La protéine de stress Hsp27/HspB1, une cible de choix en thérapie

247 Pages·2016·6.61 MB·French

by  Benjamin Gibert

N° d’ordre 70-2010 Année 2010
THESE
Présentée devant l’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1
Pour l’obtention du
DIPLOME DE DOCTORAT
(Arrêté du 7 août 2006)
Présentée et soutenue publiquement le 25 mai 2010
Par Benjamin GIBERT
La protéine de stress Hsp27/HspB1, une cible de choix en
thérapie anti-cancéreuse
JURY
Pr André-Patrick ARRIGO
Dr Chantal DIAZ
Dr Carmen GARRIDO
Pr Germain GILLET
Dr Patrick MEHLEN
Pr Michel MORANGE
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UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
Président de l’Université M. le Professeur L. Collet
M. le Professeur J-F. Mornex
Vice-président du Conseil Scientifique
M. le Professeur G. Annat
Vice-président du Conseil d’Administration
M. le Professeur D. Simon
Vice-président du Conseil des Etudes et de la Vie Universitaire
M. G. Gay
Secrétaire Général
COMPOSANTES SANTE
Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Bernard Directeur: M. le Professeur J. Etienne
Faculté de Médecine Lyon Sud – Charles Mérieux Directeur: M. le Professeur F-N. Gilly
UFR d’Odontologie Directeur: M. le Professeur D. Bourgeois
Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Directeur: M. le Professeur F. Locher
Institut des Sciences et Techniques de Réadaptation Directeur: M. le Professeur Y. Matillon
Département de Formation et Centre de Recherche en Biologie Directeur: M. le Professeur P. Farge
Humaine
COMPOSANTES SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Faculté des Sciences et Technologies Directeur: M. Le Professeur F. Gieres
UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives Directeur: M. C. Collignon
Observatoire de Lyon Directeur: M. B. Guiderdoni
Institut des Sciences et des Techniques de l’Ingénieur de Lyon Directeur : M. le Professeur J. Lieto
Institut Universitaire de Technologie A Directeur: M. le Professeur C. Coulet
Institut Universitaire de Technologie B Directeur: M. le Professeur R. Lamartine
Institut de Science Financière et d'Assurance Directeur : M. le Professeur J-C. Augros
Institut Universitaire de Formation des Maîtres Directeur: M R. Bernard
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REMERCIEMENTS
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REMERCIEMENTS :
Je remercie les membres de mon jury d’avoir accepté d’évaluer ces travaux de thèse.
Je remercie l’ensemble du CGMC pour l’ambiance chaleureuse qui y règne. Je remercie plus
particulièrement les membres de mon équipe, nouveaux comme anciens, avec qui j’ai pu avoir
beaucoup d’interactions aussi bien professionnelles que personnelles.
Je remercie tous mes amis qui m’ont permis de vivre dans la bonne humeur ce qui n’a pas
forcement permis d’optmimiser ma carrière professionnelle.
Je remercie plus particulièrement mes parents, mon frère et ma famille qui m’ont toujours apporté
un soutien sans faille lors de mes études ou en dehors...
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SOMMAIRE
7
SOMMAIRE
REMERCIEMENTS………………………………………………………………………………4
SOMMAIRE……………………………………………………………………………………….7
ABREVIATIONS…………………………………………………………………………….......13
RESUME………………………………………………………………………………………….18
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE……………………………………………………..21
Introduction générale………………………………………………………………………22
A- Présentation des protéines de choc thermique………………………………………...23
A-1. Les protéines de stress, des protéines ubiquistes et universelles ……………………23
A-1.1. Les Hsp de haut poids moléculaire…………………………………….......23
A-1.1.1. Hsp110……………………………………………………23
A-1.1.2. Hsp90……………………………………………………..24
A-1.1.3. Hsp70……………………………………………….…….25
A-1.1.4. Hsp60 /chaperonine….………….....…...…………….......26
A-1.1.5. Hsp47……………………….…………………………….26
A-1.2. Les petites protéines de stress……………………………………...............26
A-1.2.1. HspB1/Hsp27…………………………………………….27
A-1.2.2. HspB4/αA-cristallin…………………...…………………28
A-1.2.3. HspB5/αB-cristallin…………...…………………………29
A-1.2.4. HspB8/Hsp22………………………………….…………30
A-1.2.5. Les autres membres………………………………………31
A-2. L’induction de la réponse au stress………………………………............……...….31
A-3. Les gardiennes de l’intégrité cellulaire…………………………………………...…34
A-3.1 Rôle de chaperons moléculaires…………………………………………...34
A-3.2 Bases moléculaires de la conformation protéique………………………....36
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B- Les HSP et le blocage de la mort cellulaire………………………………..………......39
B-1. L’inhibition de l’activité des récepteurs de mort……………………………………..39
B-1.1. L’apoptose……………………………………….…....…............................39
B-1.2. Les récepteurs de mort …………………………………...……….….....…40
B-1.3. Protection engendrée par les protéines de stress…………………….......…41
B-2. L’inhibition des effecteurs de la mort cellulaire……………………..........................43

B-2.1. La voie apoptotique mitochondriale……………………………...…..……43
B-2.1.1. L’apoptose mitochondriale………………......….……….43
B-2.1.2. Mécanismes moléculaires du blocage induit par les Hsp..43
B-2.2. La mort cellulaire indépendante des caspases…………………....………..46
B-2.2.1. L’autophagie…….…………………….…………………46
B-2.2.2. Maladies neuro-dégénératives et prions…………………47
B-3. Les voies de transduction des signaux ……………………………………………....48
B-3.1. La modulation de kinases ……………………………..........……….…..…48
B-3.2. Le cycle et la division cellulaire………………………………....…………49
B-3.2.1. Modulation directe du cycle cellulaire.…………………49
B-3.2.2. Hsp et mitose……………………………………………50
B-4. Les facteurs de transcription..………………………………….............…….………50
B-4.1. Le suppresseur de tumeur p53……………………..................…….………50
B-4.2. Les autres facteurs de transcription.....….........…………………….………51
C- Les HSP et la cancérisation……………………………………………………............…53
C-1. Les Hsp et l’échappement tumoral………………………………………….…….….53
C-1.1. Hsp et transformation tumorale……………………………………….........53
C-1.2. Rôle cytoprotecteur des Hsp en thérapie anti-cancéreuse……………….…54
C-1.2.1. La chimiothérapie………………………………………..54
C-1.2.2. La radiothérapie…………………………………………..55
C-1.3. Les Hsp et l’agressivité tumorale………………………………….……….55
C-1.4. Le diagnostique cancéreux…………………………………………………58
C-2. Ciblage thérapeutique des Hsp…………………………………….......…………..…58
C-2.1. L’inhibition des Hsp …………………………………….…....……………58
C-2.1.1. Les inhibiteurs chimiques de Hsp90……………………..58
C-2.1.2. Les inhibiteurs chimiques de Hsp70……………………..60
C-2.1.3. Les méthodes alternatives………………………………..61
C-2.2. Les Hsp et immunité………………………………………………….….…63
C-2.2.1. Hsp et système immunitaire………………………..….…63
C-2.2.2. Hsp et vaccination ………………………................….…63
Conclusions-perspectives…………………………………………………...........……….66
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Projets développés…………………………………………………………..................................67
MATERIEL ET METHODES…………………………………………………………...….....71
1. Double Hybride de levure………………………………………………...….................72
1.1. Vecteurs de double hybride utilisés ………….......………….............…...…..72
1.2 Transformation et conjugaison........ …………………………....…….…..…...72
1.3. Milieux utilisés et tests d’auto-activation de l’appât…………..…......………73
1.4. Crible de la banque……………………………………………………………74
1.5. Clonage des formes mutantes deHsp27……………..………………………..74
2. Culture cellulaire…………………………………………………...………………….75
2.1. Milieux de culture et lignées cellulaires……………………….....…………..75
2.2. Transfections transitoires………………………………………….....……….75
2.3. Lignées stables………………………………………………………………..75
3. Analyse de la mort cellulaire……………………………...…………………………..75
3.1. Détermination de la mort cellulaire par coloration au cristal violet…………..75
3.2. Cytométrie en flux…………………………………………….………………76
3.3. Activation des caspases exécutrices 3 et 7………………………....…………76
3.4. Mort clonogénique………………………………………………………….…76
3.5. Immunohistochimie………………………………………………………...…77
3.5.1. TUNEL………………………………………………..……………77
3.5.2. Prolifération, Ki67………………………………………….………77

4. Biologie moléculaire…………………………………………………………………..77
4.1. Western Blot…………………………………………..............................……77
4.2. Constructions de ShRNA………………………………………………..........79
4.3. Immunofluorescences……………………………………………...………….79
4.4. Chromatographie d’exclusion diffusion…………………………………........80
4.5. Co-immunoprécipitation……………...............……………………………….80
4.5.1. Sur fractions de colonne…………………………………………….80
4.5.2. Sur lysat cellulaire………….................…………………………….81
5. Expérimentation in vivo………………………………...……………………………..81
5.1. Xénogreffes……………………………….........……………………………..81
5.1.1. Etude aptamères.....………….………………………………………81
5.1.2. Tumeurs osseuses et métastases….…………………………………81
5.2. Luminométrie ………………………………...………………………..……..82
5.3. Radiographie………………………………...………………………………...82
5.4. Coupes d’organes...............................................................................................82
RESULTATS………………………………………………………………………......…………85
1. Publication 1-Hsp27 (HspB1) and alphaB-crystallin (HspB5) as therapeutic
targets…………………..…………………………………………………………………...…......87
2. Publication 2-Dynamic processes that reflect anti-apoptotic strategies set up by
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