Table Of Content昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&&’，(（) *）：*)+,*-& .//0&(’(1+%-+
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基于 的六种果实蝇的分子鉴定
!"#$% &’"(
（双翅目：实蝇科）
朱振华4，%，叶 辉4!，张智英4
（4? 云南大学生命科学学院，昆明 +’&&-4；%? 云南省农业科学院粮作所，昆明 +’&%&’）
摘要：本研究首次对果实蝇属的桔小实蝇 -$"#.’"/.$0’.1$)+1、瓜实蝇 -J "2"2.3+#$/、南瓜实蝇 -J #$2、番石榴实蝇 -J "’../"#$、具
条实蝇 -J 1"2#/))$#$、黑漆实蝇 -J 1"2#/))$.+1等+种实蝇8CM0B2ICN基因进行了测序。对这+种实蝇5%个个体8CM0B 2ICN基
因中段(%& NG的碱基序列进行分析，得到*)种单倍型，发现了44+个变异位点，其中*&个位点较为稳定。对这+种实蝇与其
各自鉴别位点的对应关系研究表明，8CM0B2ICN基因可以作为这+种实蝇种类鉴别的分子标记。
关键词：双翅目；实蝇科；果实蝇属；线粒体M0B；细胞色素N基因；分子鉴定
中图分类号：O-+- 文献标识码：B 文章编号：&(’(1+%-（+ %&&’）&*1&*)+1&’
)*+,-.+/0 12,3"141-/"1*3 *4 516 !"#$%&#’%" 57,-1,5（#17",0/：8,7901"12/,）(/5,2 *3
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PQR P=$#1Q"94，%，S7 Q":4!，PQB0T P=:1S:#U（4 4? 2A;;$U$ AE V:E$ /@:$#@$F，S"##9# R#:L$DF:CI，W"#8:#U +’&&-4，
2=:#9；%? .#FC:C"C$ AE 2DAGF，S"##9# B@9H$8I AE BUD:@";C"D9; /@:$#@$F，W"#8:#U +’&%&’，2=:#9）
%(5"0/-"：X=$8CM0B2ICNU$#$FAE+ ED":C E;IFG$@:$F，:#@;"H:#U -$"#.’"/.$0’.1$)+1，-J "2"2.3+#$/，-J "’../"#$，-J
#$2，-J 1"2#/))$#$ 9#H -J 1"2#/))$.+1，Y$D$ F$Z"$#@$HJ 39F$H A# C=$ 9#9;IF:F AE 8CM0B 2ICN (%& NG F$Z"$#@$F EDA8
5% :#H:L:H"9;F AE C=$ + FG$@:$F，Y$ :H$#C:E:$H *) =9G;ACIG$F 9#H H$C$@C$H 44+ L9D:9N;$ F:C$F，AE Y=:@= *& L9D:9N;$ F:C$F
Y$D$ =:U=;I @A#F$DL$HJ X=$ FC"H:$F AE C=$ D$;9C:A#F=:G N$CY$$# C=$ + ED":C E;:$F 9#H C=$:D D$FG$@C:L$ :H$#C:E:@9C:A# F:C$F
F"UU$FC$H C=9C 8CM0B @ICN F$Z"$#@$F @A";H N$ "F$H 9F C=$ 8A;$@";9D 89D[$D :# :H$#C:E:@9C:A# AE C=$ + ED":C E;I FG$@:$FJ
:,’ ;*025：M:GC$D9；X$G=D:C:H9$；-$"#.’"/.$；8CM0B；@ICA@=DA8$ N U$#$；8A;$@";9D :H$#C:E:@9C:A#
果实蝇属 -$"#.’"/.$ 昆虫隶属双翅目（M:GC$D9） 蝇 -J "2"2.3+#$/、南瓜实蝇 -J #$2、番石榴实蝇 -J
实蝇科（X$G=D:C:H9$），俗称实蝇（ED":C E;I），多为农业 "’../"#$、具条实蝇 -J 1"2#/))$#$ 和黑漆实蝇 -J
害虫，可危害%’&余种水果和蔬菜，目前主要分布于 1"2#/))$.+1 等，是该地区进口瓜果蔬菜中常见的害虫
非洲、亚洲的部分地区、澳大利亚及南太平洋的热带 种类，如何防止该类昆虫随同进境瓜果传入国内是
地区（汪兴鉴，4--’；梁广勤等，4--+）。实蝇类昆虫 当地检验检疫部门的一项重要工作（蒋小龙，%&&%）。
对寄主瓜果的危害主要表现为：成虫产卵于寄主瓜 迄今为止，对实蝇类昆虫的鉴别主要依据其成虫外
果内，在瓜果表面形成产卵孔；幼虫蛀食瓜果果肉， 部形态特征，但从受害瓜果中截获到的实蝇多数是
导致受害瓜果变质腐烂（S$，%&&4；施伟和叶辉， 卵和幼虫，而多数果实蝇的卵和幼虫在形态学上无
%&&(）。由于实蝇类昆虫寄主范围广、繁殖力强、危 明显差别，难以进行种类鉴定。因此，检疫部门只能
害性大，因而被许多国家列为重要的检疫性害虫 将检疫截获到的果实蝇饲养到成虫后，才可能基于
（/A"C#YAAH 9#H 2A8:#F，4-5+；汪兴鉴，4--’；陈乃中， 其形态鉴别特征确定其种类。显然，这一检疫程序
4--)）。 费时耗力，难以满足进口瓜果快速通关的要求。
云南位于热带和亚热带地区，是我国西南地区 %&&(年以来，我国与东南亚在水果蔬菜上实行零关
重要的边境口岸。桔小实蝇 -$"#.’"/.$ 0’.1$)+1、瓜实 税贸易，进出口农产品猛增，尽快探讨一套快速、准
基金项目：国家重点基础研究发展规划项目（%&&*23(4’4&&）；国家自然科学基金项目（*&%+&&%*）；云南省自然科学基金项目（%&&*2&&&56）
作者介绍：朱振华，男，4-5&年生，硕士，从事昆虫分子生态方面的研究，7189:;：<=<==)+>4%+?@A8
!通讯作者B"C=ADEAD@ADD$FGA#H$#@$，7189:;：I$=":>I#"J$H"J@#
收稿日期 K$@$:L$H：%&&(14414%；接受日期 B@@$GC$H：%&&’1&(14’
B期 朱振华等：基于9:#$%E4:@的六种果实蝇的分子鉴定 B!H
确、有效的实蝇鉴定技术已势在必行。 的系统进化和分类鉴定研究（J’(9771 012 I(*G7’(，
采用分子生物学技术开展昆虫种类鉴定，可以 -..5；K,’LL0(2 !" #$8，-..A；#0672 !" #$8，-..!；任竹
解决不能通过果实蝇卵、幼虫形态特征进行种类鉴 梅等，<""B）。
定的问题。上世纪 !" 年代以来，同工酶、染色体核 本研究以桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴
型以及#$%探针等分子生物技术已经被用于多种 实蝇、具条实蝇和黑漆实蝇等 A 种实蝇作为研究对
昆虫的鉴定研究（&’()*+,’(，-.!"；#(’/ 012 30(24， 象，通过对这A种实蝇 9:#$% E4:@基因序列的测定
-.!-；梁广勤等，-..5；#0672 !" #$8，-..5）。动物 和对比分析，探讨利用 E4:@基因序列开展实蝇昆虫
9:#$%属母系遗传，为双链闭环结构，基因序列组成 分子鉴定的可行性，为下一步构建各种实蝇昆虫的
相对保守，无重组和单拷贝，并易于检测。昆虫 快速分子鉴定和检测技术积累基础资料。
9:#$%平均进化速率是单拷贝核 #$% 的 -;< 倍，
长度为-=>5 ?@到-A>B ?@左右，包括-<;-B个编码 ! 材料和方法
蛋白质的基因。由于其结构和进化上的特点，
9:#$%多被作为研究物种进化的重要分子标记 !"! 供试样品
（C7D7)01 !" #$8，-..-；张亚平和施立明，-..<；施伟和 本研究采用的桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番
叶辉，<""5）。在9:#$%各基因中，E4:@基因的结构 石榴实蝇、具条实蝇和黑漆实蝇均为成虫干标本，其
和功能研究得比较清楚（F*(7:G !" #$8，-.!H；I(04， 采集地点、时间及数量等如表-所示。
-.!.），因其碱基序列稳定性较高而常用于动物类群
表!供试实蝇种类、数量、及采集的时间和地点
#$%&’! ()’*+’,，-./%’0,$-1&2*$&+3+’,2435’3’,3’1+-,’*3,
种类 代号 采集地点 样品数量 采集日期
KL’+7’M E*2’ N*+0)7:7’M $O9@’(*PM09L)’M E*))’+:7*120:’
河口3’?*O = <""B>=
桔小实蝇 %8 &’()#$*) J
昆明 QO1971D = <""B>H
番石榴实蝇 %8 +’((!+"# R 河口3’?*O -" <""B>=
具条实蝇 %8 )+,"!$$#"# S 河口3’?*O . <""B>=
河口3’?*O = <""B>=
黑漆实蝇 %8 )+,"!$$#(*) 3
昆明 QO1971D = <""B>H
南瓜实蝇 %8 "#, $ 河口3’?*O -" <""B>=
瓜实蝇 %8 +,+,(-*"#! I 西双版纳 T7M,O01D@0110 = <""B>=
瑞丽 UO7)7 A <""B>A
河口3’?*O H <""B>=
元江 VO01W701D = <""B>=
!"6 总789提取 ^EU反应的总体积为 =" N，其中含有 = N -"
! !
供试实蝇经 SX（-" 99*)YN S(7M，- 99*)YN _&OPP’(，5 N FD<‘（<= 99*)YN），->= N 2$S^，引物
! !
X#S%，L3.>"）缓冲液浸泡<5;5! ,，用无菌水清洗， （-" L9*)YN）各 5 N，">5 N S0a #$% 聚合酶（= bY
! !
单头分别放入 ->= 9N 的 XLL’12*(P 管中，用匀浆器 N），< N 模板 #$%。扩增条件为 .5[预变性 <
! !
将其磨碎，然后参照关秀杰等（<""5）采用的酚Y氯仿 971，接着进行B=个热循环：.5[变性 - 971，55[退
法，逐一提取各实蝇个体总 #$%，将各实蝇个体总 火- 971，H<[延伸->= 971，最后在 H<[充分延伸 =
#$%样品置于Z<"[冰箱中保存、备用。 971，同时，以 223 c代替模板#$%作空白对照。扩
<
!": ;<=扩增及序列测定 增产物的大小、纯度和亮度用 -><d的琼脂糖凝胶
扩增的目的片段为 9:#$% E4:@ 基因中段长度 电泳检测。^EU粗产物的纯化及测序委托上海申友
为5BB @L的一段序列。用于扩增 E4:@ 基因片段的 生物技术有限公司完成。测序反应均在 %&e-""]BHH
引物是 E&-和 E&（< K79*1，-..5），其序列分别为： 测序仪上进行。
E&-：=\]S%SIS%ES%EE%SI%II%E%%%S%SE]B\； !"> 789序列数据处理
E&<：=\]%SS%E%EESEES%%SSS%SS%II%%S]B\。 引 用#$%M:0( 软件中的 X27:M’a 程序进行序列编
物由上海申友生物技术有限公司合成。 辑，用#$%K:0(软件中的 F’D%)7D1程序进行 #$%同
GMM 昆虫学报 .+"#/0"’1’$’2*+#3*0*+# LM卷
源序列排列，并人工核对校正。通过 !"#$ %&’()*+ 区序列。本研究得到的这 5 种实蝇的 18<=$ 6789
,-.（/012’ !" #$3，,44.）软件统计确定 5 种实蝇在 基因序列已在#&+D2+F中注册，其登录序列号见后。
6789基因部分序列间的碱基替换数，基于 /)10’2:,: !"# $种实蝇种间关系遗传分析
;2’21&8&’双参数模型分析，并计算出各实蝇种间遗 表, 展示了5 种实蝇之间的平均遗传距离、碱
传距离。采用 <=$>82’ 软件中的 !&?$@)?+ 程序，基 基替换数及种内个体间序列差异。5种实蝇在所测
于 6AB>C$A程序，对同种实蝇不同个体之间的 6789 6789基因碱基序列上存在差异，其碱基替换数为.G
序列遗传差异进行分析。 HGI，遗传距离在 4-4JK,LH4-.K.GG 之间。同种实
蝇不同个体之间，<=$ 碱基序列差异较小，且相当
! 结果 稳定，遗传距离为4H4-4.K（表,）。上述表明，基于
18<=$ 6789基因的碱基序列，可以将这 5 种实蝇区
经电泳检测表明，用引物 6D.、6D,扩增得到的 别开来，即 6789基因序列可以作为这 5实蝇分子鉴
;6E产物中没有外源 <=$ 污染或外源 <=$ 核拷 别的依据。
贝，测序结果标明所获得的基因序列为 18<=$ 6789
表! $种实蝇%&’(基因序列的碱基替换数（对角上）和遗传距离（对角下）及种内序列差异（对角线）
)*(+,! -./(,0123.(3’4’.’415（*(16,74*815*+）*578,5,’49743’*59,（(,+1:74*815*+）(,’:,,5$ !"#$%&#’%"
3;,94,3，*573,<.,59,7422,0,59,（*+15874*815*+）:4’=45,*9= !"#$%&#’%" 3;,94,3
桔小实蝇 瓜实蝇 南瓜实蝇 番石榴实蝇 具条实蝇 黑漆实蝇
%3 &’()#$*) %3 +,+,(-*"#! %3 "#, %3 +’((!+"# %3 )+,"!$$#"# %3 )+,"!$$#(*)
%3 &’()#$*) 4H4-4.K GI GI ,5 GI G,
%3 +,+,(-*"#! 4-.K.GG 4H4-44I .G GI ,K ,L
%3 "#, 4-.M.G. 4-4JK,L 4H4-4., GJ ,I ,G
%3 +’((!+"# 4-.,,KL 4-.K4.G 4-.I.GM 4H4-4.I GL GG
%3 )+,"!$$#"# 4-.IGMG 4-.L5L. 4-.,GMI 4-.5,L4 4H4-4.K .5
%3 )+,"!$$#(*) 4-.JG4J 4-..IJL 4-.4K55 4-.5G.G 4-45K4, 4H4-4.I
!"! 基因位点分析 实蝇和南瓜实蝇。位点 K4 是唯一能区分黑漆实蝇
用<=$>82’ 软件对 5 种实蝇 I, 个个体的 6789 与其他实蝇的鉴别位点。
基因序列加以排序比较，最终从 LGG 9N基因序列中
获得各实蝇个体较为完整 L,4 9N 的序列片段。对 > 讨论
该序列片段分析发现了 ..5 个变异位点，检测到 GM
个单倍型。这 GM 个单倍型序列已在 #&+D2+F 中注 随着现代分子生物技术的发展，利用特定 <=$
册，注 册 序 号 分 别 为 $OKJGLMM H $OKJGJ45， 片段对生物进行种类鉴定，已经成为再次或深入认
$OK.,.MG H $OK.,.MM，$OKJ5JM, H $OKJ5JK4 和 识生物种分类地位及种间亲缘关系的一个重要手
$OKJ5JK,H$OKJ5JKJ。这..5个变异位点无任何碱 段。基因片段或信息位点是区分生物种类的辅助工
基的插入和缺失，其中G4个位点非常稳定，可以作 具之一，已逐步应用于动植物种类鉴定中。李正西
为信息鉴别位点。经综合对比分析表明，这G4个信 和沈佐锐（,44,）利用 ’<=$:PC>,序列探讨了赤眼蜂
息鉴别位点可以将这5种实蝇逐一区分出来。如在 属不同种分子鉴定的可行性。Q0(R)1) 等（.KK5）对
表G中，位点MI、,,J、G45、GL, 和 L4, 能将桔小实蝇 人参属G种药用植物人参、西洋参和竹节参的 .M>
与其他J种实蝇区分开来；位点 LJ、.,4、.L.、.5,和 ’<=$基因片段进行了测序分析，发现其中L个基因
.MJ能将瓜实蝇与其他实蝇区分开；位点.KM和,.G 位点可用于人参及相关药材鉴定。=?2+等（.KKK）利
可将南瓜实蝇从其他 J 种实蝇中区分辨出来；位点 用核糖体 PC>.:J-M>:PC>,的<=$序列对人参属5种
5K、I4、,,M、,5.、,M,、G.G、G.K、GJI和GM,可把番石榴 药用植物以及,种常见的人参伪品紫茉莉和商陆进
实蝇与其他实蝇区分开；位点.4,、.4J、.II和L4M则 行了有效鉴定。SR2*等（,44.）应用’<=$:PC>序列鉴
可把具条实蝇与其他实蝇区分开。位点 ,L 能同时 定了山姜属红豆蔻及其同属相似种。王建云等
区分桔小实蝇和瓜实蝇；位点 G44 和 GIJ 能同时区 （.KK5）通过对鸡内金和鸭内金的 18<=$ 6789 基因
分桔小实蝇和番石榴实蝇；位点 G., 能同时区分瓜 约.LG 9N片段的分析发现，该片段的G5个碱基对可
:期 朱振华等：基于<%;=19>%?的六种果实蝇的分子鉴定 :74
表! "种实蝇#$%&基因部分序列的信息鉴别位点
’(&)*! +,*-%./.0(%.1-2.%*21/3.%1041-,5.()0$%&6(5%.()2*78*-0*.-" !"#$%&#’%" 26*0.*2
鉴别位点 桔小实蝇 瓜实蝇 南瓜实蝇 番石榴实蝇 具条实蝇 黑漆实蝇
!"#$%&’&()%&*$+&%#+ !, "#$%&’(% !, )*)*$+(,&- !, ,&* !, )#$$-),& !, %)*,-’’&,& !, %)*,-’’&$(%
-. / 0 1 1 1 1
.2 1 / 1 1 1 1
34 1 / / 0 / 1
56 1 1 1 0 1 1
75 0 1 1 1 1 1
46 1 1 1 1 1 0
86- 9 9 9 9 / 9
862 / / / / 1 /
8-6 1 9 / 1 / /
8.8 9 / 9 9 9 9
83- / 9 / / / /
855 9 / / / 1 9
847 9 1 0 9 1 1
-8: / / 1 / / /
--2 9 / / / / /
--7 1 1 1 / 1 1
-38 9 9 9 / 9 9
-7- / / / 9 / /
-72 / 9 / / / /
:66 / 1 1 9 1 1
:63 9 / / / / /
:8- 1 9 / 1 1 1
:8: 9 9 9 / 9 9
:84 9 9 9 / 9 9
:.- / 9 9 9 9 9
:25 1 1 1 9 1 1
:52 9 1 1 / 1 1
:7- / / / 9 / /
.6- 9 / / / / /
.67 1 9 9 1 / 9
;以作为区分鸡内金和鸭内金的分子标记。目前， @9ABACD@鉴定实蝇技术提供了必要的基础数据，而
将基因位点作为信息位点进行物种鉴定，在植物上 这将是我们下一步研究工作的重点。应用特定
用得较多而在动物上用得较少，利用 <%;=1 9>%?基 ;=1序列鉴定桔小实蝇及其近缘种，比传统形态
因序列探讨果实蝇分子鉴定迄今尚无报道。 学、细胞遗传学和生物化学（染色体核型分析、同工
本文通过对桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石 酶电泳技术等）等方法有更多的优点，如：不要求标
榴实蝇、具条实蝇和黑漆实蝇等 3 种实蝇 <%;=1 本完整，不受活体标本的限制，也不会因虫态和组织
9>%?基因序列的对比分析表明，该基因片段的:6个 器官不同而异。;=1 测序是对遗传物质的直接分
基因位点具有较高的稳定性，可以作为上述 3 种实 析，可以排除蛋白质分析等由于基因在表达过程中
蝇分子鉴定的依据。鉴于这 3 种果实蝇的 <%;=1 可能发生的变化而引起的差异。由此，分子生物学鉴
9>%?基因在部分序列上差异较大，可以考虑将其作 定方法可以成为其他昆虫种类鉴定方法的重要补充。
为实蝇分子遗传标记进一步加以研究，如设计特异
性引物、限制性酶切分析，以及在其他果实蝇中进行 致谢 总;=1的提取和 @9A扩增等是在云南省工
同基因片段的对比分析等。本项研究的积极意义在 业微生物发酵工程重点实验室进行的，实验得到云
于利用<%;=1 9>%?基因序列对 3 种实蝇分子鉴定 南大学生物系施伟硕士、沙涛实验师、陈善元博士、
的可行性进行了探讨。更重要的是，本研究为构建 以及张宏瑞博士的帮助，施伟对本文的修改提供了
@9A特异性鉴定引物的设计，并根据变异位点设计 宝贵的意见和建议，谨此致谢。
A+- 昆虫学报 +0(#-,(%.%&%$)0#/),)0# P,卷
PI（I）：II+CIQQ［. 李正西，沈佐锐，B--B. 赤眼蜂分子鉴定技术
参 考 文 献（!"#"$"%&"’）
研究? 昆虫学报，PI（I）：II+CIQQ］
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果实害虫———实蝇科（部分属种）? 植物检疫，*B（I）：B+,］
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（责任编辑：袁德成）
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