Molekularepidemiologische Analysen von Gelbfiebervirusisolaten und Entwicklung neuer ...

199 Pages·2014·8.37 MB·German

Molekularepidemiologische Analysen
von Gelbfiebervirusisolaten und
Entwicklung neuer Nachweismethoden
zur Untersuchung und Diagnostik von Gelbfieberviren

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades des
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

eingereicht im Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie
der Freien Universität Berlin

vorgelegt von
Nina Katharina Stock
aus Duisburg

September 2013

Die vorliegende Arbeit wurde von Januar 2008 bis September 2013 in der Arbeitsgruppe von
Herrn Prof. Dr. Matthias Niedrig am Robert Koch-Institut in Berlin angefertigt.

1. Gutachter: Prof. Dr. Matthias Niedrig, Robert Koch-Institut Berlin
2. Gutachter: Prof. Dr. Rupert Mutzel, Freie Universität Berlin

Disputation am: 28.04.2014

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung
der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe. Diese Arbeit wurde weder in der
jetzigen noch in einer abgewandelten Form einem anderen Prüfungskomitee vorgelegt.

(Ort, Datum) (Nina Katharina Stock)

INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung
1.1. Gelbfieber ................................................................................................................. 1
1.1.1. Historischer Überblick ....................................................................................... 1
1.1.2. Klinik ................................................................................................................. 3
1.1.3. Pathogenese ..................................................................................................... 5
1.1.4. Diagnostik und Therapie ................................................................................... 6
1.2. Das Gelbfiebervirus ................................................................................................. 7
1.2.1. Taxonomie ........................................................................................................ 7
1.2.2. Partikelaufbau ................................................................................................... 8
1.2.2.1. Genomorganisation .................................................................................. 8
1.2.2.2. Virusproteine .......................................................................................... 10
1.2.3. Replikation und Morphogenese ....................................................................... 15
1.3. Der Gelbfieberimpfstoff 17D ................................................................................. 18
1.3.1. Entstehung und Attenuierung .......................................................................... 18
1.3.2. Impfstoffsicherheit und Nebenwirkungen ......................................................... 19
1.3.3. Impfstoffherstellung ......................................................................................... 20
1.4. Ökologie ................................................................................................................. 22
1.4.1. Transmission................................................................................................... 22
1.4.2. Epidemiologie ................................................................................................. 23
1.4.3. Aktuelle Situation ............................................................................................ 25

2. Problemstellung
2.1. Epidemiologische Untersuchungen von GFV-Isolaten ....................................... 27
2.1.1. Phylogenie von 17D-Impfstoffen ..................................................................... 27
2.1.2. Charakterisierung phylogenetischer und biologischer Eigenschaften
westafrikanischer GFV-Linien ........................................................................... 27
2.2. Entwicklung neuer Nachweismethoden zur Untersuchung und Diagnostik von
Gelbfieberviren ...................................................................................................... 28

3. Material
3.1. Chemikalien ........................................................................................................... 29
3.2. Geräte ..................................................................................................................... 30
3.3. Kits .......................................................................................................................... 32
3.4. Enzyme und Inhibitoren ........................................................................................ 33
3.4.1. Restriktionsendonukleasen ............................................................................. 33
I
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.2. Weitere Enzyme .............................................................................................. 33
3.4.3. Inhibitoren ....................................................................................................... 33
3.5. Nukleinsäure- und Protein-Standards .................................................................. 33
3.6. Oligonukleotide ...................................................................................................... 34
3.6.1. Oligonukleotide für die PCR und Sequenzierung ............................................ 34
3.6.2. Oligonukleotide für die RT-PCR ...................................................................... 36
3.6.3. Oligonukleotide zur Insertion des TC-Tags in das GFV-Genom ...................... 36
3.7. Vektoren ................................................................................................................. 38
3.7.1. Vektor pACNR-FLYF-17D (GFV-Volllängeklon) .............................................. 38
3.7.2. pDrive Cloning Vector (Qiagen) ...................................................................... 38
3.7.3. Klonierungsvektoren pMK-RQ/pMA (Geneart) ................................................ 39
3.8. Antikörper und Peptide ......................................................................................... 40
3.9. Bakterienstämme ................................................................................................... 40
3.10. Medien und Zusätze für die Bakterienkultur ...................................................... 41
3.11. Eukaryotische Zelllinien ...................................................................................... 41
3.12. Medien und Zusätze für die Zellkultur ................................................................ 41
3.13. Viren ..................................................................................................................... 42
3.13.1. Gelbfieberviren .............................................................................................. 42
3.13.2. Weitere inaktivierte Viren .............................................................................. 43
3.14. Sequenzen ............................................................................................................ 43
3.15. Puffer und Lösungen ........................................................................................... 44
3.16. Software ............................................................................................................... 45
3.16.1. Lizenzierte Software ...................................................................................... 45
3.16.2. Frei verfügbare Onlinesoftware ..................................................................... 46
3.17. Verbrauchsmaterialien und Sonstiges ............................................................... 46

4. Methoden
4.1. Molekularbiologische Methoden........................................................................... 48
4.1.1. Reverse Transkription ..................................................................................... 48
4.1.2. Polymerase Kettenreaktion (PCR)-basierte Techniken ................................... 48
4.1.2.1. Standard-PCR ........................................................................................ 49
4.1.2.2. Kolonie-PCR .......................................................................................... 49
4.1.2.3. Real-time PCR (RT-PCR) ....................................................................... 49
4.1.3. Agarosegelelektrophorese .............................................................................. 51
4.1.4. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ....................................... 51
4.1.5. Reinigung von DNA-Fragmenten aus enzymhaltigen Ansätzen ...................... 51
4.1.6. DNA-Sequenzierung nach Sanger .................................................................. 52
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.7. Restriktionsverdau von DNA ........................................................................... 52
4.1.8. Ligation von DNA-Fragmenten mittels T4-Ligase ............................................ 53
4.1.9. Klonierung von PCR-Produkten in den pDrive Cloning Vector ........................ 54
4.1.10. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ................... 54
4.1.11. In vitro Transkription viraler RNA ................................................................... 54
4.1.12. Herstellung fluoreszenzmarkierter Gelbfieberviren ........................................ 55
4.1.12.1. Die FlAsH-Technologie ......................................................................... 55
4.1.12.2. Rekombinante PCR .............................................................................. 57
4.1.12.2.1. Erste PCR-Reaktion: Einfügen des TC-Tags in das GFV-Genom 58
4.1.12.2.2. Zweite PCR-Reaktion: Hybridisierungs- und Auffüllreaktion ......... 59
4.1.12.3. Homologe Rekombination .................................................................... 59
4.1.12.4. Seitengerichtete Mutagenese ............................................................... 62
4.2. Biochemische Methoden ....................................................................................... 64
4.2.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ...................................... 64
4.2.2. Transfer von Proteinen auf Membranen (Western Blot) .................................. 65
4.2.3. Extraktion zellulärer Proteine .......................................................................... 66
4.3. Immunologische Methoden ................................................................................... 66
4.3.1. Immunisierung von Kaninchen zur Gewinnung polyklonaler Antiseren ............ 66
4.3.2. Immunofärbung von Proteinen auf NC-/PVDF-Membranen ............................. 67
4.3.3. Indirekter Immunfluoreszenztest (IIFT) zum Nachweis viraler Proteine ........... 68
4.3.4. IIFT zum Nachweis GFV-spezifischer Antikörper ............................................ 68
4.3.5. IIFT zum Nachweis spezifischer Flavivirus-Antikörper ..................................... 69
4.3.6. Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRNT) ............................................... 69
4.3.7. Sandwich-ELISA ............................................................................................. 71
4.3.8. Kompetitiver ELISA ......................................................................................... 72
4.4. Zellbiologische Methoden ..................................................................................... 73
4.4.1. Passagieren eukaryotischer Zellen ................................................................. 73
4.4.2. Einfrieren eukaryotischer Zellen ...................................................................... 74
4.4.3. Auftauen eukaryotischer Zellen ....................................................................... 74
4.4.4. Zellzahlbestimmung eukaryotischer Zellen ...................................................... 74
4.4.5. Transfektion mittels Lipofectamin™ 2000 ........................................................ 75
4.5. Virologische Methoden ......................................................................................... 76
4.5.1. RNA-Isolierung aus zellfreien Lösungen ......................................................... 76
4.5.2. RNA-Isolierung aus Zellen .............................................................................. 76
4.5.3. Herstellung hochtitriger Viruslösungen ............................................................ 76
4.5.4. Virustitration mittels Plaquetest ....................................................................... 77
4.5.5. Wachstumskinetiken zur Untersuchung afrikanischer GFV-Wildtypisolate ...... 78
III
INHALTSVERZEICHNIS
4.5.6. Wachstumskinetik zur Untersuchung der Proteinexpression während einer
GFV-Infektion ................................................................................................... 80
4.6. Mikrobiologische Methoden .................................................................................. 80
4.6.1. Anzucht von E.coli-Bakterien .......................................................................... 80
4.6.2. Herstellung von Glyzerin-Dauerkulturen .......................................................... 80
4.6.3. Plasmid-DNA-Isolierung in kleinem Maßstab (Minipräparation) ....................... 81
4.6.4. Plasmid-DNA-Isolierung in großem Maßstab (Maxipräparation) ...................... 81
4.6.5. Herstellung kompetenter Bakterien mittels Calciumchlorid .............................. 81
4.6.6. Transformation Calciumchlorid-kompetenter Bakterien ................................... 81
4.6.7. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Bakterienkulturen ................ 82
4.7. Phylogenetische Methoden ................................................................................... 82
4.7.1. Alignment ........................................................................................................ 82
4.7.2. Modelltest ....................................................................................................... 83
4.7.3. Phylogenetische Stammbaumanalyse ............................................................ 83
4.7.3.1. Maximum Likelihood-Methode ................................................................ 83
4.7.3.2. Bayesische Methode .............................................................................. 83
4.7.4. Stammbaumvisualisierung .............................................................................. 84

5. Ergebnisse
5.1. Epidemiologische Untersuchungen von GFV-Isolaten ....................................... 85
5.1.1. Phylogenie von GFV-17D-Impfstoffen ............................................................. 85
5.1.1.1. Sequenzanalysen ................................................................................... 85
5.1.1.2. Phylogenie ............................................................................................. 89
5.1.2. Phylogenetische und biologische Charakterisierung westafrikanischer
Gelbfiebervirusisolate ....................................................................................... 90
5.1.2.1. Sequenzanalysen ................................................................................... 91
5.1.2.2. Phylogenie von GFV-Wildtypstämmen ................................................... 98
5.1.2.3. Wachstumsanalysen westafrikanischer GFV-Isolate ............................ 100
5.2. Entwicklung neuer Nachweismethoden zur Untersuchung und Diagnostik von
Gelbfieberviren .................................................................................................... 108
5.2.1. Herstellung von Peptidantikörpern zum Nachweis von GFV-Proteinen ......... 108
5.2.1.1. Identifikation geeigneter Peptide zur Immunisierung
von Kaninchen ........................................................................................ 108
5.2.1.2. Herstellung und Charakterisierung polyklonaler Peptidantikörper ......... 109
5.2.1.2.1. Western Blot ................................................................................ 109
5.2.1.2.2. Indirekter Immunfluoreszenztest .................................................. 114
5.2.1.2.3. Serokonversion im Verlauf der Immunisierung............................. 116
IV