L'hyperthermie provoque l'agrégation de FLIP et restaure l'apoptose induite par TRAIL

229 Pages·2017·19.54 MB·French

by  Aymeric Morle

L’hyperthermie provoque l’agrégation de FLIP et
restaure l’apoptose induite par TRAIL
Aymeric Morle
To cite this version:
Aymeric Morle. L’hyperthermie provoque l’agrégation de FLIP et restaure l’apoptose induite par
TRAIL. Médecine humaine et pathologie. Université de Bourgogne, 2014. Français. ￿NNT: 2014DI-
JOS082￿. ￿tel-01292139￿
HAL Id: tel-01292139
https://theses.hal.science/tel-01292139
Submitted on 22 Mar 2016
HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents
entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de
teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires
abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
Université de Bourgogne
École doctorale Environnement-Santé-STIC
Thèse
Présentée pour lʼobtention du titre de
ʼ
Docteur de l Université de Bourgogne
Discipline : Sciences de la vie
Spécialité : Biologie Moléculaire et Cellulaire
Présentée et soutenue publiquement le 17 décembre 2014 par :
Aymeric MORLÉ
ʼ ʼ
L hyperthermie provoque l agrégation de
ʼ
FLIP et restaure l apoptose induite par TRAIL
Directeur de thèse :
Chef dʼéquipe :
Olivier MICHEAU
Carmen GARRIDO
Membres du jury :
Pr Jean-Louis CONNAT
Président du jury
Pr Patrick ARRIGO
Rapporteur
Dr Marie-Thérèse DIMANCHE-BOITREL
Rapporteur
Pr Bruno SÉGUI
Examinateur
Dr Thierry GUILLAUDEUX
Examinateur
Unité INSERM U866 « Lipides, Nutrition, Cancer »
équipe Signalisation TRAIL et cancer.
Faculté de Médecine, 7 Bd Jeanne d’Arc, 21000 Dijon

1
2
Remerciements
Je tiens avant tout à remercier les membres du jury qui mʼont fait lʼhonneur de prendre
sur leur temps afin dʼévaluer mon travail de thèse.
Patrcik ARRIGO, Professeur de Classe Exeptionnelle à lʼINSERM UMR 1052, centre de
recherche en cancérologie de Lyon.
Marie thérèse Dimanche-boitrel, Directeur de Recherche à lʼINSERM, Institut de
recherches en Santé, Environnement et Travail, à lʼUniversité de Rennes.
Bruno SÉGUI, Professeur des Université à IʼNSERM UMR 1037, Cancéropole du
Grand Sud-Ouest, à Toulouse.
Thierry GUILLAUDEUX, Maître de conférence à lʼunité INSERM UMR 917 «
Microenvironnement et Cancer », à lʼUniversitée de Rennes.
Je remercie le ministère de la recherche ainsi que tous les donateurs de la Ligue
Nationale Contre le Cancer, qui permettent de faire avancer la science et sans qui le
financement et la réalisation de cette thèse nʼauraient pas été possible.
Je tiens a remercier en particulier mon directeur de thèse, Olivier MICHEAU, qui mʼa
accompagné dans lʼunivers de la recherche et tout au long de ce projet. Je lui témoigne
ma reconnaissance pour mʼavoir accordé sa confiance, ainsi que pour mʼavoir laissé une
certaine indépendance tout en mʼappuyant de ses grandes qualités scientifiques.
Je remercie Carmen GARRIDO, pour mʼavoir acceptée au sein de son laboratoire et de
son équipe, je lui témoigne ma reconnaissance pour ses conseils et son dynamisme.
Je remercie les membres de mon équipe, Florent, Sarah, Thibault, Sofiane, Hakima et
les plus anciens Alex, Guillaume, Nij et Lisa. Merci aux membres de lʼunité et à toutes les
personnes qui mʼont aidées et accompagnées au fil des années.
Enfin je remercie spécialement les personnes qui ont contribué indirectement à ce
projet par leurs conseils et leur aide au jour le jour : Margaux, Jessica, Arlette, Emeric et
ceux que jʼai oublié.

3
4
Résumé
TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) est une protéine du système immunitaire
appartenant à la famille du TNF (Tumor necrosis factor). L'intérêt de TRAIL en thérapie
anti-cancéreuse réside dans sa capacité à induire la mort par apoptose des cellules
tumorales, sans exercer de toxicité envers les cellules saines. Le principal frein à
lʼutilisation de TRAIL est la survenue courante de résistances dans les tumeurs, limitant
ainsi son efficacité. Mon travail de thèse a consisté à étudier lʼintérêt de lʼhyperthermie (ou
choc thermique) en tant quʼadjuvant à TRAIL et a décrire ses capacités à contourner les
mécanismes de résistance.
Dans un premier temps, lʼactivité et la portée de cette combinaison a été évaluée dans
de nombreuses et diverses lignées cellulaires cancéreuses sensibles ou résistantes à
TRAIL. Un choc thermique (1h 42°C) permet de sensibiliser efficacement les lignées
devenues résistantes à TRAIL et cette association sʼest avérée efficace dans toutes les
lignées testées.
Dans un deuxième temps, mon travail sʼest focalisé sur les mécanismes induits par
lʼhyperthermie, responsables de la sensibilisation et de lʼapoptose des cellules. Les
analyses des complexes initiateurs de la mort (DISC - Death-inducing signaling complex)
ont révélé de nombreuses disparités suivant les conditions thermiques. Les différences
majeures impliquent avant tout lʼabsence de FLIP dans le DISC, celui-ci étant lʼinhibiteur
principal de la voie, ainsi quʼun retard de la formation du complexe en condition
dʼhyperthermie. Ceci est associé à lʼactivation des caspases initiatrices dʼune meilleure
qualité, une fois la température revenue à la normale.
Lʼabsence de FLIP est expliquée par son inactivation due à lʼagrégation de cette
protéine suite à lʼaugmentation de la température. Ce phénomène est indépendant dʼune
quelconque modification post-traductionnelle connue, mais peut être inhibé par la
présence de glycérol qui stabilise les protéines dénaturées.
Lʼensemble de ce travail met en lumière lʼintérêt de la combinaison de TRAIL avec une
hyperthermie et présente un point de vue nouveau sur les mécanismes expliquant son
efficacité.
Mots clés : Cancer, apoptose, TRAIL, hyperthermie, FLIP, agrégation

5
Abstract
The TNF-family member TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) is a cytokine
involved in the immune anti-tumour surveillance. TRAIL is a promising agent currently
under investigation for its anti-cancer properties with limited side effects on healthy cells.
However, the use of TRAIL in oncology has been limited due to its lack of efficiency, mainly
associated with cell resistance to apoptosis. The aim of this project was to study the
interest of hyperthermia (or heat shock - HS) as an adjuvant for TRAIL therapy and the
mechanisms involved in this sensitization.
We have first evaluated the significance of this combination in a large variety of cancer
cell lines known to be sensitive or resistant to TRAIL. We could demonstrate that
hyperthermia was able to efficiently sensitize resistant cancer cells to TRAIl-induced
apoptosis in almost every cell lines tested.
We next, focused our work on the molecular mechanisms responsible for the
sensitization, during hyperthermia. Analyses of the DISC (Death-Inducing Signaling
Complex) revealed a lack of recruitment of FLIP in the DISC, the main inhibitor of the
extrinsic pathway, and a delay in the formation of the complex under hyperthermic
conditions. Inhibition of FLIP recruitment was associated with enhanced initiator caspases
activation when cells were reincubated at 37°C after the HS.
The absence of FLIP within the TRAIL DISC was due to its aggregation during HS and
was independent of post-translational modifications. Inhibition of FLIP aggregation by
glycerol, which stabilizes denaturerated proteins, restored FLIP recruitment within the
TRAIL DISC and consequently inhibited TRAIL-induced cell death.
  Taken together, these results highlight the interest of combining TRAIL with
hyperthermia and highlight new mechanisms explaining its efficiency.
Keywords : Cancer, apoptosis, TRAIL, hyperthermia, FLIP, aggregation

6
Sommaire

Remerciements 3

Résumé / Abstract 5

Sommaire 7

Liste des abréviations 9

Liste des figures 11

Liste des tableaux 12

Avant propos 13
I. Le cancer et la cancérogenèse 15
II. Les causes et les facteurs à risque 17
III. Les traitements existants 20
IV. La mort cellulaire programmée 23

Introduction bibliographique 25
I. TRAIL - un membre de la famille du TNF 27
1. Lʼexécution de lʼapoptose 27
A. Les caspases - les clés de lʼapoptose 29
B. Le processus apoptotique 30
2. La fonction biologique de TRAIL 31
A. Les cellules exprimant TRAIL et ses récepteurs 32
B. Le rôle physiologique de TRAIL 32
a) TRAIL, une cytokine anticancéreuse 33
b) Un régulateur de lʼimmunité 34
3. TRAIL et ses récepteurs 35
A. Structure de TRAIL 35
B. Les récepteurs agonistes 37
C. Les récepteurs antagonistes 38
4. La signalisation apoptotique induite par TRAIL 39
A. Apoptose extrinsèque - La voie principale de TRAIL 39
B. Apoptose intrinsèque - La boucle dʼamplification mitochondriale 42
C. Les régulations de la voie intrinsèque 45
a) FLIP - Un inhibiteur majeur de la voie extrinsèque. 45
b) Les autres régulateurs directs de la voie extrinsèque. 48
c) Les régulations de la voie intrinsèque 51
5. Utilisation de TRAIL en thérapie 53
A. Les formes recombinantes de TRAIL 53
a) Les versions classiques 54
b) Les versions taggées 54
B. Les anticorps agonistes 54
C. Les autres formes de TRAIL 55
II. Les protéines de choc thermique (HSP) - Classification et fonctions 57
1. Les HSP dans la réponse au stress 57
2. La famille des petites protéines de stress (sHSP) - HSP27 59
A. Structure, modifications et oligomérisation dʼHSP27 59
B. Stress et fonctions apoptotiques 60
3. La famille dʼHSP70 61

7
A. Structure dʼHSP70 63
B. Stress et fonctions anti-apoptotiques 63
4. La famille dʼHSP90 65
A. Structure dʼHSP90 65
B. Stress et fonctions anti-apoptotiques 66
III. Lʼhyperthermie 69
1. Les effets cellulaires dʼun choc thermique 69
A. Les effets dʼun choc thermique sur lʼagrégation protéique 69
a) Structure, conformation et repliement des protéines 69
b) La dénaturation et la formation dʼagrégats protéiques 71
c) Lʼagrésome 75
B. Le système de dégradation ubiquitine/protéasome 77
a) Ubiquitination 77
b) Dégradation protéasomale 78
C. Les modifications structurales 79
a) La fluidité membranaire 79
b) Le cytosquelette 80
c) Au niveau nucléaire 80
D. La réponse moléculaire au stress thermique 81
2. Lʼhyperthermie contre le cancer 83
A. Lʼhyperthermie en combinaison avec TRAIL 84
B. Lʼhyperthermie en combinaison avec la radiothérapie 85
C. Lʼhyperthermie en combinaison avec la chimiothérapie 85
3. Les moyens techniques dʼinduire une hyperthermie 87
Objectifs 91
Résultats 93
I. Lʼhyperthermie restaure la sensibilité à lʼapoptose induite par TRAIL de
manière indépendante de la voie mitochondriale 95
II. La sensibilisation à TRAIL par un choc thermique est dépendante de
lʼagrégation de FLIP 109
III.Les protéines de choc thermique ont un rôle mineur dans lʼagrégation de
FLIP et dans lʼapoptose induite par TRAIL et par un choc thermique 125
IV.TRAIL-R1 et TRAIL-R2 sont différentiellement impliqués dans lʼapoptose
induite par TRAIL et par un choc thermique 135
Discussion 141
Conclusion générale 159
Matériel et méthode 161
Annexe 169
- Curriculum Vitae
- Article 1 : Hyperthermia restores apoptosis induced by death receptors through
aggregation-induced c-FLIP cytosolic depletion.
- Article 2 : TRAIL-R4 promotes tumor growth and resistance to apoptosis in cervical
carcinoma HeLa cells through AKT.
Références 207

8
Liste des abréviations
A F

Akt : Activated protein kinase FADD : Fas-Associated Death Domain
Apaf-1 : Apoptotic protease activating FLIPL/S/R: Cellular Flice inhibitory protein
factor Long/Short/Raji
c-Fos : Cellular FBJ murine osteosarcoma
B viral oncogene homolog

G
Bad : Bcl-2 antagonist of cell
death
Bag 3 :BCL2-associated athanogene 3 GPI : Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol
Bak : Bcl-2 antagonist killer 1 GSK-3: Glycogen synthase kinase-3
Bax : Bcl-2 associated x protein GRP : Glucose-regulated protein
BCB : Bax channel blockers
Bcl-2 : B-cell lymphoma 2 H
Bcl-xL : Bcl-2-related gene X, long isoform
BH : Bcl-2 Homology HS : Heat shock
Bid : BH3-interacting domain death HSP : Heat shock protein
agonist
Bik : Bcl-2-interacting killer
I
Bim : Bcl-2-interacting mediator of cell

death
IAP : Inhibitors of Apoptosis Protein
IFN : Interféron
C
Ig : Immunoglobuline
IkB : Inhibitor of NF-"B
CARD : Caspase-recruitment domain
CRD : Cystein-rich domain
J
CUL3 : Cullin-3

JNK : c-Jun N-terminal Kinase
D
L
ATP : Adénosine triphosphate
DcR : Decoy Receptor LPS : Lipo-Polysaccharide
DD : Death Domain
DED : Death Effector Domain
M
DIABLO : Direct IAP binding protein with

low pI
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase
DISC : Death-Inducing Signaling Complex
Mcl-1 : Myeloid cell leukemia 1
DR : Death Receptor

N
E

NF-kB : Nuclear factor Kappa-B
ERK : Extracellular signal-regulated
NK : Natural Killer
kinase

9