Table Of ContentDEPARTAMENTO DE BIOLOXÍA CELULAR E MOLECULAR
MODELOS ANIMALES PARA EL ANÁLISIS DEL
XENOTRASPLANTE Y LA TERAPIA CELULAR
COMO ALTERNATIVAS AL ALOTRASPLANTE DE
ÓRGANOS
Isabel Moscoso Galán
A Coruña, 2007
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
UNIVERSIDAD DE A CORUÑA
MODELOS ANIMALES PARA EL ANÁLISIS DEL XENOTRASPLANTE Y LA
TERAPIA CELULAR COMO ALTERNATIVAS AL ALOTRASPLANTE DE
ÓRGANOS
Memoria para aspirar al grado de
Doctor en Biología
presentada por
Isabel Moscoso Galán
2007
Dª. Nieves Doménech García, Investigadora del Programa de Promoción de la
Investigación del Ministerio de Sanidad y Consumo en el Complejo Hospitalario Juan
Canalejo-Marítimo de Oza de A Coruña,
CERTIFICA:
Que Isabel Moscoso Galán, Licenciada en Biología, ha realizado bajo mi dirección el
trabajo: “Modelos animales para el análisis del Xenotrasplante y la Terapia Celular
como alternativas al alotrasplante de órganos”
Dicho trabajo reúne las condiciones necesarias de originalidad y rigor científico para ser
defendido públicamente y optar al grado de Doctor en Biología.
Dra. Nieves Doménech García
Unidad de Investigación
C.H.U. Juan Canalejo
En A Coruña, 18 de Diciembre de 2006
DEPARTAMENTO DE BIOLOXÍA
CELULAR E MOLECULAR
Campus da Zapateira s/n
15071 A Coruña. España
Teléfono: 981 16 70 00
Fax: 981 16 70 65
El presente trabajo, “Modelos animales para el análisis del xenotrasplante y la terapia
celular como alternativas al alotrasplante de órganos”, presentado por Isabel Moscoso
Galán para aspirar al grado de Doctor en Biología, dirigido por la Dra. Nieves
Domenech García, de la Unidad de Investigación del hospital Juan Canalejo de A
Coruña, ha sido realizado bajo mi tutela.
Revisado el texto, estoy conforme con su presentación para ser juzgado.
Dr. Horacio Naveira Fachal
Profesor Titular de Genética
En A Coruña, 18 de Diciembre de 2006
A mis padres
A Marcos
Agradecimientos:
En primer lugar quiero agradecer a mi directora de tesis, la Dra Nieves Doménech
García el haberme dado la oportunidad de incorporarme al grupo y poder realizar esta
tesis.
Al Dr. Horacio Naviera Fachal por tutelar este trabajo y sobre todo por haber
despertado mi interés en el mundo de la investigación.
A mis compañeros de grupo durante estos años, en especial a los que han colaborado
directamente en este trabajo, Tomás, Isa, Patricia, Tamara, Dolores y por supuesto a
Pury a quien debo agradecer lo mucho que me ha enseñado sobre inmunohistoquímica
y parte de esta tesis.
A los compañeros de otros grupos del labo, a los que han estado durante años y a los
nuevos. A Pilar a la que debo agradecer toda su ayuda y apoyo en todo este tiempo. A
Sonia Pértega por su gran ayuda en la realización de los análisis estadísticos. A los
veterinarios de cirugía experimental por haberme proporcionado las muestras sin las
cuales no podría haber realizado esta tesis.
A mis amigos, en especial a May por compartir 12 años de nuestra vida dentro y fuera
del trabajo, y sobre todo este último año en el que las dos sufrimos nuestras tesis. A
Mónica por ser tan estupenda amiga y compañera de piso, creo que nunca tendré mejor
convivencia con nadie. A las niñas, los niños del grupo, a todos en general, en realidad
me gustaría nombraros a todos pero creo que los agradecimientos serían más largos
que algunas partes de esta tesis. Gracias a todos por los buenísimos momentos que
hemos pasado juntos.
A Marcos, sólo has tenido que vivir la mitad de esta tesis y a pesar de no entender
mucho este mundo, quiero agradecer tu apoyo y hacerme olvidar las complicaciones
que he tenido durante este tiempo sólo con tu compañía.
A mis padres, mi sobrino, mi hermana, mis abuelos y a mi familia en general, que son
los que más han tenido que soportarme, antes y durante el tiempo que he tardado en
hacer esta tesis, por vuestro apoyo en todos los momentos. Muchas gracias.
INDICE
I. INTRODUCCIÓN..................................................................................................1
1. Trasplante.................................................................................................................3
1.1. Definición, historia y situación actual.......................................................3
1.2. Organización del sistema inmune..............................................................5
1.2.1. El complemento y su activación ................................................5
1.2.2. Inmunoglobulinas.......................................................................7
1.2.3. Complejo mayor de histocompatibilidad ...................................9
1.2.4. Células del sistema inmune ........................................................11
1.3. Respuesta inmune en el trasplante ............................................................13
2. Alternativas al trasplante de órganos sólidos...........................................................16
2.1. Xenotrasplante...........................................................................................16
2.1.1. Barrera inmunológica..................................................................18
2.1.1.1. Tipos de rechazo en el xenotrasplante.........................18
2.1.1.2. Estrategias para prevenir el rechazo.............................22
2.1.2. Barrera infecciosa.......................................................................29
2.1.2.1. Posibilidad de xenozoonosis........................................29
2.1.2.2. Retrovirus Endógeno Porcino (PERV)........................31
2.1.3. Barrera fisiológica.......................................................................34
2.2. Terapia celular...........................................................................................36
2.2.1. Tipos de células empleados........................................................36
2.2.2. Terapia celular aplicada a reparación cardiaca...........................40
2.2.2.1. Miocardiopatías............................................................40
2.2.2.2. Regeneración con células exógenas.............................41
2.2.2.3. Regeneración con células endógenas...........................43
2.2.2.4. Experiencia clínica de la aplicación de la Terapia Celular
a la regeneración cardiaca.........................................................44
2.2.2.5. Cuestiones por resolver................................................45
2.2.3. Terapia celular aplicada a otras enfermedades...........................46
2.3. Órganos artificiales....................................................................................49
2.3.1. Corazón artificial........................................................................49
2.3.2. Hígado artificial..........................................................................50
2.3.3. Riñón artificial............................................................................51
2.3.4. Pulmón artificial .........................................................................52
II. OBJETIVOS..........................................................................................................53
III. MATERIALES Y MÉTODOS...........................................................................57
1. Animales de estudio..................................................................................................59
2. Protocolos de tratamientos de inmunosupresión de los babuinos receptores del
xenotrasplante...............................................................................................................59
3. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), plasmas y sueros
......................................................................................................................................60
4. Determinación de xenoAcs en los sueros de los babuinos.......................................60
4.1. Ensayo de cuantificación de Acs anti-αGal por ELISA............................60
4.2. Ensayo de cuantificación de Acs anti-hemolíticos porcinos (APA)..........61
4.3. Determinación de Acs anti-células porcinas por citometría de flujo.........62
XIII
4.4. Determinación de Acs anti-linfocitos o monocitos porcinos por
citometría de flujo a partir de sangre total........................................................63
5. Técnicas celulares.....................................................................................................63
5.1. Líneas celulares.........................................................................................63
5.2. Aislamiento y cultivo de mioblastos o miocitos porcinos.........................64
5.3. Aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales (CMMp) a partir de
médula ósea (MO) porcina...............................................................................65
5.4. Inducción de las CMMp al fenotipo miogénico mediante tratamiento con 5-
azacitidina ........................................................................................................65
5.5. Inmortalización de las CMMp...................................................................65
5.6. Citometría de flujo para la caracterización antigénica de mioblastos,
cardiomiocitos, CMMp y CMMp diferenciadas con 5-azacitidina..................66
6. Técnicas bioquímicas y electroforéticas...................................................................67
6.1. Preparación de los lisados..........................................................................67
6.2. Separación y aislamiento con bolas magnéticas de la población de CMMp
de MO...............................................................................................................68
6.3. Electroforesis, transferencia y revelado.....................................................68
7. Técnicas morfológicas e inmunohistoquímicas........................................................70
7.1. Estudio morfológico e inmunohistoquímico de los tejidos procedentes de los
babuinos receptores del xenotrasplante............................................................70
7.1.1. Congelación de las muestras.......................................................70
7.1.2. Estudio morfológico en los xenoinjertos....................................70
7.1.3. Estudio inmunohistoquímico de los xenoinjertos y otros órganos
...............................................................................................................71
7.1.4. Detección de la expresión de PERV en los xenoinjertos y otros
órganos..................................................................................................71
7.2. Caracterización fenotípica de mioblastos, cardiomiocitos, CMM y CMM
diferenciadas.....................................................................................................72
7.2.1. Inmunohistoquímica indirecta para la detección de expresión de
Actina muscular, Conexina-43, Desmina y Troponina T.....................72
7.2.2. Inmunofluorescencia indirecta para la detección de expresión de
Vimentina con tres fluorocromos..........................................................73
7.3. Tinciones para identificación de adipocitos, condrocitos y osteocitos......73
7.3.1. Tinción Oil-Red-O para adipocitos.............................................74
7.3.2. Tinción con azul alcián para condrocitos....................................74
7.3.3. Tinción con Safranina O para condrocitos..................................74
7.3.4. Tinción con rojo alizarina S para osteocitos...............................74
7.3.5. Tinción de Von Kossa al nitrato de plata para osteocitos...........75
8. Técnicas de biología molecular................................................................................75
8.1. Extracción de ARN del plasma de cerdos y babuinos, y de ADN de las
CMSP de babuinos ..........................................................................................75
8.2. Detección de PERV por RT-PCR o PCR en plasma o CMSP..................76
8.3. Detección de la presencia de secuencias porcinas por PCR en CMSP......77
9. Análisis estadísticos..................................................................................................77
10. Tampones y reactivos.............................................................................................78
IV. RESULTADOS.....................................................................................................83
1. Análisis de la respuesta inmune en el modelo de xenotrasplante cardiaco heterotópico
de cerdo transgénico hDAF en babuinos......................................................................85
XIV
1.1. Grupos de animales estudiados..................................................................85
1.2. Niveles de Acs IgM e IgG anti-αGal y APA en los animales no tratados con
GAS914............................................................................................................87
1.3. Niveles de Acs IgM e IgG anti-αGal y APA en los animales tratados con
GAS914............................................................................................................93
1.4. Diferencias en los niveles de Acs IgM e IgG anti-αGal y APA en los
animales no tratados y tratados con GAS914...................................................99
1.5. Nivel de Acs anti-CMSP de cerdo, L35 y AOC-40 en los animales no
tratados y tratados con GAS914.......................................................................101
1.5.1. Acs inducidos no anti-αGal en los animales tratados con
GAS914.................................................................................................108
1.6. Estudio anatomopatológico e inmunohistoquímico de los xenoinjertos en los
animales no tratados y tratados con GAS914...................................................110
1.6.1. Análisis anatomopatológico........................................................110
1.6.2. Análisis inmunohistoquímico.....................................................112
1.6.3. Activación del endotelio de los xenoinjertos en los animales
tratados con GAS914 en ausencia de Acs
anti-αGal...............................................................................................128
2. Estudio de la posibilidad de infección por PERV en el modelo de xenotrasplante de
xenoinjertos de cerdos transgénicos en babuinos tratados con GAS914......................131
2.1. Grupos de animales estudiados..................................................................131
2.2. Depleción de Acs IgM e IgG anti-αGal antes y después del
trasplante con GAS914.....................................................................................132
2.3. Detección de las secuencias de PERV por RT-PCR en el plasma de los
receptores y donantes de los xenoinjertos porcinos..........................................133
2.4. Estudio de la presencia de Acs anti-PERV en el suero de los
receptores de xenoinjertos porcinos..................................................................136
2.5. Detección de las secuencias de PERV por PCR en CMSP de los receptores
de xenoinjertos porcinos...................................................................................137
2.6. Detección de microquimerismo de células porcinas por PCR e
inmunohistoquímica en las CMSP y tejidos de los babuinos receptores de
xenoinjertos porcinos........................................................................................139
3. Obtención y caracterización de células útiles para su uso en un modelo porcino de
regeneración cardiaca...................................................................................................149
3.1. Obtención y caracterización de mioblastos...............................................149
3.2. Obtención y caracterización de CMMp.....................................................154
3.3. Diferenciación de CMMp a cardiomiocitos..............................................156
3.4. Obtención y caracterización de las líneas inmortalizadas de CMMp........163
3.5. Diferenciación de las líneas de CMMp inmortalizadas a cardiomiocitos.167
V. DISCUSIÓN...........................................................................................................187
1. Xenotrasplante de órganos de cerdos transgénicos a babuinos................................189
1.1. Barrera inmunológica en el xenotrasplante heterotópico de corazón de cerdo
hDAF en babuinos............................................................................................190
1.1.1 Eficacia del transgen hDAF en la prevención del RHA o el RVA
...............................................................................................................190
XV
Description:El presente trabajo, “Modelos animales para el análisis del xenotrasplante y la terapia celular como alternativas al alotrasplante de órganos”, presentado por Isabel Moscoso. Galán para aspirar al grado de Doctor en Biología, dirigido por la Dra. Nieves. Domenech García, de la Unidad de In
