Table Of ContentTHESE / UNIVERSITE DE BREST présentée par
Benoît Castrec
sous le sceau de l’Université européenne de Bretagne
pour obtenir le titre de
Préparée à l’Unité Mixte de recherche (UMR 6197)
DOCTEUR DE l’UNIVERSITE DE BREST
Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes
Mention : Biochimie - Microbiologie
Ecole Doctorale des Sciences de la Mer Equipe Maintenance génomique chez les Archaea
Thèse soutenue le 6 Novembre 2009
« Les ADN polymérases devant le jury composé de :
Vianney Pichereau
B et D de l’Archaea
Professeur, Université de Bretagne Occidentale / Président
hyperthermophile Ulrich Hübscher
Professeur, Institute of Veterinary Biochemistry and Molecular Biology, University of
Zürich-Irchel / rapporteur
Pyrococcus abyssi :
Giuseppe Villani
contribution à l’étude des Directeur de recherche Inserm, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale-
Toulouse / rapporteur
relations structure- Daniel Thomas
Directeur de recherche CNRS, Université de Rennes1 / Examinateur
fonction »
Ghislaine Henneke
Chargée de recherche, Ifremer Brest / Examinatrice
Mohamed Jebbar
Professeur, Université de Bretagne Occidentale / Directeur de thèse
Jean-Paul Raffin
Chargé de recherche CNRS, Ifremer Brest / Invité
2
RRRReeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeeemmmmeeeennnnttttssss
CCCCeeeetttttttteeee tttthhhhèèèèsssseeee aaaa ééééttttéééé rrrrééééaaaalllliiiissssééééeeee aaaauuuu sssseeeeiiiinnnn dddduuuu LLLLaaaabbbboooorrrraaaattttooooiiiirrrreeee ddddeeee MMMMiiiiccccrrrroooobbbbiiiioooollllooooggggiiiieeee ddddeeeessss EEEEnnnnvvvviiiirrrroooonnnnnnnneeeemmmmeeeennnnttttssss EEEExxxxttttrrrrêêêêmmmmeeeessss aaaavvvveeeecccc lllleeee
ssssoooouuuuttttiiiieeeennnn ffffiiiinnnnaaaannnncccciiiieeeerrrr ddddeeee llllaaaa RRRRééééggggiiiioooonnnn BBBBrrrreeeettttaaaaggggnnnneeee.... OOOOnnnntttt ppppaaaarrrrttttiiiicccciiiippppéééé ééééggggaaaalllleeeemmmmeeeennnntttt àààà llllaaaa rrrrééééaaaalllliiiissssaaaattttiiiioooonnnn ddddeeee cccceeee pppprrrroooojjjjeeeetttt llll’’’’UUUUBBBBOOOO,,,,
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PPPPrrrrooooffffeeeesssssssseeeeuuuurrrr àààà llll’’’’UUUUnnnniiiivvvveeeerrrrssssiiiittttéééé ddddeeee ZZZZüüüürrrriiiicccchhhh----IIIIrrrrcccchhhheeeellll,,,, GGGGiiiiuuuusssseeeeppppppppeeee VVVViiiillllllllaaaannnniiii,,,, DDDDiiiirrrreeeecccctttteeeeuuuurrrr ddddeeee RRRReeeecccchhhheeeerrrrcccchhhheeee àààà llll’’’’IIIInnnnsssseeeerrrrmmmm,,,, VVVViiiiaaaannnnnnnneeeeyyyy
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JJJJeeee rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeee ttttoooouuuutttt dddd’’’’aaaabbbboooorrrrdddd JJJJeeeeaaaannnn----PPPPaaaauuuullll RRRRaaaaffffffffiiiinnnn ppppoooouuuurrrr ssssoooonnnn eeeennnnccccaaaaddddrrrreeeemmmmeeeennnntttt iiiinnnnccccoooonnnnddddiiiittttiiiioooonnnnnnnneeeellll dddduuuurrrraaaannnntttt cccceeeessss 3333 aaaannnnnnnnééééeeeessss.... TTTTuuuu
mmmm’’’’aaaassss ssssaaaannnnssss cccceeeesssssssseeee eeeennnnccccoooouuuurrrraaaaggggéééé,,,, ffffaaaaiiiitttt ccccoooonnnnffffiiiiaaaannnncccceeee,,,, ddddoooonnnnnnnnéééé ccccoooonnnnffffiiiiaaaannnncccceeee eeeetttt llllaaaaiiiisssssssséééé ggggrrrraaaannnnddddiiiirrrr ttttoooouuuutttt aaaauuuu lllloooonnnngggg ddddeeee cccceeee ddddooooccccttttoooorrrraaaatttt....
MMMMeeeerrrrcccciiii aaaauuuussssssssiiii ppppoooouuuurrrr ttttoooouuuutttteeeessss cccceeeessss ddddiiiissssccccuuuussssssssiiiioooonnnnssss mmmmuuuullllttttiiiipppplllleeeessss eeeetttt vvvvaaaarrrriiiiééééeeeessss qqqquuuuiiii oooonnnntttt ppppeeeerrrrmmmmiiiissss ddddeeee ttttrrrraaaavvvvaaaaiiiilllllllleeeerrrr ddddaaaannnnssss uuuunnnneeee aaaammmmbbbbiiiiaaaannnncccceeee
sssseeeerrrreeeeiiiinnnneeee eeeetttt ccccoooonnnnvvvviiiivvvviiiiaaaalllleeee.... LLLLeeee ppppaaaassssssssaaaaggggeeee ddddeeee ttttéééémmmmooooiiiinnnn eeeesssstttt ddddééééssssoooorrrrmmmmaaaaiiiissss llllaaaannnnccccéééé !!!!
JJJJeeee ttttiiiieeeennnnssss àààà rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeeerrrr JJJJooooëëëëllll QQQQuuuueeeerrrreeeelllllllloooouuuu,,,, DDDDaaaannnniiiieeeellll PPPPrrrriiiieeeeuuuurrrr eeeetttt AAAAnnnnnnnneeee GGGGooooddddffffrrrrooooyyyy ppppoooouuuurrrr lllleeeeuuuurrrr aaaaccccccccuuuueeeeiiiillll aaaauuuu sssseeeeiiiinnnn dddduuuu
llllaaaabbbboooorrrraaaattttooooiiiirrrreeee eeeetttt ppppoooouuuurrrr llll’’’’iiiinnnnttttéééérrrrêêêêtttt qqqquuuu’’’’iiiillllssss oooonnnntttt ppppoooorrrrttttéééé àààà mmmmoooonnnn ttttrrrraaaavvvvaaaaiiiillll....
JJJJ’’’’eeeexxxxpppprrrriiiimmmmeeee mmmmeeeessss pppplllluuuussss vvvviiiiffffssss rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeeemmmmeeeennnnttttssss àààà GGGGhhhhiiiissssllllaaaaiiiinnnneeee HHHHeeeennnnnnnneeeekkkkeeee,,,, mmmmeeeerrrrcccciiii ppppoooouuuurrrr ttttaaaa rrrriiiigggguuuueeeeuuuurrrr,,,, ttttoooonnnn ppppeeeerrrrffffeeeeccccttttiiiioooonnnnnnnniiiissssmmmmeeee eeeetttt
ppppoooouuuurrrr ttttoooonnnn hhhhuuuummmmoooouuuurrrr ppppaaaarrrrffffooooiiiissss ccccaaaacccchhhhéééé mmmmaaaaiiiissss rrrrééééeeeellll.... CCCCeeeessss rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeeemmmmeeeennnnttttssss vvvvoooonnnntttt ééééggggaaaalllleeeemmmmeeeennnntttt àààà DDDDiiiiddddiiiieeeerrrr FFFFllllaaaammmmeeeennnntttt qqqquuuuiiii mmmm’’’’aaaa iiiinnnniiiittttiiiiéééé
nnnnoooottttaaaammmmmmmmeeeennnntttt àààà llllaaaa SSSSPPPPRRRR.... JJJJ’’’’aaaaiiii aaaapppppppprrrréééécccciiiiéééé ttttoooonnnn ccccaaaallllmmmmeeee,,,, ttttaaaa rrrriiiigggguuuueeeeuuuurrrr eeeetttt ttttoooonnnn eeeesssspppprrrriiiitttt cccchhhhaaaammmmbbbbrrrreeeeuuuurrrr.... CCCC’’’’ééééttttaaaaiiiitttt uuuunnnn vvvvrrrraaaaiiii ppppllllaaaaiiiissssiiiirrrr ddddeeee
ppppoooouuuuvvvvooooiiiirrrr ddddiiiissssccccuuuutttteeeerrrr eeeetttt ddddeeee ttttrrrraaaavvvvaaaaiiiilllllllleeeerrrr aaaavvvveeeecccc vvvvoooouuuussss ddddeeeeuuuuxxxx.... JJJJ’’’’eeeessssssssaaaaiiiieeeerrrraaaaiiii ddddeeee mmmm’’’’iiiinnnnssssppppiiiirrrreeeerrrr àààà llll’’’’aaaavvvveeeennnniiiirrrr ddddeeee vvvvoooottttrrrreeee ssssttttyyyylllleeee....
JJJJeeee rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeee ééééggggaaaalllleeeemmmmeeeennnntttt AAAAuuuuddddrrrreeeeyyyy LLLLeeee GGGGooooaaaazzzziiiioooouuuu eeeetttt ssssaaaa bbbboooonnnnnnnneeee hhhhuuuummmmeeeeuuuurrrr ((((ddddééééppppeeeennnnddddaaaannnntttteeee dddduuuu tttteeeemmmmppppssss !!!!)))).... MMMMeeeerrrrcccciiii ppppoooouuuurrrr ttttaaaa
ggggéééénnnnéééérrrroooossssiiiittttéééé eeeetttt ttttoooonnnn aaaaiiiiddddeeee tttteeeecccchhhhnnnniiiiqqqquuuueeee.... TTTTuuuu aaaassss ttttoooouuuujjjjoooouuuurrrrssss rrrrééééuuuussssssssiiii àààà rrrreeeennnnddddrrrreeee llll’’’’aaaattttmmmmoooosssspppphhhhèèèèrrrreeee cccchhhhaaaalllleeeeuuuurrrreeeeuuuusssseeee eeeetttt aaaaggggrrrrééééaaaabbbblllleeee aaaauuuu
sssseeeeiiiinnnn dddduuuu llllaaaabbbboooo.... MMMMeeeerrrrcccciiii aaaauuuussssssssiiii àààà SSSSoooopppphhhhiiiieeee SSSScccchhhhmmmmiiiitttttttt ppppoooouuuurrrr ttttaaaa ggggeeeennnnttttiiiilllllllleeeesssssssseeee eeeetttt ttttaaaa «««« nnnnoooonnnncccchhhhaaaallllaaaannnncccceeee ccccoooonnnnttttrrrrôôôôllllééééeeee »»»».... JJJJeeee nnnn’’’’oooouuuubbbblllliiiieeee
ppppaaaassss EEEEllllooooïïïïsssseeee DDDDeeeellllaaaaggggeeee ppppoooouuuurrrr ttttoooouuuutttteeeessss nnnnoooossss ddddiiiissssccccuuuussssssssiiiioooonnnnssss ddddéééélllliiiirrrraaaannnntttteeeessss....
JJJJeeee rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeee aaaauuuussssssssiiii JJJJuuuulllliiiieeeennnn BBBBrrrriiiiffffffffooootttteeeeaaaauuuuxxxx,,,, jjjj’’’’aaaaiiii ttttoooouuuujjjjoooouuuurrrrssss ééééttttéééé eeeennnnvvvviiiieeeeuuuuxxxx ddddeeee ttttoooonnnn aaaappppppppaaaarrrreeeennnntttteeee ddddééééccccoooonnnnttttrrrraaaaccccttttiiiioooonnnn.... TTTToooonnnn ââââmmmmeeee ddddeeee
vvvvooooyyyyaaaaggggeeeeuuuurrrr mmmm’’’’iiiinnnnssssppppiiiirrrreeee !!!! CCCCeeeessss rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeeemmmmeeeennnnttttssss vvvvoooonnnntttt aaaauuuussssssssiiii àààà mmmmoooonnnn ccccoooommmmppppaaaaggggnnnnoooonnnn ddddeeee rrrroooouuuutttteeee,,,, AAAAddddeeeelllliiiinnnneeee PPPPaaaalllluuuudddd.... JJJJ’’’’aaaaiiii
bbbbeeeeaaaauuuuccccoooouuuupppp aaaapppppppprrrréééécccciiiiéééé ttttaaaa ggggeeeennnnttttiiiilllllllleeeesssssssseeee,,,, ttttoooonnnn ddddyyyynnnnaaaammmmiiiissssmmmmeeee eeeetttt ttttoooonnnn eeeexxxxppppeeeerrrrttttiiiisssseeee sssscccciiiieeeennnnttttiiiiffffiiiiqqqquuuueeee.... JJJJeeee nnnneeee ggggaaaarrrrddddeeeerrrraaaaiiii qqqquuuueeee ddddeeee bbbboooonnnnssss
ssssoooouuuuvvvveeeennnniiiirrrrssss ddddeeee nnnnoooossss ccccoooonnnnvvvveeeerrrrssssaaaattttiiiioooonnnnssss eeeetttt ddddeeee nnnnoooossss ffffoooouuuussss rrrriiiirrrreeeessss eeeennnn ttttoooouuuutttt ggggeeeennnnrrrreeee....
MMMMeeeerrrrcccciiii eeeennnnccccoooorrrreeee àààà CCCChhhhrrrriiiissssttttoooopppphhhheeee RRRRoooouuuuiiiilllllllloooonnnn ppppoooouuuurrrr ttttoooonnnn aaaaccccccccuuuueeeeiiiillll eeeennnn EEEEccccoooosssssssseeee,,,, ppppoooouuuurrrr tttteeeessss ccccoooonnnnsssseeeeiiiillllssss eeeennnn ttttoooouuuutttt ggggeeeennnnrrrreeee eeeetttt ssssuuuurrrrttttoooouuuutttt
ppppoooouuuurrrr nnnnoooottttrrrreeee ccccoooollllllllaaaabbbboooorrrraaaattttiiiioooonnnn ffffrrrruuuuccccttttuuuueeeeuuuusssseeee.... MMMMeeeerrrrcccciiii aaaauuuussssssssiiii àààà CCCChhhhrrrriiiissssttttoooopppphhhheeee CCCCrrrréééézzzzéééé ppppoooouuuurrrr ttttoooonnnn aaaappppppppoooorrrrtttt ddddeeee ccccoooommmmppppéééétttteeeennnncccceeeessss eeeetttt
ttttaaaa ssssyyyymmmmppppaaaatttthhhhiiiieeee.... FFFFiiiinnnnaaaalllleeeemmmmeeeennnntttt,,,, lllleeeessss ssssttttrrrruuuuccccttttuuuurrrraaaalllliiiisssstttteeeessss ssssoooonnnntttt ddddeeeessss ppppeeeerrrrssssoooonnnnnnnneeeessss nnnnoooorrrrmmmmaaaalllleeeessss eeeetttt ttttoooouuuutttt àààà ffffaaaaiiiitttt aaaapppppppprrrréééécccciiiiaaaabbbblllleeeessss !!!!
AAAAuuuussssssssiiii,,,, SSSSéééébbbbaaaassssttttiiiieeeennnn LLLLaaaauuuurrrreeeennnntttt,,,, mmmmeeeerrrrcccciiii ppppoooouuuurrrr ttttoooonnnn ccccoooouuuupppp ddddeeee ppppoooouuuucccceeee eeeennnn SSSSPPPPRRRR eeeetttt ppppoooouuuurrrr ttttoooonnnn ddddyyyynnnnaaaammmmiiiissssmmmmeeee aaaappppppppoooorrrrttttéééé ssssuuuurrrr llllaaaa ffffiiiinnnn
ddddeeee cccceeee ddddooooccccttttoooorrrraaaatttt....
JJJJeeee nnnn’’’’oooouuuubbbblllliiiieeee ppppaaaassss mmmmeeeessss ssssttttaaaaggggiiiiaaaaiiiirrrreeeessss,,,, MMMMaaaarrrriiiinnnneeee RRRRiiiiddddoooouuuuxxxx eeeetttt TTTThhhhiiiibbbbaaaauuuutttt HHHHeeeerrrrrrrroooouuuu,,,, mmmmeeeerrrrcccciiii ppppoooouuuurrrr vvvvoooottttrrrreeee aaaaiiiiddddeeee eeeetttt dddd’’’’aaaavvvvooooiiiirrrr sssseeeerrrrvvvviiii ddddeeee
ccccoooobbbbaaaayyyyeeee dddduuuurrrraaaannnntttt cccceeeessss qqqquuuueeeellllqqqquuuueeeessss mmmmooooiiiissss ddddeeee mmmmaaaannnniiiipppp !!!! EEEEnnnn eeeessssppppéééérrrraaaannnntttt vvvvoooouuuussss aaaavvvvooooiiiirrrr ddddoooonnnnnnnnéééé uuuunnnneeee bbbboooonnnnnnnneeee iiiimmmmaaaaggggeeee ddddeeee llllaaaa rrrreeeecccchhhheeeerrrrcccchhhheeee....
3
UUUUnnnn ppppeeeettttiiiitttt mmmmeeeessssssssaaaaggggeeee aaaauuuuxxxx aaaauuuuttttrrrreeeessss ssssttttaaaaggggiiiiaaaaiiiirrrreeeessss «««« rrrréééépppplllliiiiqqqquuuuaaaannnnttttssss »»»» :::: CCCCaaaarrrroooolllliiiinnnneeee,,,, EEEErrrrwwwwaaaannnn,,,, LLLLéééénnnnaaaa,,,, FFFFlllloooorrrriiiiaaaannnn eeeetttt SSSSvvvveeeennnn.... MMMMeeeerrrrcccciiii
aaaauuuussssssssiiii àààà AAAAnnnnnnnn----SSSShhhhuuuu,,,, MMMMeeeelllliiiissssssssaaaa eeeetttt RRRRuuuuppppeeeeeeeesssshhhh qqqquuuuiiii oooonnnntttt pppprrrroooouuuuvvvvéééé qqqquuuueeee lllleeee rrrriiiirrrreeee eeeetttt lllleeee ssssoooouuuurrrriiiirrrreeee ééééttttaaaaiiiieeeennnntttt uuuunnnniiiivvvveeeerrrrsssseeeellllssss....
UUUUnnnn ggggrrrraaaannnndddd mmmmeeeerrrrcccciiii àààà CCCChhhhrrrriiiissssttttiiiinnnneeee LLLLaaaammmmyyyy,,,, bbbbiiiieeeennnn pppplllluuuussss qqqquuuu’’’’uuuunnnneeee sssseeeeccccrrrrééééttttaaaaiiiirrrreeee.... MMMMeeeerrrrcccciiii ppppoooouuuurrrr ttttaaaa ccccoooommmmppppéééétttteeeennnncccceeee,,,, ttttoooonnnn ddddyyyynnnnaaaammmmiiiissssmmmmeeee eeeetttt
ttttaaaa bbbboooonnnnnnnneeee hhhhuuuummmmeeeeuuuurrrr qqqquuuuoooottttiiiiddddiiiieeeennnnnnnneeee....
MMMMeeeessss rrrreeeemmmmeeeerrrrcccciiiieeeemmmmeeeennnnttttssss ssss’’’’aaaaddddrrrreeeesssssssseeeennnntttt ééééggggaaaalllleeeemmmmeeeennnntttt àààà llll’’’’eeeennnnsssseeeemmmmbbbblllleeee ddddeeeessss mmmmeeeemmmmbbbbrrrreeeessss dddduuuu LLLLaaaabbbboooorrrraaaattttooooiiiirrrreeee ddddeeee MMMMiiiiccccrrrroooobbbbiiiioooollllooooggggiiiieeee ddddeeeessss
EEEEnnnnvvvviiiirrrroooonnnnnnnneeeemmmmeeeennnnttttssss EEEExxxxttttrrrrêêêêmmmmeeeessss.... MMMMeeeerrrrcccciiii ppppoooouuuurrrr vvvvoooottttrrrreeee ggggeeeennnnttttiiiilllllllleeeesssssssseeee eeeetttt vvvvoooottttrrrreeee ddddiiiissssppppoooonnnniiiibbbbiiiilllliiiittttéééé qqqquuuuiiii oooonnnntttt ffffaaaaiiiitttt ddddeeee cccceeeessss 3333 aaaannnnnnnnééééeeeessss àààà
llll’’’’IIIIFFFFRRRREEEEMMMMEEEERRRR,,,, uuuunnnn bbbbeeeeaaaauuuu ssssééééjjjjoooouuuurrrr qqqquuuuiiii rrrreeeesssstttteeeerrrraaaa ppppoooouuuurrrr mmmmooooiiii iiiimmmmppppéééérrrriiiissssssssaaaabbbblllleeee....
MMMMeeeerrrrcccciiii àààà LLLLaaaauuuurrrreeeennnntttt TTTTooooffffffffiiiinnnn ppppoooouuuurrrr tttteeeessss ccccoooonnnnsssseeeeiiiillllssss aaaavvvviiiissssééééssss eeeetttt tttteeeessss iiiimmmmpppprrrreeeessssssssiiiioooonnnnssss eeeennnn ttttoooouuuutttt ggggeeeennnnrrrreeee qqqquuuueeee cccceeee ssssooooiiiitttt ddddaaaannnnssss lllleeee mmmmoooonnnnddddeeee
sssscccciiiieeeennnnttttiiiiffffiiiiqqqquuuueeee,,,, lllleeeessss llllooooiiiissssiiiirrrrssss vvvvééééttttééééttttiiiisssstttteeeessss oooouuuu llllaaaa ccccoooonnnnffffeeeeccccttttiiiioooonnnn ddddeeee mmmmeeeettttssss jjjjaaaappppoooonnnnaaaaiiiissss.... MMMMeeeerrrrcccciiii aaaauuuussssssssiiii àààà SSSSttttéééépppphhhhaaaannnneeee LLLL’’’’hhhhaaaarrrriiiiddddoooonnnn,,,,
llll’’’’hhhhoooommmmmmmmeeee qqqquuuuiiii aaaarrrrrrrriiiivvvveeee àààà ddddiiiirrrreeee bbbboooonnnnjjjjoooouuuurrrr àààà 33330000 ppppeeeerrrrssssoooonnnnnnnneeeessss eeeennnn mmmmooooiiiinnnnssss ddddeeee 9999 sssseeeeccccoooonnnnddddeeeessss eeeetttt 55558888 cccceeeennnnttttiiiièèèèmmmmeeeessss.... MMMMeeeerrrrcccciiii ppppoooouuuurrrr ttttoooonnnn
ddddyyyynnnnaaaammmmiiiissssmmmmeeee eeeetttt ddddeeee mmmm’’’’aaaavvvvooooiiiirrrr ssssaaaauuuuvvvvéééé llllaaaa vvvviiiieeee aaaavvvveeeecccc llllaaaa ssssoooouuuucccchhhheeee ddddeeee XXXXLLLL1111----ggggoooolllldddd !!!!
JJJJ’’’’aaaaiiii uuuunnnneeee ppppeeeennnnssssééééeeee ppppoooouuuurrrr VVVVaaaalllleeeennnnttttiiiinnnn CCCCrrrrééééppppeeeeaaaauuuu,,,, nnnnoooossss ddddiiiissssccccuuuussssssssiiiioooonnnnssss mmmmééééttttaaaapppphhhhyyyyssssiiiiqqqquuuuoooo----vvvviiiieeeettttnnnnaaaammmmoooo----rrrraaaammmmbbbbooooeeeessssqqqquuuueeee----
dddduuuubbbboooossssqqqquuuuééééeeeennnnnnnneeeessss aaaalllllllliiiiééééeeeessss àààà ddddiiiivvvveeeerrrrsssseeeessss tttteeeecccchhhhnnnniiiiqqqquuuueeeessss ddddeeee ccccoooommmmbbbbaaaatttt vvvvoooonnnntttt éééénnnnoooorrrrmmmméééémmmmeeeennnntttt mmmmeeee mmmmaaaannnnqqqquuuueeeerrrr !!!! TTTTuuuu vvvveeeerrrrrrrraaaassss qqqquuuuaaaannnndddd ttttuuuu
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«««« ggggiiiirrrroooouuuueeeetttttttteeee »»»»)))),,,, LLLLuuuucccciiiilllleeee DDDDuuuurrrraaaannnndddd ((((uuuunnnneeee ffffiiiilllllllleeee ddddeeee PPPPaaaarrrriiiissss)))),,,, MMMMaaaarrrriiiieeee RRRRoooouuuummmmaaaaggggnnnnaaaacccc ((((uuuunnnneeee ffffiiiilllllllleeee dddduuuu ssssuuuudddd)))),,,, CCCCyyyyrrrriiiieeeelllllllleeee JJJJaaaannnn ((((uuuunnnneeee
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4
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Ce travail a fait l’objet de publications et de colloques scientifiques :
PPPPuuuubbbblllliiiiccccaaaattttiiiioooonnnnssss
Benoît Castrec, Christophe Rouillon, Ghislaine Henneke, Didier Flament, Joël Querellou and
Jean-Paul Raffin. Binding to PCNA in Euryarchaeal DNA Replication Requires Two PIP
Motifs for DNA Polymerase D and One PIP Motif for DNA Polymerase B. Journal of
Molecular Biology. Sous presse
Benoît Castrec, Ghislaine Henneke, Didier Flament and Jean-Paul Raffin. The glycine-rich
motif of Pyrococcus abyssi DNA polymerase D is critical for protein stability. Journal of
Molecular Biology. Soumis
PPPPoooosssstttteeeerrrrssss
Benoît Castrec, Christophe Rouillon, Didier Flament, Ghislaine Henneke, Joël Querellou and
Jean-Paul Raffin. « Pyrococcus abyssi replicative DNA polymerases: importance of
consensus binding motifs to PabPCNA ». « Molecular Biology of Archaea » 19-21 Août
2008 à l’Université de St-Andrews, Grande-Bretagne.
Benoît Castrec, Christophe Rouillon, Didier Flament, Ghislaine Henneke, Joël Querellou et
Jean-Paul Raffin. « Interaction entre les ADN polymérases B et D et leur facteur de
processivité, le PCNA, chez l’Archaea hyperthermophile Pyrococcus abyssi ». Congrès
annuel de la SFBBM, 27-29 Août 2009 à Nancy, France.
5
6
SSSSoooommmmmmmmaaaaiiiirrrreeee
.............................................................................................................................................................11
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.................................................................................................................................................13
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.....................................................................................................................................................15
LLLLIIIISSSSTTTTEEEE DDDDEEEESSSS FFFFIIIIGGGGUUUURRRREEEESSSS
............................................................................................................17
IIIINNNNTTTTRRRROOOODDDDUUUUCCCCTTTTIIIIOOOONNNN BBBBIIIIBBBBLLLLIIIIOOOOGGGGRRRRAAAAPPPPHHHHIIIIQQQQUUUUEEEE
I. LES ARCHAEA.............................................................................................................................................19
I.1. DECOUVERTE DES ARCHAEA............................................................................................................................19
I.2. CARACTERISTIQUES DES ARCHAEA...................................................................................................................20
I.3. PHYLA DES ARCHAEA.......................................................................................................................................21
I.4. L’ORDRE DES THERMOCOCCALES.....................................................................................................................23
I.5. PYROCOCCUS ABYSSI..........................................................................................................................................24
I.6. RELATION DES ARCHAEA AVEC LES DEUX AUTRES DOMAINES DU VIVANT.......................................................25
I.7. NOTIONS DE THERMOSTABILITE........................................................................................................................26
I.8. APPLICATIONS BIOTECHNOLOGIQUES...............................................................................................................27
I.8.1. Les Divers domaines d’application..........................................................................................................27
I.8.2. Processus liés à l’ADN.............................................................................................................................28
I.8.3. Autres potentialités...................................................................................................................................29
II. LA REPLICATION DE L’ADN...................................................................................................................30
II.1. INTRODUCTION................................................................................................................................................30
II.2. LA PHASE D’INITIATION...................................................................................................................................32
II.2.1. La reconnaissance de l’origine de réplication........................................................................................32
II.2.2. Chargement et activité de l’hélicase réplicative.....................................................................................32
II.3. LA PHASE D’ELONGATION................................................................................................................................33
II.3.1. Stabilisation de l’ADN simple brin.........................................................................................................33
II.3.2. Création de l’amorce ARN......................................................................................................................34
II.3.3. Elongation...............................................................................................................................................35
II.3.4. Maturation des fragments d’Okazaki......................................................................................................35
II.4. LES ADN POLYMERASES.................................................................................................................................37
II.4.1. Distribution au sein des trois domaines du vivant..................................................................................37
II.4.2. L’ADN polymérase B..............................................................................................................................39
II.4.3. L’ADN polymérase D..............................................................................................................................40
II.5. LE RF-C (REPLICATION FACTOR C)................................................................................................................42
II.5.1. Description dans les trois domaines du vivant........................................................................................42
II.5.2. Hydrolyse de l’ATP.................................................................................................................................43
II.5.3. Interaction avec le PCNA.......................................................................................................................44
II.5.4. Autres fonctions du RF-C........................................................................................................................44
II.6. LE PCNA (PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN)....................................................................................45
II.6.1. Fonctions................................................................................................................................................45
II.6.2. Structure..................................................................................................................................................47
II.6.3. Dynamique du PCNA..............................................................................................................................48
II.6.4. Motifs d’interactions au PCNA...............................................................................................................49
II.6.5. Domaines d’interactions avec le PCNA..................................................................................................50
III. PRESENTATION DE L’ETUDE.................................................................................................................52
.......................................................................................................................55
RRRREEEESSSSUUUULLLLTTTTAAAATTTTSSSS EEEETTTT DDDDIIIISSSSCCCCUUUUSSSSSSSSIIIIOOOONNNN
CHAPITRE 1 - INTERACTIONS ENTRE LE PCNA ET LES ADN POLYMERASES B ET D...................57
I. INTRODUCTION..........................................................................................................................................59
II. ARTICLE........................................................................................................................................................61
III. RESULTATS COMPLEMENTAIRES........................................................................................................82
7
III.1. INTERACTION ENTRE LE PCNA ET LES SOUS-UNITES DE L’ADN POLYMERASE D..........................................82
III.2. INTERACTION DES ADN POLYMERASES D ET B AVEC LES PCNA MUTES EN PRESENCE DU PEPTIDE PIPD.....83
IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES..........................................................................................................86
CHAPITRE 2 - ETUDE DU COMPLEXE ADN POLYMERASE/RF-C/PCNA................................................89
I. INTRODUCTION..........................................................................................................................................91
II. RESULTATS..................................................................................................................................................92
II.1. EFFETS DU RF-C SUR L’EXTENSION D’AMORCE DES ADN POLYMERASES D ET B SAUVAGES ET ∆PIP.............92
II.2. ETUDE DES INTERACTIONS PHYSIQUES, EN PRESENCE D’ADN, ENTRE LE PCNA, LE RF-C ET LES ADN
POLYMERASES D SAUVAGE ET ∆PIP.........................................................................................................................95
II.3. EXTENSION D’AMORCE DES ADN POLYMERASES D SAUVAGE ET ∆PIP, EN PRESENCE DU PCNA ET DU RF-C
SAUVAGE OU ∆PIP...................................................................................................................................................96
II.4. ETUDE DU CHARGEMENT DU PCNA SUR L’ADN, EN PRESENCE DU RF-C OU DU RF-C∆PIP............................97
III. DISCUSSION.................................................................................................................................................99
IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES........................................................................................................102
CHAPITRE 3 - ETUDE D’UN MOTIF RICHE EN GLYCINES DE L’ADN POLYMERASE D DE
PYROCOCCUS ABYSSI..........................................................................................................................................103
I. INTRODUCTION........................................................................................................................................105
II. ARTICLE......................................................................................................................................................106
III. RESULTATS COMPLEMENTAIRES......................................................................................................127
III.1. ACTIVITE 3’→5’ EXONUCLEASIQUE DE PABPOL D, PABPOL DMUT1 ET PABPOL DMUT2............................127
III.2. INTERACTIONS FONCTIONNELLES ENTRE LES SOUS-UNITES DP1 ET DP2 : IMPORTANCE POUR L’ACTIVITE
3’→5’ EXONUCLEASIQUE......................................................................................................................................128
IV. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.....................................................................................................129
CHAPITRE 4 - TRAVAUX PRELIMINAIRES EN SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE.................131
I. INTRODUCTION........................................................................................................................................133
II. RESULTATS................................................................................................................................................134
II.1. ANISOTROPIE DE FLUORESCENCE...................................................................................................................134
II.1.1. PCNA marqué par un groupement fluorescent.....................................................................................135
II.1.2. PCNA marqué –L211C/V46C...............................................................................................................135
II.1.3. Liaison du PCNA à l’ADN L34 hybridé à différentes amorces.............................................................136
II.1.4. Liaison du PCNA à l’ADN, à différentes températures........................................................................137
II.1.5. Liaison à l’ADN du complexe PCNA/RFC...........................................................................................138
II.1.6. Liaison à l’ADN des ADN polymérases D mutées au niveau du motif PYF box...................................138
II.2. UTILISATION DU PEPTIDE PIPB......................................................................................................................139
II.3. UTILISATION D’UNE SONDE DE POLARITE : LE NILE RED...............................................................................142
III. CONCLUSION ET PERSPECTIVES........................................................................................................143
...........................................................................................................................................145
CCCCOOOONNNNCCCCLLLLUUUUSSSSIIIIOOOONNNN GGGGEEEENNNNEEEERRRRAAAALLLLEEEE
.........................................................................................................................147
MMMMAAAATTTTEEEERRRRIIIIEEEELLLLSSSS EEEETTTT MMMMEEEETTTTHHHHOOOODDDDEEEESSSS
I. TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE......................149
I.1. CULTURE D’ESCHERICHIA COLI.......................................................................................................................149
I.2. PCR................................................................................................................................................................149
I.3. EXTRACTION DE L’ADN PLASMIDIQUE...........................................................................................................149
I.4. VISUALISATION DE L’ADN PLASMIDIQUE.......................................................................................................149
I.5. COUPURE DE L’ADN PAR DES ENZYMES DE RESTRICTION...............................................................................150
I.6. CLONAGE DANS UN VECTEUR D’EXPRESSION..................................................................................................150
I.6.1. Vecteur d’expression..............................................................................................................................150
I.6.2. Préparation des inserts et des plasmides...............................................................................................150
I.6.3. Ligature du vecteur linéarisé et des inserts digérés...............................................................................151
I.7. TRANSFORMATION DANS DES CELLULES COMPETENTES.................................................................................151
8
I.7.1. Cellules de stabilisation.........................................................................................................................151
I.7.2. Cellules d’expression.............................................................................................................................151
I.8. MUTAGENESES DIRIGEES................................................................................................................................151
I.8.1. Stratégies de clonage.............................................................................................................................151
I.8.2. Conditions de PCR.................................................................................................................................155
I.9. SEQUENÇAGE DE L’ADN................................................................................................................................156
II. TECHNIQUES DE BIOCHIMIE...............................................................................................................157
II.1. TECHNIQUES DE PRODUCTION DES PROTEINES RECOMBINANTES...................................................................157
II.1.1. Expression des protéines par un système de traduction in vitro (RTS).................................................157
II.1.2. Expression des protéines recombinantes en grand volume...................................................................157
II.1.3. Expression des protéines recombinantes en petit volume.....................................................................158
II.2. PURIFICATION DES PROTEINES RECOMBINANTES...........................................................................................158
II.2.1. Purification de protéines exprimées par RTS.......................................................................................158
II.2.2. Purification des ADN polymérases.......................................................................................................160
II.3. DOSAGE DES PROTEINES................................................................................................................................166
II.4. SEPARATION ET VISUALISATION DES PROTEINES PAR ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE......167
II.4.1. Gels SDS-PAGE....................................................................................................................................167
II.4.1.1. Préparation des échantillons.............................................................................................................................167
II.4.1.2. Migration.........................................................................................................................................................167
II.4.2. Gels natifs.............................................................................................................................................167
II.4.2.1. Préparation des échantillons.............................................................................................................................167
II.4.2.2. Migration :.......................................................................................................................................................167
II.4.3. Coloration/décoloration des gels d’électrophorèse..............................................................................167
II.5. TECHNIQUE DE WESTERN BLOT....................................................................................................................168
II.6. PEPTIDES SYNTHETIQUES...............................................................................................................................168
II.7. SUBSTRATS NUCLEIQUES...............................................................................................................................169
II.7.1. Présentation..........................................................................................................................................169
II.7.2. Préparation d’une matrice d’ADN amorcée.........................................................................................170
II.8. TECHNIQUES DE SYNTHESE D’ADN...............................................................................................................171
II.8.1. Test d’activité des ADN polymérases par incorporation de [3H]dTTP................................................171
II.8.2. Réactions d’extension d’amorce...........................................................................................................172
II.8.3. Réaction 3’→5’ exonucléasique...........................................................................................................173
II.9. CAPTURES DE PARTENAIRES PAR PULL-DOWN SUR BILLES MAGNETIQUES.....................................................173
II.10. ETUDE D’INTERACTION PROTEINE-PROTEINE PAR RESONANCE PLASMONIQUE DE SURFACE (SPR)..............174
II.10.1. Principe...............................................................................................................................................174
II.10.2. Expériences réalisées..........................................................................................................................176
II.11. EMSA (ELECTROPHORESIS MOBILITY-SHIFT ASSAY).................................................................................176
II.12. ETUDE DU CHARGEMENT DU PCNA SUR UN ADN (CROSS-LINKING)..........................................................176
II.13. MESURES DE LA THERMOSTABILITE DES ADN POLYMERASES.....................................................................177
II.14. ETUDES EN FLUORESCENCE.........................................................................................................................177
II.14.1. Analyse spectrale................................................................................................................................177
II.14.2. Anisotropie d’émission de fluorescence..............................................................................................178
II.14.2.1. Principe..........................................................................................................................................................178
II.14.2.2. Expériences réalisées lors de cette étude........................................................................................................179
II.14.2.3. Traitement des données..................................................................................................................................179
II.14.3. Utilisation d’une sonde de polarité: le Nile Red.................................................................................179
II.14.4. Obtention d’un PCNA marqué par un fluorophore.............................................................................180
II.14.5. Utilisation de la fluorescence intrinsèque du peptide PIPB...............................................................180
II.15. NUMEROS D’ACCESSION AUX SEQUENCES...................................................................................................181
...........................................................................................................183
RRRREEEEFFFFEEEERRRREEEENNNNCCCCEEEESSSS BBBBIIIIBBBBLLLLIIIIOOOOGGGGRRRRAAAAPPPPHHHHIIIIQQQQUUUUEEEESSSS
...................................................................................................................................................................199
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.....................................................................................................................................................................202
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................................................................................................................................................................202
AAAABBBBSSSSTTTTRRRRAAAACCCCTTTT
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10
Description:Cette thèse a été réalisée au sein du Laboratoire de Microbiologie des . Pascal Trouvé, du laboratoire de « Génétique moléculaire et génétique.
