Les activités de glutathion-peroxydase, d'oxyde nitrique-oxydase et de dépolarisation

148 Pages·2011·3.76 MB·French

by  Paradis, Mylène

UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉAL

LES ACTIVITÉS DE GLUTATHION-PEROXYDASE, D'OXYDE NITRlQUE
­
OXYDASE ET DE DÉPOLARlSATION MEMBRANAIRE DE LA CÉRULOPLASMINE

DANS LA PROTECTION DES CARDIOMYOCYTES CONTRE LE PEROXYDE

D'HYDROGÈNE

MÉMOIRE

PRÉSENTÉ

COMME EXIGENCE PARTIELLE

DE LA MAÎTRlSE EN CHIMIE

PAR

MYLÈNE PARADIS

NOVEMBRE 2010
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉAL

Service des bibliothèques

Avertissement
La diffusion de ce mémoire se fait dans le respect des droits de son auteur, qui a signé
le formulaire Autorisation de reproduire et de diffuser un travail de recherche de cycles
supérieurs (SDU-522 - Rév.ü1-2üü6). Cette autorisation stipule que «conformément à
l'article 11 du Règlement no 8 des études de cycles supérieurs, [l'auteur] concède à
l'Université du Québec à Montréal une licence non exclusive d'utilisation et de
publication de la totalité ou d'une partie importante de [son] travail de recherche pour
des fins pédagogiques et non commerciales. Plus précisément, [l'auteur] autorise
l'Université du Québec à Montréal à reproduire, diffuser, prêter, distribuer ou vendre des
copies de [son] travail de recherche à des fins non commerciales sur quelque support
que ce soit, y compris l'Internet. Cette licence et cette autorisation n'entraînent pas une
renonciation de [la] part [de l'auteur] à [ses] droits moraux ni à [ses] droits de propriété
intellectuelle. Sauf ententè contraire, [l'auteur] conserve la liberté de diffuser et de
commercialiser ou non ce travail dont [il] possède un exemplaire.»
1
~
REMERCIEMENTS
Je remercie infiniment ma directrice de recherche, Drc Joannc Paquin, pour m'avoir
confié ce tumultueux projet qui a su nourrir mon avide curiosité scientifique. J'ai beaucoup
apprécié son approche pédagogique, son optimisme et son dévouement. Je remercie aussi
mon codirecteur, Dr Mircea-Alexandru Mateescu, pour ses conseils judicieux et, bien sûr,
pour avoir participé activement à mon intégration dans la communauté scientifique.
re
J'aimerais remercier Die Janine Mauzeroll, Dr Gwenaël Chamoulaud, D Isabelle
Marcotte, Me Denis Flipo et Mme Jacqueline Hue Tieu, pour leur précieuse aide technique et
le partage de leur expertise.
Je tiens à remercier ma prédécesseure, Me Josianne Gagné, dont la ténacité a permis
d'élaborer les techniques expérimentales quc j'ai utilisées. Je suis aussi particulièrement
reconnaissante envers mes collègues de laboratoire, Mes Frédéric Bouchard et Philippe
Ducharme, qui ont instauré une admirable cohésion sociale et fonctionnelle au laboratoire.
J'offre un merci spécial à Sharon Hard pour son précieux soutien moral et ses sages conseils
scientifiques.
Certes, je salue la bienveillance des membres de ma famille, Claude et France, Simon
et Maryse, qui ont su m'appuyer sans appréhension dans tous mes projets et mes décisions.
Enfin, je remercie le CRSNG pour le généreux financement de mon projet, ainsi que
Pharmaqam et la Fondation de l'UQÀM pour m'avoir octroyé des bourses d'études très
appréciées.
TABLE DES MATIÈRES

LISTE DES FIGURES vii

LISTE DES VIDÉOS x

LISTE DES ABRÉVIAHONS xi

RÉSUMÉ xiii

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION 1

1.1 Physiologie cardiaque 1

1.1.1 Cœur: pompe muscu laire unique 1

1.1.2 Vascularisation du cœur 3

1.1.3 Innervation du cœur 4

1.104 Conduction cardiaque 5

1.2 Organisation cellulaire cardiaque 7

1.3 Cardiomyocytes 8

1.3.1 Potentiel d'action des cellules pacemaker 9

1.3.2 Potentiel d'action des cardiomyocytes contractiles 9

1.3.3 Contraction mécanique du cardiomyocyte 11

lA Infarctus du myocarde 12

1.4.1 Ischémie 13

104.2 Reperfusion 13

1.5 Stress oxydatif 14

1.5.1 Production d'EOR 14
IV
1.5.2 Dommages cellulaires dus aux EOR 15

1.5.3 EOR et infarctus du myocarde 17

1.6 Oxyde nitrique (NO') 18

1.6.1 Propriétés chimiques du NO, 19

[,6.2 Biogénèse du NO, 22

1.6.3 Fonctions et signalisation cardiovasculaires du NO- 25

1.6.4 Maladies cardiovasculaires et NO' 28

[,6.5 Effets neuronaux du NO, 30

1.6.6 Donneurs de NO, 30

[,7 Céruloplasmine (CP) : structure et expression 31

1.7.1 Structure de la CP 32

1.7.2 Biosynthèse de la CP 34

1.7.3 Catabolisme de la CP 35

1.8 Fonctions de la CP 36

1.8.1 Ferroxydase 36

1.8.2 Amine-oxydase 38

1.8.3 Transpoli du cuivre 39

1.8.4 Action antioxydante 40

1.8.5 NO-oxydase 41

1.8.6 GSH-peroxydase 43
v
1.8.7 Cardioprotection par la CP 44

1.9 Hypothèses et objectifs de recherche 45

CHAPITRE II: THE GLUTATHIONE-ASSISTED SCAVENGING AND NITRIC OXIDE­

OXIDASE ACTIVITIES OF CERULOPLASMIN ON THE VIABILITY OF

CARDIOMYOCYTES EXPOSED TO HYDROGEN PEROXIDE (Manuscrit accepté pour

publication dans le journal Free Radical Biology and Medicine) 48

2.1 Contributions 48

2.2 Introduction 51

2.3 Materials and methods 53

2.4 Results 57

2.5 Discussion 62

2.6 Acknowledgments 66

2.7 Abbreviations 66

2.8 References 67

2.9 Figures 75

CHAPITRE III: LA CP ET LE POTENTIEL MEMBRANA1RE DANS LA

CARDIOPROTECTION 82

3.1 Stratégies 82

3.1.1 Filtration de la CP/KPi sur gel Sephadex G-25 82

3.1.2 Dosage de l'activité amine-oxydase de la CP 83

3.1.3 Dosage de l'activité ferroxydase de la CP 85
VI
3. lA Microscopie de fluorescence dynamique 86

3.2 Résultats et discussion 88

3.2.1 Liaison du K+ sur la CP 88

3.2.2 Activité amine-oxydase de la CP augmentée en présence de K+ vs Na+ ........ 91

3.2.3 Activité ferroxydase de la CP augmentée en présence de K+ vs Na+ 93

3.2A Action indéterminée de la CP sur le potentiel membranaire des

cardiomyocytes 94

3.3 Conclusions 100

CHAPITRE IV : CONCLUSION GÉNÉRALE 102

RÉFÉRENCES 103

ANNEXE A: RÉSULTATS SUPPLÉMENTAlRES RELIÉS À L'ACTIVITÉ S­
NITROSANTE DE LA CP 124

ANNEXE B : CULTURE CELLULAlRE ET BIOMATÉRIAU 130
LISTE DES FIGURES

Figure 1.1 Schéma anatomique du cœur humain 2

Figure 1.2 Artères coronaires principales 4

Figure 1.3 Contrôle nerveux de la fréquence des contractions cardiaques 5

Figure lA Système de conduction électrique cardiaque 6

Figure 1.5 Disques intercalaires 7

Figure 1.6 Potentiel d'action des cellules pacemaker 10

Figure 1.7 Potentiel des cellules contractiles cardiaques Il

Figure 1.8 Sarcomère des cardiomyocytes 12

Figure 1.9 Blocage d'une artère coronaire et ischémie 13

Figure 1.10 Peroxydation en chaîne des lipides 17

Figure 1.11 Mécanisme catalytique des NOSs menant à la formation de NO' 23

Figure 1.12 Activation de la eNOS par la bradykinine 26

Figure 1.13 Structme de différents donneurs de NO· 31

Figure 1.14 Structme de la CP 33

Figure 1.15 Compétition de l'activité ferroxydase de la CP avec la réaction de Fenton ....... 37

Figure 1.16 Activité amine-oxydase de la CP 39

Figure 1.17 Schéma hypothétique de la formation de RSNO par la CP 41

Figure 1.18 Schéma hypothétique de la formation de N02' par la CP 43

Figure 1.19 Activité GSH-peroxydase de la CP 44

Figure 2.1 Sorne aspects of NO generation and reaction 75
VIII
Figure 2.2 Nitrosating activity of CP 76

Figure 2.3 Generation ofNO+ equivalents by CP 77

Figure 2.4 Effect of incubation medium on DAN nitrosation 78

Figure 2.5 Assay of GSH-peroxidase activity of CP 79

Figure 2.6 CP, NO donors and thiols in H20r induced loss of œil viability 80

Figure 2.7 Schematical presentation of possible relationships between H20 2, thiols, NO and

CP 81

Figure 3.1 Spectre d'absorbance du produit d'oxydation de la p-PD 84

Figure 3.2 Structure moléculaire du Fluo-3 86

Figure 3.3 Sélection des régions cytoplasmiques d'intérêt 88

Figure 3.4 Courbe standard pour le dosage du K+ par spectrométrie d'émission atomique .. 89

Figure 3.5 Filtration sur gel de la CP et du K+ 90

Figure 3.6 Activité amine-oxydase de la CP dans les tampons KOAc et NaOAc 92

Figure 3.7 Activité arn.ine-oxydase de la CP dans les tampons KPi et NaPi 93

Figure 3.8 Activité ferroxydase de la CP dans les tampons KOAc et NaOAc 94

Figure 3.9 Champs optiques contenant les cardiomyocytes étudiés 95

Figure 3.10 Fluctuations de la concentration intracellulaire de Ca2+ 97

Figure 3.11 Effet de la CP sur les fluctuations de la concentration intracellulaire de Ca2" ... 98

Figure 3.12 Accumulation de Ca2 + cytoplasrn.ique et fibrillation chez les cardiomyocytes en

milieu hyperkaliémique 100
IX
Figure Al Dégradation de la CysNO, plus rapide en présence de CP 125

Figure A2 Libération variable de NO+ par la SNAP selon le tampon 126

Figure A3 Faible libération spontanée de NO+ par le GSNO, comparativement à sa

contenance en NO' 127

Figure A4 Détection immunohistochimique peu révélatrice des RSNO sur des

cardiomyocytes exposés à divers traitements 129

Figure 8 l Regroupement des cellules P 19 induit par la présence de fibroïne de soie ......... 131

Figure 82 Agrégation des MSC induite par la présence de fibroïne de soie 132

Figure 83 Marquage immunohistochimique de l'actine et de la troponine l cardiaque d'une

culture de cardiomyocytes 134