Manuscrit thèse APM FINAL ADUM

214 Pages·2014·8.52 MB·French

UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE
U.F.R. DE MEDECINE
ECOLE DOCTORALE SCIENCES, TECHNOLOGIES, SANTE (547)

THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE
Discipline : Biochimie

Présentée et soutenue publiquement
Par
Anne-Pascaline BOULEAU-MARTIN
Le 23 septembre 2014

Identification et caractérisation de métalloprotéases de
Toxoplasma gondii

Matrice Extracellulaire et Dynamique Cellulaire (MEDyC) CNRS UMR 7369
Protozooses, transmises par l’alimentation : circulation et pathogénie EA 3800
SFR CAP-Santé : FED 4231

Membres du Jury
Monsieur le Professeur Hervé PELLOUX (Grenoble) : Rapporteur/Président
Monsieur le Professeur Ermanno CANDOLFI (Strasbourg) : Rapporteur
Madame le Professeur Isabelle VILLENA (Reims) : CoDirecteur de thèse
Monsieur le Docteur Georges BELLON (Reims) : CoDirecteur de thèse
Monsieur le Docteur William HORNEBECK (Reims) : Invité
Madame le Docteur Erika BOURGUET (Reims) : Invité

N° attribué par la bibliothèque
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Remerciements
Le travail réalisé dans cette thèse a été effectué au sein des laboratoires de
Parasitologie-Mycologie et de Biochimie-Biologie Moléculaire. Je tiens à adresser ma
profonde reconnaissance à Madame le Professeur Isabelle Villena et Monsieur le Professeur
François-Xavier Maquart pour m’avoir accueillie au sein de leurs équipes respectives et pour
leurs précieux conseils et leurs soutiens.
Je tiens à remercier Monsieur le Docteur Georges Bellon qui a dirigé ce travail de
recherche. Je vous remercie pour vos nombreux conseils et pour votre soutien lors de la
rédaction de ce manuscrit.
Je remercie Monsieur le Professeur Hervé Pelloux et Monsieur le Professeur Ermanno
Candolfi d’avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse et de juger ce travail.
Je tiens à remercier chaleureusement Monsieur le Docteur William Hornebeck pour
avoir accepté de participer à ce jury. Merci infiniment pour vos conseils et remarques si
précieuses.
Je tiens à remercier Mademoiselle le Docteur Erika Bourguet pour avoir accepté
d’examiner ce travail. Merci pour ta disponibilité et ton aide. (Bisous à Salomé !)
Je tiens à remercier chaleureusement Monsieur le Docteur Dominique Aubert pour ces
nombreuses idées et son aide précieuse pour la bibliographie. Merci pour tous les conseils que
vous m’avez donné pendant nos réunions de recherche.
Je tiens particulièrement à remercier Madame le Docteur Sandie Escotte-Binet pour
son soutien indispensable tout au long de ce travail. Je me souviendrais de tous les moments
passés devant nos chromatographies à réfléchir à la stratégie à employer et à sa mise en place,
pas toujours facile ! Merci pour ton aide, tes conseils. Bonne continuation à toi (et ta
Camille !).
Je remercie ensuite Mademoiselle le Docteur Christelle Doliwa. Tu m’as soutenu
dans les durs moments, tu as toujours été là quand j’en avais besoin. Merci pour tes conseils et
ton soutien indéfectible. Je te souhaite tout le bonheur que tu mérites.
Je remercie l’ensemble du personnel hospitalier du service de parasitologie du CHU et
tout particulièrement Régine pour tes supers idées, Sandrine, Francine, Naïma, Emilie notre
spécialiste « biomol’ », Laurence et Laurence ! Merci pour votre disponibilité si précieuse.
Je tiens à remercier les personnes qui m’ont aidé grâce à leurs conseils techniques
toujours très pertinents. Le Docteur Christine Terryn et le Docteur Frédéric Velard pour la
réalisation de magnifiques observations de notre parasite ! Coco pour ta grande disponibilité,
tu as toujours trouvé le produit dont j’avais besoin.
Je remercie également les personnes de notre équipe que j’ai côtoyée pendant ma
thèse : Marie-Lazarine Poulle, Loïc Favennec ainsi que Cécile, Marie-Amélie. Nos rencontres
ont toujours été très agréables et chaleureuses.
Je remercie aussi le Docteur Roselyne Garnotel pour ses conseils et son aide.
Je remercie chaleureusement Hélène, Aurore et Floriane pour nos pauses café et nos
déjeuners qui m’ont permis de résoudre certains problèmes techniques et de nous changer les
idées pendant ces quelques minutes.
Je remercie tous les stagiaires que j’ai côtoyé durant ces quatre années : Marion et Léa
qui m’ont aidée pour mes travaux, Annabelle, Alexandre, Younès (j’ai adoré discuter de ton
sujet de stage si différent de mes travaux) et Jérémy (bonne chance pour la suite, sur le
bouleau d’Afrique j’espère! Merci beaucoup pour ton aide lors de ma fin de thèse).
Je remercie également toutes les personnes qui ont fait de ma thèse, un moment très
agréable : Julien, Joan, Jing, Jenifer, André ainsi que toutes les personnes du 3ème étage et
Christine tout spécialement pour tes conseils, Sylvie, Aymeic, Valérie, Halima, Sophie,
Medhi, Chantal, Saad et Jérôme et également Nathalie, Aurélie, Claire, Yves J. et Stéphanie.
Je remercie également Yves G. pour sa grande disponibilité et sa gentillesse.
Pour terminer, je remercie tout spécialement mon « cocoon familial » pour leur soutien
et leur disponibilité tout au long de ces quatre années. Merci à mon mari Antony et ma fille
Axelle pour tout le bonheur que vous m’apportez chaque jour. Merci à mes parents, à ma
sœur Anne-Valérie, mon « grand frère » Cyril et mon neveu Jules pour votre soutien sans
faille. Vous avez fait de ces quatre années, un grand bonheur tant au niveau professionnel que
personnel. Vous avez tout mon amour !
A Antony et Axelle,
AA mes parents,
A Nanou, Cyril et Jules
Résumé
Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire appartenant à
la famille des Apicomplexa. Chez les protozoaires, les protéases possèdent des rôles clés au
niveau du cycle parasitaire, et sont ainsi considérées comme des facteurs de virulence. Chez
T. gondii, les métallopeptidases pourraient être impliquées dans la traversée des différentes
barrières biologiques. A l’heure actuelle, seules cinq métallopeptidases de T. gondii ont été
décrites : une aminopeptidase N, deux toxolysines, une leucine aminopeptidase et une FtsH1
peptidase. Lors de l’étude de l’influence de l’invasion de monocytes humains par T. gondii
sur le profil d’expression des métalloprotéases matricielles monocytaires, nous avons mis en
évidence une protéase parasitaire présentant à la fois des propriétés gélatino- et
élastinolytique.
Le but de ce travail est de caractériser, purifier et identifier cette gélatinase de T.
gondii.
Dans un premier temps, nous avons caractérisé la gélatinase d’environ 100 kDa
sécrétée par T. gondii comme étant une MMP-9 like (métallo-endopeptidase à zinc) mais ne
possédant pas le même processus d’activation que les MMPs humaines.
Dans un deuxième temps, après purification partielle par une série de chromatographie
chélatrice de zinc, nous avons identifié par spectrométrie de masse la gélatinase comme étant
la TGME49_227948 annotée dans ToxoDB. Cette protéase présente les domaines protéiques
d’une métalloprotéase à zinc de la sous-famille M16C, et est proche au niveau de sa structure
3D de la chaîne A de la 2FGE présente chez Arabidopsis Thaliana. Afin de confirmer
l’annotation de ToxoDB, nous avons séquencé l’extrémité 5’ de l’ARNm de cette protéase.
Cependant, nos résultats expérimentaux ne sont pas en concordance avec l’annotation prédite
dans la base de données ToxoDB.
La séquence en acides aminés de cette protéase, nous a permis de synthétiser deux
anticorps polyclonaux spécifiques afin de mettre en évidence deux formes de 140 kDa et 100
kDa et donc d’émettre l’hypothèse que cette protéase pourrait être clivée afin d’être activée.
De plus, cette métalloprotéase a été détectée par western blot dans le cytosol des parasites
mais elle est aussi secrétée dans le milieu conditionné. Par immunolocalisation, la protéase est
présente au sein du parasite, au niveau du cytosol sans localisation préférentielle dans un
organite particulier.
Dans ce travail, nous avons montré que la gélatinase parasitaire sécrétée par T. gondii
pourrait dégrader des composés de la matrice extracellulaire, d’où son rôle potentiel dans le
mécanisme de traversée des barrières biologiques.
Abstract
Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite which belongs to the
Apicomplexa phylum. In protozoans, proteases have key roles in the parasitic cycle. They
thereby are considered as virulence factors. In T. gondii, metallopeptidases may be involved
in the crossing of biological barriers. Currently, only five metallopeptidases from T. gondii
are described: an aminopeptidase N, two toxolysins, one leucine aminopeptidase and one
FtsH1 peptidase. During the study of the influence of human monocytes invasion by T. gondii
on the monocytic matrix metalloproteases expression profile, we brought out a parasitic
protease showing gelatino- and elastinolytic properties.
The aim of this study is to characterize, purify and identify this gelatinase from T.
gondii.
First we characterized the 100 kDa-gelatinase secreted by T. gondii as an MMP-9-like
(zinc metalloendopeptidase) but its activation process is different from human MMPs.
Then, after the partial purification by a series of zinc-chelate chromatographies, we identified
by mass spectrometry the gelatinase as the TGME49_227948 annotated in ToxoDB. This
protease has M16C subfamily zinc-metalloprotease protein domains and is close to the 3D
structure of the A chain of the 2FGE in Arabidopsis thaliana. In order to confirm the ToxoDB
annotation, we sequenced the 5’ end of the mRNA of this protease. Nevertheless our
experimental results are not in the line with the predicted annotation in ToxoDB database.
The amino acids sequence of this protease allowed us to synthesize two specific
polyclonal antibodies in order to highlight two forms, 140 kDa and 100 kDa, and to emit the
hypothesis that this protease could be cleaved to be activated. Moreover this metalloprotease
was detected by Western Blot in the cytosol of the parasites but it can also be secreted in the
conditioned medium. By immulocalization, the protease is present in the cytosol of the
parasite without any preferential localization in a particular organelle.
In this study, we showed that the parasitic gelatinase secreted by T. gondii could
degrade extracellular matrix compounds, which could explain its potential role in the
mechanism involved in the crossing of biological barriers.
Sommaire

Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Liste des publications et des communications

INTRODUCTION .................................................................................................................... 1

Contexte scientifique ................................................................................................................ 2

Toxoplasma gondii .................................................................................................................... 3
I/ Découverte du parasite Toxoplasma gondii ........................................................................ 3
II/ Les stades parasitaires de Toxoplasma gondii ................................................................... 4
II-1/ Le tachyzoïte ............................................................................................................... 4
II-2/ Le bradyzoïte .............................................................................................................. 6
II-3/ Le sporozoïte ............................................................................................................... 7
III/ Le cycle parasitaire de Toxoplasma gondii ...................................................................... 7
IV/ Organisation moléculaire de Toxoplasma gondii ............................................................. 9
IV-1/ Les protéines de surface (SAG)................................................................................. 9
IV-2/ Les protéines des organelles sécrétoires .................................................................... 9
IV-2-1/ Les protéines des micromènes (MIC) .............................................................. 10
IV-2-2/ Les protéines des rhoptries (ROP) ................................................................... 10
IV-2-3/ Les protéines des granules denses (GRA) ........................................................ 11
V/ Le processus d’invasion de la cellule-hôte par T. gondii ................................................ 11
VI/ Les barrières biologiques traversées par T. gondii ......................................................... 15
VI-1/ Description des barrières biologiques traversées par T. gondii ............................... 15
VI-2/ Rôle des protéases sécrétées par T. gondii dans le mécanisme d’invasion ............ 17
Les protéases ........................................................................................................................... 21
I/ Généralités sur les protéases ............................................................................................. 21
I-1/ Classification des protéases ........................................................................................ 21
I-2/ Les différentes familles de protéases selon MEROPS ............................................... 23
I-2-1/ Les protéases à acide aspartique.......................................................................... 23
I-2-2/ Les protéases à cystéine ...................................................................................... 23
I-2-3/ Les protéases à acide glutamique ........................................................................ 25
I-2-4/ Les métalloprotéases ........................................................................................... 25
I-2-5/ Les protéases à asparagine .................................................................................. 27
I-2-6/ Les protéases à site catalytique mixés ................................................................. 27
I-2-7/ Les protéases à sérine .......................................................................................... 27
I-2-8/ Les protéases à thréonine .................................................................................... 28
II/ Les métalloprotéases présentes chez T. gondii ................................................................ 29
II-1/ Métalloprotéases : étude in silico chez T. gondii ...................................................... 29
II-2/ Rôles des métalloprotéases de T. gondii ................................................................... 42

But de l’étude .......................................................................................................................... 44

MATERIELS ET METHODES ........................................................................................... 45

Culture cellulaire .................................................................................................................... 46
I/ La lignée cellulaire Vero ................................................................................................... 46
I-1/ Description de la lignée cellulaire .............................................................................. 46
I-2/ Entretien de la lignée cellulaire .................................................................................. 46
II/ La souche virulente RH de T. gondii ............................................................................... 47
II-1/ Description de la souche RH .................................................................................... 47
II-2/ Entretien de la souche RH......................................................................................... 47
II-2-1/ Multiplication des tachyzoïtes in vitro ............................................................... 47
II-2-2/ Multiplication des tachyzoïtes in vivo ............................................................... 48
III/ Coloration des cellules infestées .................................................................................... 48
Synthèse d’anticorps polyclonaux dirigés contre la TGME49_227948 ............................. 49
I/ Synthèse d’anticorps polyclonaux ..................................................................................... 49
I-1/ Recherche de la séquence antigénique ....................................................................... 49
I-2/ Recherche et production des protéines KLH.............................................................. 50
I-3/ Tests et validation des sérums pré-immuns pour l’immunisation .............................. 50
I-4/ Production des anticorps ............................................................................................ 51
I-5/ Analyses des anticorps ............................................................................................... 52
II/ Immunomarquage des tachyzoïtes ................................................................................... 53
II-1/ Principe ..................................................................................................................... 53
II-2/ Mode opératoire ........................................................................................................ 53
III/ Test d’invasion en présence d’anticorps analysé par vidéomicroscopie ........................ 54

Méthodes biochimiques .......................................................................................................... 56
I/ Préparation des échantillons .............................................................................................. 56
I-1/ Milieux conditionnés .................................................................................................. 56
I-2/ Extraction des protéines ............................................................................................. 57
I-3/ Dosage protéique ........................................................................................................ 58
II/ Méthodes chromatographiques ........................................................................................ 59
II-1/ Chromatographie de gel filtration ............................................................................. 59
II-2/ Chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose...................................................... 62
II-3/ Chromatographie chélatrice de zinc.......................................................................... 64
III/ SDS-PAGE ..................................................................................................................... 65
IV/ Zymographie .................................................................................................................. 66
IV-1/ Principe .................................................................................................................... 66
IV-2/ Mode opératoire ...................................................................................................... 66
IV-2-1/ Etude de l’activité gélatinolytique en présence d’inhibiteurs .......................... 67
IV-2-2/ Etude de l’activité gélatinolytique en présence d’APMA ................................ 69
IV-2-3/ Influence de la température et du pH sur l’activité gélatinolytique de la
gélatinase parasitaire ..................................................................................................... 70
IV-2-4/ Influence des anticorps sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire
....................................................................................................................................... 71
V/ Spectrofluorimétrie .......................................................................................................... 71
V-1/ Principe ..................................................................................................................... 71
V-2/ Mode opératoire ........................................................................................................ 72
VI/ Western-blotting ............................................................................................................. 74
VI-1/ Principe .................................................................................................................... 74
VI-2/ Mode opératoire ...................................................................................................... 74
VII/ Electrophorèse en deux dimensions .............................................................................. 75
VII-1/ Principe .................................................................................................................. 75
VII-2/ Mode opératoire ..................................................................................................... 76
VII-2-1/ Préparation de l’échantillon ............................................................................ 76
VII-2-2/ 1ère dimension : Isoélectrofocalisation ............................................................ 76
VII-2-3/ 2ème dimension : SDS-PAGE ou zymographie ............................................... 77

Méthodes de biologie moléculaire ......................................................................................... 78
I/ Extraction des ARNs totaux .............................................................................................. 78
II/ Technique 5’RACE .......................................................................................................... 78
II-1/ Principe ..................................................................................................................... 79
II-2/ Mode opératoire ........................................................................................................ 80

Etude in silico de la structure de la protéase parasitaire par bioinformatique ................ 82
I/ Alignement de séquences ................................................................................................. 82
II/ Recherches de modifications post-traductionnelles ........................................................ 82
III/ Détermination de la structure 3D putative d’une protéine ............................................ 83
IV/ Détermination des peptides antigéniques potentiels de la TGME49_227948 .............. 83

Statistiques .............................................................................................................................. 84

RESULTATS .......................................................................................................................... 85

Partie I. Mise en évidence et caractérisation d’une protéase à activité gélatinolytique
sécrétée par Toxoplasma gondii ............................................................................................. 86
I/ Mise en évidence de la gélatinase sécrétée par T. gondii .................................................. 86
I-1/ Comparaison de l’activité gélatinolytique provenant de tachyzoïtes obtenus in vivo et
in vitro ............................................................................................................................... 86