rango de la temperatura del ensayo.
14.1.8 En caso de requerirse un tratamiento matemático más riguroso de la información, los datos de
la evolución acumulativa de gas versus el tiempo puede ajustarse a un modelo de regresión no lineal
para generar constantes de velocidad para la mineralización y la extensión final de la biodegradación
en un tiempo infinito (asíntota, si no se alcanza un nivel de meseta). 1,2
1 Corrección de la presión de vapor de agua a 35°C para corregir el gas húmedo.
2 Larson, R. J, and Brothanst'r, J. Fate Chem. Aquat. Environ., Proc. Workshop, American Society Microbial, Washington, DC,
1980, pp. 67--88.
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