NOVAS ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA O TRATAMENTO DA CRIPTOCOCOSE

180 Pages·2013·6.99 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio Mesquita Filho”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS ARARAQUARA

Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas
à Farmácia

Tese de Doutorado

NOVAS ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA O
TRATAMENTO DA CRIPTOCOCOSE: ANÁLOGOS DE
RESVERATROL E microRNAs

Fernanda Patrícia Gullo

2016
Fernanda Patrícia Gullo

NOVAS ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA O
TRATAMENTO DA CRIPTOCOCOSE: ANÁLOGOS DE
RESVERATROL E microRNAs

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Farmacêuticas – UNESP, Araraquara, como
parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Biociências e Biotecnologia

Aplicadas à Farmácia

Orientadora: Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida

Coorientador: Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos

Coorientadora: Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini

2016

Este trabalho foi desenvolvido na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Araraquara/SP – UNESP, sendo o doutorando contemplado com bolsa CAPES e contou
com auxílio financeiro do e CNPQ-RENAMA (processo nº CNPQ 403586/2012-7) e
FCT-CAPES Portugal (processo nº 345/13)
“Tu te tornas eternamente responsável por aquilo que cativas”
(O Pequeno Príncipe – Antoine de Saint-Exupéry)
DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Fátima e Nivaldo, que com o amor incondicional, sempre me apoiaram,
entenderam e aceitaram meus sonhos. Por serem minha base e apoio nos momentos
difíceis, sempre fazendo o possível e impossível por mim. Por entenderem minhas
ausências e por sempre vibrar por minhas conquistas, dedico este trabalho a vocês. Amo
vocês!

A meu noivo, Evandro, o responsável por eu chegar até aqui. Por viver meus sonhos,
por não me deixar desistir nunca, por ser minha força para superar a distância, a saudade
e o cansaço, por ser meu sorriso e permitir que eu seja o motivo do seu. Sem você eu
não teria enfrentado os desafios que a vida me proporcionou, sem seu amor e seu abraço
eu não teria conquistado o que conquistei. Amo você!
AGRADECIMENTOS

Agradeço, primeiramente, a Deus por me conceder a graça da família, da saúde e da paz
interior. Obrigada pelas oportunidades da vida, pelas pessoas maravilhosas que cruzaram meu
caminho, me fazendo evoluir como ser humano e pela proteção de cada dia.
À minha orientadora, professora Ana Marisa Fusco Almeida, muito obrigada pela oportunidade
que me deu em continuar trabalhando com o que eu realmente amo. Obrigada pela confiança,
dedicação e por proporcionar meu crescimento pessoal e intelectual.
Ao meu coorientador, professor Jean Leandro dos Santos que, juntamente com Luiz Dutra,
tiveram participação essencial neste trabalho, pela síntese de compostos, ajuda nos ensaios com
camundongos, além das discussões de resultados e grande troca de experiências. Muito obrigada
pela confiança depositada em mim, colaboração e parceria de sempre.
À minha coorientadora professora Maria José Soares Mendes Giannini, pelo exemplo de
profissional, por acreditar no meu trabalho e por todo conhecimento que me proporcionou
durante esses anos.
Obrigada à todos do Laboratório de Micologia Clínica e Núcleo do Proteômica da UNESP.
Rosângela, Rosemira, Carol (Tatoo), Patrícia, Carol (Panta), Suélen, Liliana, Wanessa, Mônica,
Priscila, Rodrigo, Ana (Espanha), Kayla, Carol (Mineira), Jaqueline, Paulo e Mariana. Faltam
palavras para agradecer cada um de vocês. Obrigada pelas conversas e boas risadas, troca de
experiências, por me ajudarem sempre, na limpeza da minha bagunça quando estava atrasada,
nas caronas, com apoio nos experimentos, com palavras amigas de que tudo ia dar certo. Muito
obrigada de coração!
Aos amigos passaram pela micologia e deixaram uma grande carga de conhecimento e saudade,
Fer Sangalli e Tatiane, que falta vocês fizeram nesses últimos anos de doutorado minhas amigas
“Cryptas”, obrigada pela amizade e por toda ajuda neste trabalho. À Julhiany, não posso deixar
de agradecer por todo conhecimento que me passou, por me ensinar e me encantar pela cultura
celular!
Gostaria de agradecer em especial à Nayla, minha amiga desde sempre e para sempre, que
compartilhou comigo todos os momentos da minha vida, desde a época da faculdade, sendo
peça essencial na conclusão deste trabalho. À Janaína, que tenho não só como um exemplo de
profissional, mas também como uma grande amiga; obrigada por cada dia de convivência, por
cada conhecimento, pela oportunidade de trabalhar com você e principalmente pelo carinho e
verdadeira amizade. À Natália, que nunca mediu esforços para me ajudar em qualquer coisa que
seja; muito obrigada por tudo, pela amizade verdadeira, pelo acolhimento na sua casa, pelos
finais de semana de trabalho; este trabalho tem muito de você. À Junya, que compartilhou
comigo a experiência única do doutorado sanduíche, obrigada pela amizade e por toda ajuda,
com certeza tudo teria sido muito mais complicado sem você. Obrigada à Claúdia por todo
cuidado com meus experimentos, pela amiga que é, por ouvir meus desabafos e sempre me
aconselhar da melhor forma possível. Ao Haroldo por toda ajuda na reta final deste trabalho;
sem sombra de dúvidas, você me deixou mais leve e mais confiante em cada comentário sobre
meu trabalho, muito obrigada. Também gostaria de agradecer à Marina, “minha aluna”, se assim
posso dizer, que a princípio seria mais um desafio para mim, mas por fim, acabou sendo mais
uma pessoa especial cruzou meu caminho, obrigada por me dar a oportunidade de ensinar um
pouquinho de micologia e pelo prazer em ver você caminhando “com suas próprias pernas”,
além de sempre estar pronta para me ajudar no que quer que seja. A todos vocês, muito obrigada
de coração!
Obrigada ao professor Francisco Javier Enguita e Marina Costa, do Instituto de Medicina
Molecular da Universidade de Lisboa. Muito obrigada por me receber em seu laboratório, pela
oportunidade, pela paciência, por cada ensinamento e pela experiência única em realizar o
doutorado sanduíche.
Ao professor Daniel dos Santos Assis, responsável pelo Laboratório de Micologia do Instituto
de Ciências Biológicas da UFMG, que teve a gentileza de me receber em seu laboratório,
expandindo meus conhecimentos e meu círculo de amizades. Aproveito para agradecer todos os
alunos do laboratório de micologia que me acolheram, que impressionantemente me ajudaram
nos ensaios com camundongos, reforçando a importância do trabalho em equipe. Agradeço em
especial à Lorena, por me receber tão bem em sua casa, pela paciência, pelo conhecimento, pela
ajuda essencial na conclusão deste trabalho, pelos deliciosos momentos de descontração e pela
amizade que fica além do laboratório.
Agradeço aos dois pequenos anjos, meus sobrinhos, Maria e Miguel, por me lembrar
constantemente que é preciso muito pouco para ser feliz, por me desligar do mundo e
preocupações, tornando a minha maior preocupação, estar presente quando dizem que sentem
saudades. Obrigada por existirem na minha vida!
I

SUMÁRIO
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1. Criptococose ................................................................................................ 1
1.2. Epidemiologia .............................................................................................. 2
1.3. Manifestações Clínicas ................................................................................ 4
1.4. Imunologia na Criptococose ........................................................................ 6
1.5. Fatores de Virulência ................................................................................... 8
1.6. Tratamento ................................................................................................... 10
1.7. Resistência Fúngica ...................................................................................... 12
1.8. Hidrazonas Análogas de Resveratrol ........................................................... 13
1.9. microRNA ................................................................................................... 16
1.10. Animais Alternativos ................................................................................... 19
1.10.1. Zebrafish (Danio rerio) ..................................................... 19
1.10.2. Galleria mellonella ............................................................ 20
2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 22
2.1. Objetivo Geral ............................................................................................. 22
2.2. Objetivos Específicos .................................................................................. 22
3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 23
3.1. Comitê de Ética ............................................................................................ 23
3.2. Micro-organismos ........................................................................................ 23
3.3. Análogos de Resveratrol .............................................................................. 24
3.4. Cultura Celular ............................................................................................. 24
3.5. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) E Concentração
Fungicida Mínima (CFM) ............................................................................................ 25
3.6. Determinação da Atividade Combinatória ................................................... 26
3.7. Ensaio de Citotoxicidade ............................................................................. 27
3.8. Interação Cryptococcus neoformans e Células Hospedeiras ....................... 28
3.9. Estudo da Interação Cryptococcus neoformans e Célula Hospedeira por
Citometria de Fluxo .................................................................................................... 29
3.10. Estudo da Interação Cryptococcus neoformans e Célula Hospedeira por
Imunofluorescência ...................................................................................................... 30
3.11. Ensaio de Toxicidade em Zebrafish ............................................................. 31
3.12. Ensaio de Toxicidade em Galleria mellonella ............................................. 33
3.13. Ensaio de Toxicidade em Camundongos ..................................................... 33
3.14. Avaliação Bioquímica .................................................................................. 34
II

3.15. Ensaio de Sobrevivência em Camundongos ................................................ 35
3.16. Ensaio de Comportamento (SHIRPA) ......................................................... 36
3.17. Ensaio de Carga Fúngica .............................................................................. 36
3.18. Extração de RNA e Síntese de cDNA .......................................................... 37
3.19. Análise da Expressão de microRNA na Interação Cryptococcus
neoformans e Células U87-MG.................................................................................... 38
3.20. Análise de Transcritos na Interação Cryptococcus neoformans e Células
U87-MG. ...................................................................................................................... 39
3.21. Análise in silico de Proteínas ....................................................................... 40
3.22. Quantificação da Expressão de Proteínas por Imunofluorescência ............. 41
3.23. Ensaio de Apoptose por TUNEL .................................................................. 41
3.24. Avaliação da Expressão da Proteína Pró-apoptótica (Bak) .......................... 43
4. RESULTADOS .............................................................................................................. 44
4.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM) ............................................................................................ 44
4.2. Determinação da Atividade Combinatória ................................................... 46
4.3. Avaliação da Citotoxicidade ........................................................................ 47
4.4. Estudo da Interação Cryptococcus neoformans e Célula Hospedeira por
Citometria de Fluxo ..................................................................................................... 50
4.5. Estudo da Interação Cryptococcus neoformans e Célula Hospedeira por
Imunofluorescência ...................................................................................................... 53
4.6. Ensaio de Toxicidade em Zebrafish ............................................................. 59
4.7. Ensaio de Toxicidade em Galleria mellonella ............................................. 65
4.8. Avaliação da Toxicidade em Modelo Murino ............................................. 67
4.9. Avaliação Bioquímica .................................................................................. 72
4.10. Ensaio de Sobrevivência .............................................................................. 73
4.11. Ensaio de Comportamento (SHIRPA) ......................................................... 74
4.12. Carga Fúngica .............................................................................................. 78
4.13. Análise da Expressão de microRNA na Interação Cryptococcus
neoformans e Célula U87-MG ..................................................................................... 79
4.14. Correlação entre Transcritos e microRNAS ................................................ 83
4.15. Análise in silico de Proteínas ....................................................................... 85
4.16. Quantificação da Expressão de Proteínas por Imunoflourescência ............. 86
4.17. Ensaio de Apoptose por TUNEL .................................................................. 89
4.18. Avaliação da Expressão da Proteína Pró-apoptótica (Bak) .......................... 91
5. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 94