NKUBAP.00.24.AR.13.20

34 Pages·2015·1.17 MB·Turkish

by  Kemal Tan

NKUBAP.00.24.AR.13.20 nolu proje

Doğal Kum Zambağı (Pancratium maritimum L.)
Populasyonlarında Genetik Yapının Moleküler
Belirteçler Yardımı İle Belirlenmesi

Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Behiye Banu BİLGEN
Araştırmacı: Elif Ceren PEHLİVAN

2015
Doğal Kum Zambağı (Pancratium maritimum L.) Populasyonlarında Genetik
Yapının Moleküler Belirteçler Yardımı İle Belirlenmesi

Proje No: NKUBAP.00.24.AR.13.20

Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Behiye Banu BİLGEN

Araştırmacı: Elif Ceren PEHLİVAN

Ağustos 2015
Tekirdağ
ÖNSÖZ

Türkiye jeolojik çeşitlilik, farklı iklim tiplerine sahip olma, yükselti farklılıkları gibi
nedenlerden dolayı farklı yaşam alanlarına ev sahipliği yapmaktadır. Ayrıca çok
zengin floristik yapıya sahiptir. Türkiye biyoçeşitliliğinde önemli bir yere sahip olan
soğanlı bitkiler birçok alanda yüksek bir kullanım potansiyeline sahiptir. Kullanım
alanları arttıkça bu bitkilere olan ihtiyaç da artmaktadır. Soğanlı bitkilerin doğal
populasyonları turizm, kaçak sökümler, kentleşme, yol yapımı, endüstriyel
çalışmaların artması gibi çeşitli nedenlerin etkisi ile önemli ölçüde olumsuz
etkilenmekte ve sonuç olarak bu bitkilerin büyük çoğunluğu nesli tükenme tehlikesi ile
karşı karşıya kalmaktadır. Türkiye kıyılarında kumul alanlarda yayılış gösteren kum
zambağı (Pancratium maritimum); biyolojik çeşitlilik bakımından ülkemizin önemli
soğanlı bitkilerindendir. Bu proje kapsamında iki kum zambağı populasyonunun
(İğneada Longoz Ormanları Milli Parkı ve Çamlıkoy Tabiat Parkı) genetik yapısının
RAPD primerleri kullanılarak belirlenmesi amaçlanmış ve literatüre önemli katkılar
sağlayacak bilgiler elde edilmiştir. Bu çalışmanın, kum zambağı gen kaynaklarının
korunması konusunda halen yapılan ve yapılması planlanan çalışmalara, kum
zambağı ve yakın akraba türleri ile ilgili yapılacak olan çeşitli genetik çalışmalara
yararlı olmasını ve benzer yöndeki diğer araştırmalara ışık tutmasını dilerim.

Bu araştırma projesini NKUBAP.00.24.AR.13.20 proje numarası ile destekleyen
Namık Kemal Üniversitesi Rektörlüğü, Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne
(NKU BAP) teşekkürlerimi sunarım. Projede kullanılmak üzere kum zambağı
populasyonlarından yaprak örneği toplamamıza ilgili yönetmelik gereğince izin veren
T.C. Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Bitkisel Üretim Genel Müdürlüğüne ve
T.C. Orman ve Su İşleri Bakanlığı, Doğa Koruma ve Milli Parklar Genel Müdürlüğüne
teşekkür ederim.

Ayrıca, bu projenin yürütülmesinde destek ve yardımlarını esirgemeyen bölüm
başkanımız Prof. Dr. Sezen ARAT’a ve Namık Kemal Üniversitesi, Ziraat Fakültesi,
Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Öğretim Üyeleri ve Araştırma Görevlilerine, Ziraat
Fakültesi Dekanlığına, laboratuvar çalışmalarında yardımlarını gördüğüm lisansüstü
öğrencilerim Ahmet Kubilay BARUT ve Ceren ELİBOL’a, yine arazi çalışmaları
sırasında örnek toplamada yardımlarını gördüğüm Doç. Dr. Türker BİLGEN’e
teşekkür ederim.

Yrd. Doç. Dr. Behiye Banu BİLGEN
Proje Yürütücüsü
Ağustos 2015
i
İÇİNDEKİLER

ÖNSÖZ ..................................................................................................................... i
İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... ii
ÇİZELGELER DİZİNİ .............................................................................................. iii
ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................... iv
SIMGELER VE KISALTMALAR ............................................................................... v
ÖZET ...................................................................................................................... vi
ABSTRACT ........................................................................................................... vii
1. GİRİŞ .................................................................................................................. 1
2. GENEL BİLGİLER .............................................................................................. 3
3. GEREÇ VE YÖNTEM ......................................................................................... 7
3.1. Bitkisel materyal .............................................................................................. 7
3.2. DNA izolasyonu ............................................................................................... 7
3.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile DNA’nın çoğaltılması ........................ 8
3.4. Moleküler verilerin analiz ............................................................................... 12
4. BULGULAR ...................................................................................................... 13
5. TARTIŞMA ve SONUÇ ..................................................................................... 15
6. KAYNAKLAR .................................................................................................... 19
7. EKLER .............................................................................................................. 22
EK-1: Çalışılan populasyonlarda gözlemlenen 70 lokusa ait genetik çeşitlilik
parametreleri ........................................................................................................ 22
ii
ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1.Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından 2013 yılı için doğadan
toplanarak ihracatı yasak olan 20 çiçek soğanı ...................................................... 4
Çizelge 3.1. Çalışmada optimize edilen RAPD primerlerinin sekans
(dizi) bilgileri ............................................................................................................ 8
Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan RAPD primerleri için optimize edilmiş PCR
koşulları .................................................................................................................. 9
Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan RAPD primerleri için optimize edilmiş PCR
döngüleri ................................................................................................................. 9
Çizelge 4.1. Çalışılan iki kum zambağı populasyonundan elde edilen RAPD
bantlarına ait bilgiler ............................................................................................. 13
Çizelge 4.2. Çalışılan iki kum zambağı populasyonunda gözlenen allel sayısı
(Na), etkili allel sayısı (Ne), beklenen heterozigotluk (He), Shannon sabiti (I),
polimorfiklokus sayısı (P) ve oranı ve standart hataları ........................................ 14

iii
ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 3.1. Çalışılan kum zambağı populasyonlarından genel bir görüntü .............. 7
Şekil 3.2. Örneklerin, OPN-06 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ................................................................................. 10
Şekil 3.3. Örneklerin, OPN-12 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ................................................................................. 10
Şekil 3.4. Örneklerin, OPA-02 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ................................................................................. 11
Şekil 3.5. Örneklerin, OPB-10 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ................................................................................. 11
Şekil 3.6. Örneklerin, OPV-18 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ................................................................................. 12
Şekil 4.1. Çalışılan kum zambağı populasyonlarına ait RAPD lokusu bilgileri ve
heterozigotluk düzeyi ............................................................................................ 14

iv
SİMGELER ve KISALTMALAR

Simgeler

A Adenin
C Sitozin
dk Dakika
G Guanin
µl Mikrolitre (10-6 Lt)
µM Mikromolar (10-6 M)
mM Milimolar (10-3 M)
ng Nanogram (10-9 g)
pmol Pikomol (10-12mol)
T Timin
U Ünite (enzim birimi)
Volt Voltaj
% Yüzde
º Derece
ºC Santigrat derece

Kısaltmalar

AFLP Arttırılmış fragmentlerin uzunluk polimorfizmi (Amplified Fragment
Length Polymorphism)
AMOVA Moleküler varyans analizi
bç Baz çifti
Bkz. Bakınız
DNA Deoksiribonükleik asit
dNTP Deoksi Nükleotid Tri Fosfat
Gst Genetik farklılaşma katsayısı
He Nei’nin tarafsız haplotip çeşitlilik katsayısı

Hs Populasyon-içi genetik çeşitlilik

Ht Toplam genetik çeşitlilik

I Shannon sabiti
MgCl Magnezyum Klorür
2
Na Gözlenen allel sayısı
Ne Etkili allel sayısı
P Polimorfiklokus sayısı
P. Pancratium
PCR Polimeraz zincir reaksiyonu
RAPD Rastgele arttırılmış polimorfik DNA (Random Amplified Polymorphic
DNA)
SE (±) Standart hata (Standart Error)
SSRs Basit dizi tekrarları (Simple Sequence Repeats)
vd Ve diğerleri
v
ÖZET

Soğanlı bitkiler çeşitli sanayi alanlarında büyük bir kullanım potansiyeline sahip
olmalarından dolayı Türkiye biyoçeşitliliğinde önemli bir yere sahiptir. Kumul
alanlarda yayılım gösteren kum zambağı (Pancratium maritimum L.) önemli soğanlı
bitkilerimizdendir. Kum zambağının dekoratif bir bitki olmasının yanı sıra bitkide
bulunan alkaloidler ve flavonoidlerin tıbbi olarak özellikle kanser tedavisinde
kullanılması bitkinin önemini daha çok artırmaktadır. Kum zambağı; Trakya bölgesi,
İstanbul, Bolu, Bartın, Sinop, Samsun, Giresun, Trabzon, Antalya, Mersin ve
Adana’nın kumul sahillerinde doğal olarak bulunmaktadır.Doğal yaşam alanları olan
kumul sahillerin büyük bölümünün plaj olarak kullanılması, aşırı miktarda ve plansız
turizme yönelik otellerin inşa edilmesi ve sahillerin kapatılması, bitkinin çiçeklerinin
insanlar tarafından çiğnenmesi, koklamak ve evleri süslemek için koparılması ve
soğanlarının toplanması bitkinin doğal yaşam alanındaki varlığını tehlikeye
sokmaktadır.

Bu çalışmada Kırklareli’ne bağlı İğneada Longoz Ormanları Milli Parkı ve Tekirdağ
iline bağlı Çamlıkoy Tabiat Parkında yer alan 2 doğal kum zambağı populasyonunun
genetik yapısı 8 RAPD primeri kullanılarak belirlenmiştir. Çalışılan 8 primerin tamamı
polimorfik olarak saptanmıştır. Analiz edilen iki populasyonda sekiz primer için 70
lokus bulunmuştur. Bütün populasyonlar ele alındığında toplam polimorfik lokus
sayısı 67, oranı ise %95.71 olarak görülmüştür. Genetik çeşitlilik parametrelerinden;
lokus başına düşen ortalama allel sayısı 1.843, etkili allel sayısı 1.440, Shannon
sabiti 0.411 olarak hesaplanmıştır. Analiz edilen populasyonlara ait genetik
farklılaşma katsayısı ise (Gst) 0.0486 olarak hesaplanmıştır. Buna göre,
populasyonların sahip olduğu genetik çeşitliliğin büyük bir kısmının (%95.14)
populasyon içinde olduğu anlaşılmaktadır.

Elde edilen veriler kum zambağı ve yakın akraba türleri ile ilgili yapılacak olan çeşitli
genetik çalışmalara ve gen kaynaklarını koruma stratejilerinin belirlenmesine yönelik
çalışmalara önemli katkılar sağlayacaktır.

Anahtar Kelimeler: Genetik karakterizasyon, Pancratium maritimum L., polimorfik
lokus, RAPD, soğanlı bitki

vi
ABSTRACT

Bulbous plants have important role in Turkey’s biodiversity due to their great potential
use in various industries. Sand daffodil (Pancratium maritimum L.), being one of the
Turkey’s biological richness and important bulbous plant of our country, grows on
coastal sands. In addition to being decorative plant, sand daffodil (P. maritimum L.)
has increased importance due to having alkaloids and flavonoids that are used in
medicine especially in cancer treatment. Sand daffodil grows naturally in sandy
beaches of Thrace region, İstanbul, Bolu, Bartın, Sinop, Samsun, Giresun, Trabzon,
Antalya, Mersin and Adana. Usage of majority of natural habitats as a beach,
excessive and unplanned building of hotels for tourism and closure of coasts,
collection of flowers for ornamental purposes by humans and collection of bulbs are
some reasons that endanger existence of sand daffodil in their natural habitats.

In this study, the genetic structure of two natural sand daffodil populations from
İğneada Longoz forests National Park (Kırklareli) and Çamlıkoy National Park
(Tekirdağ) was determined by 8 RAPD primers. Eight primers were analyzed, and all,
were polymorphic. A total of 70 loci were found in the analyzed two populations by
eight primers. For all populations total polymorphic locus number is 67 and the mean
proportion of polymorphic loci was 95.71%. Genetic diversity parameters; mean
number of alleles for each loci was 1.843, effective allele number was 1.440,
Shannon’s information index was 0.411. The genetic differentiation coefficient (Gst) is
estimated as 0.0486. According to Gst results, high proportion of genetic diversity
(95.14%) was within populations.

The data obtained from this project is valuable to provide important contributions to
the national and international studies with sand daffodil and other related species,
and the determination of genetic resources conservation strategies.

Keywords: Genetic characterization, Pancratium maritimum L., polymorphic locus,
RAPD, bulbous plant

vii
1.GİRİŞ

Türkiye jeolojik çeşitlilik, değişik iklim ve toprak tiplerine sahip olma, büyük
yükselti farklılıkları gibi nedenlerden dolayı çeşitli yaşam alanlarına sahiptir. Ayrıca
Asya ve Avrupa kıtaları arsında bir geçit oluşturması ve 3 ayrı bitki coğrafyası
bölgesinin geçiş alanında bulunması sonucu zengin floristik yapıya sahiptir (Özhatay
vd 2003). Fakat bu eşsiz ve zengin floristik yapıya rağmen bazen yasal boşlukların
etkisiyle doğal bitkilerimiz ciddi anlamda korunamamaktadır. Amerika ve Avrupa
Birliği ülkeleri başta olmak üzere birçok ülkede bitkilerin korunmasına yönelik
çalışmalar büyük önem kazanmaktadır (Godt vd 1995; Rossetto vd 1995).

Türkiye biyoçeşitliliğinde önemli bir yere sahip olan soğanlı bitkiler hem süs
bitkisi olarak hem de parfümeri ve ilaç gibi çeşitli sanayi alanlarında büyük bir
kullanım potansiyeline sahiptir. Kullanım alanlarının artmasıyla bu bitkilere olan
ihtiyaç da artmıştır. Soğanlı bitkiler Türkiye’nin hemen hemen tüm bölgelerinde doğal
yayılış göstermektedir. Soğanlı bitkilerin doğal populasyonları kaçak sökümler,
kentleşme, yol yapımı, endüstriyel ve turizme yönelik çalışmaların artması gibi çeşitli
nedenlerin etkisi ile önemli ölçüde olumsuz etkilenmekte ve sonuç olarak bu bitkilerin
büyük çoğunluğu nesli tükenme tehlikesi ile karşı karşıya kalmaktadır. Türkiye
kıyılarında kumul alanlarda yayılış gösteren ve tıbbi amaçlı kullanım potansiyeli
bulunan kum zambağı (Pancratium maritimum); biyolojik çeşitlilik bakımından
ülkemizin önemli soğanlı bitkilerindendir ve ayrıca biyoçeşitlilik yönünden genetik
çeşitlilik potansiyelinin belirlenmesi, korunması ve geliştirilmesi gereken bir
türümüzdür.

Kum zambağı, Nergisgiller (Amaryllidaceae) familyasının Pancratium cinsine ait
21 türden biri olan soğanlı bir bitkidir. Kum zambağı tüm Akdeniz ülkelerine ait
sahillerde, Karadeniz bölgesinde, Marmara bölgesinin Karadeniz kıyılarında ve
Bulgaristan’ın güneyinde deniz kıyısının kumul alanlarında yayılış göstermektedir.
Türkiye için önemli bir gen kaynağı olan kum zambağının gelecekte milli ekonomiye
büyük oranda katkı sağlamasından dolayı doğal yetişme alanlarında korunması ve
çoğalması sağlanmalıdır. Kum zambağı nesli tehlike altında bulunan bir türdür. Kum
zambağının, doğal yaşam alanı olan kumul sahillerinin plaj olarak kullanılması,
plansız bir şekilde turizme yönelik sahillerin kapatılması, bitki soğanlarının
toplanması nedeni ile doğal yaşam alanında gelişmesi tehlike altındadır.
‘Sürdürülebilir Kalkınma’ stratejisi, doğal kaynakların kullanılmasını yasaklamak
yerine bu kaynaklara zarar vermeden uzun yıllar kullanma yollarının araştırılmasını
hedeflemektedir. Hem ekonomik hem de çeşitlilik açısından büyük öneme sahip olan
kum zambağında gen kaynaklarını koruma ve uygun üretim çalışmalarının
yapılabilmesi için moleküler genetik çalışmaların yapılması gerekmektedir. Biyolojik
çeşitliliğin önemli bileşenlerinden biri olan genetik çeşitliliğin belirlenmesi,
ekosistemin sağlıklı olabilmesi ve sürdürülebilirliği için önemlidir. Bu bitkinin doğal
populasyonlarının azalmasının önüne geçebilmek için hem geleneksel hem de
biyoteknolojik yöntemlerle koruma ve üretim çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç
duyulmakta ve yapılan çalışmaların moleküler çalışmalarla desteklenmesi
gerekmektedir. Genetik çeşitliliğin ortaya çıkarılmasının bir yolu moleküler belirteçler
kullanılarak çalışılan türlere ait genetik yapının belirlenmesidir.

Farklı ülkelerde farklı araştırmacılar tarafından izoenzim (Sanaa vd 2010),
RAPD (Zahreddine vd 2004; El-Hadidy vd 2012), AFLP (Grassi vd 2005), plastid
DNA belirteçleri (De Castro vd 2012) gibi belirteçler kullanılarak kum zambağında
1