inhibition de l'interaction de HIF-1 / ADN par des polyamides

28 Pages·2008·1.08 MB·French

Etude de HIF-1α : inhibition

de l’interaction de HIF-1 /

ADN par des polyamides

Mémoire de recherche

Charlotte SAINT-ANDRE

Arnaud GUILLIEN

Année universitaire 2007-2008

Promotion 8

1
RESUME

Grâce à la voie HIF-1, les cellules tumorales ont mis en place des mécanismes d’adaptation à
l’hypoxie. En hypoxie, HIF-1α n’est pas dégradé ce qui va lui permettre d’être transloqué, de
se dimériser avec HIF-1β, ainsi le dimère formé (HIF-1) va activer la transcription de ses
gènes cibles via l’interaction avec le HRE (Hypoxia Response Element). En effet, HIF-1 peut
ainsi activer la transcription de nombreux gènes impliqués notamment dans le développement
tumoral (VEGF pour l’angiogenèse, les cyclines pour la prolifération cellulaire ou EPO pour
l’érythropoïèse). HIF-1 représente ainsi une cible thérapeutique prometteuse pour le
développement de traitement anti-cancéreux. Cependant, dans certaines tumeurs, HIF-1 active
la transcription de gènes impliqués dans l’apoptose tels que BNIP3. Il s’agit donc d’une part
de bloquer spécifiquement la voie HIF-1, afin de ne cibler que les cellules tumorales, et
d’autre part de ne cibler que les gènes impliqués dans le développement tumoral. Pour cela,
Nickols et son équipe ont choisi d’interrompre l’interaction HIF-1/ADN grâce à l’action de
petites molécules : les polyamides. Ils ont ainsi comparé la spécificité d’action des
polyamides avec celle de l’échinomycine et du siRNA de HIF-1α. Leurs résultats montrent
que le polyamide 1 a la meilleure affinité pour la séquence HRE. En revanche, il vise un panel
de gènes plus restreint que l’échinomycine et le siRNA et n’affecte pas l’expression des gènes
de l’apoptose. A la vue de ces résultats, le polyamide 1 semble être un bon candidat pour
cibler spécifiquement la voie HIF-1. On se propose pour la suite, de tester l’efficacité de ce
polyamide sur des lignées cellulaires cancéreuses et de vérifier la toxicité sur des cellules
saines, avant de passer à de l’expérimentation animale.

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SOMMAIRE

Introduction……………………………………….……………
I. 1
1) Fonctions de HIF-1…………………………………………………………………....1
2) Structure de HIF-1………………………………………………………………..…..2
3) Mécanismes de régulation de HIF-1α………………………………………………..5
a. Dépendant de l’oxygène………………………………………………….…….5
i. Condition normoxique……………………………………………...5
ii. Condition hypoxique……………………………………….............7
b. Indépendant de l’oxygène……………………………………………………..7
4 ) HIF-1α comme cible thérapeutique…………………………………………………9

Inhibition de l’interaction HIF-1/ADN par des petites
II.
molécules…………………………………………….………...
11
1) Conception des polyamides…………………………………………………...…….11
2) Mesure de l’affinité des polyamides et de l’échinomycine…………………..……13
3) Suppression de l’expression de VEGF et FLT1 dans des conditions
hypoxiques………………………………………………………………………...…13
4) Analyse de l’expression génique……………………………………………...…….15

III. Projet de recherche…………………………………...………
19
1) Effet des polyamides in vivo sur des cellules humaines tumorales en hypoxie ou en
normoxie : U251 et Hela………………..……………………………………..…….19
a. Evaluation de la prolifération cellulaire par test colorimétrique MTT……….19
b. Evaluation de la survie cellulaire par TUNEL ……………………………….20
2) Test de demi-vie des polyamides dans le sérum……………………………..…….20
3) Test de toxicité sur cellules endothéliales humaines saines (HMEC-1) en hypoxie
ou non…………………………………………………………………………….…..21
4) Test sur le petit animal……………………………………………………………...21
Conclusion……………………………………………………….…..
22

Bibliographie…………………………………………………….…..
23
3
I. Introduction

L’oxygène est une des molécules indispensables à la survie des organismes multicellulaires.
Dans le processus de respiration cellulaire, il constitue l’accepteur final d’électrons au niveau
de la chaîne respiratoire des mitochondries et permet ainsi la synthèse d’ATP. Ce sont les
vaisseaux sanguins qui apportent aux cellules les éléments indispensables à leur croissance
tels que l’oxygène et les nutriments.
L’hypoxie est une caractéristique commune des tumeurs solides. Il s’agit d’une diminution de
la concentration en oxygène au sein de la cellule. Elle peut être chronique (lorsque l’oxygène
ne diffuse pas jusqu’aux cellules périphériques tumorales), ou aiguë (lorsqu’une
vascularisation aberrante apparaît suite au développement de la tumeur). Afin d’éviter une
nécrose des cellules périphériques induite par la privation d’oxygène et de nutriments, les
tumeurs ont mis en place des mécanismes d’adaptation à l’hypoxie.
En altitude, l’hypoxie entraîne les adaptations physiologiques suivantes : hyperventilation,
augmentation de la synthèse de l’érythropoiétine (EPO) suivie de l’activation de la synthèse
d’érythrocytes et donc de l’augmentation de la capacité de transport d’oxygène. Si l’hypoxie
persiste on observe également un phénomène d’angiogenèse. En 1992, Semenza et al. mettent
en évidence un facteur de transcription induit par l’hypoxie et capable d’interagir avec une
séquence enhancer (HRE : Hypoxia Response Element) du gène de l’EPO (Semenza et al.,
1992). Il s’agit du facteur de transcription HIF-1, protéine clé de l’adaptation à l’hypoxie. La
même équipe a ensuite purifié et caractérisé cette protéine (Wang et al,. 1995).

1) Fonctions de HIF-1

Normalement exprimé en condition d’hypoxie, il a été démontré que ce facteur est également
exprimé dans certaines conditions de normoxie comme lors de l’embryogenèse. Des souris
KO pour le gène HIF-1 ont été réalisées. Ces KO présentent un phénotype embryonnaire-létal
(Ryan et al., 1998). HIF-1 active la transcription de plus de 70 gènes, favorisant notamment
la croissance de la tumeur, tels que des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire
(cyclines), dans le métabolisme du glucose (glut-1), dans l’angiogenèse (VEGF) ou
l’érythropoïèse (EPO) (Feldser et al., 1999 ; Gleadle & Ratcliffe, 1997 ; Forsythe et al.,
1996 ; Jiang et al., 1996). HIF-1 constitue ainsi une cible thérapeutique intéressante.
Cependant, dans certains types de tumeurs, HIF-1 a un effet anti-prolifératif en activant la
transcription de gènes de l’apoptose (Bruik, 2000).
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2) Structure de HIF-1

HIF-1 est une protéine hétérodimérique constituée de 2 sous-unités : HIF-1α (120 kDa) et
HIF-1β (Wang et al., 1995). Ces dernières appartiennent à la famille des protéines à domaine
PAS pour Per-ARNT-Sim, du nom des trois premières protéines identifiées contenant ce
motif structural (Figure 1). Le domaine PAS est constitué de 2 sous-unités homologues A et
B impliquées dans la dimérisation, quant au domaine bHLH (basic Helix-Loop-Helix), il est
impliqué dans l’interaction avec l’ADN ainsi que dans la formation de l’hétérodimère entre
les sous-unités HIF-1α et HIF-1β. Les 2 sous-unités possèdent 2 séquences de localisation
nucléaire chacune (NLS) et des domaines de transactivation (TAD) (Jiang et al., 1997).
HIF-1β, également connue sous le nom de ARNT (Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator),
est une protéine nucléaire exprimée de façon constitutive. En revanche, HIF-1α contient un
domaine ODD (Oxygen-Dependant-Degradation) qui permet de réguler sa stabilité en
hypoxie à travers l’hydroxylation de deux prolines (P402 et P564) et l’hydroxylation d’une
lysine (K532) (Pugh et al., 1997). Elle est adressée au protéasome et dégradée en condition
normoxique, alors qu’en hypoxie elle est transloquée vers le noyau où elle se dimérise avec
HIF-1β pour activer la transcription des gènes cibles (Figure 2).
Il existe 2 autres membres dans la famille de HIF-1α : HIF-2α et HIF-3α. HIF-2α partage 48%
d’identité de séquence en acides aminés avec HIF-1α et possède des similarités biochimiques
et structurales avec HIF-1α (hétérodimérisation avec HIF-1β et fixation sur le HRE). HIF-2α
est exprimée principalement dans les cellules endothéliales des tissus vasculaires tels que les
poumons, les reins et le cœur (Talks et al., 2000). HIF-3α, facteur dont l’activité est mal
connue, a une organisation structurale semblable aux deux autres sous-unités α (Makino et
al., 2002).
Les expressions tissulaires de HIF-2α et HIF-3α sont plus restreintes que celle de HIF-1α
exprimée de façon ubiquitaire. Le facteur de transcription HIF-1α est de ce fait le plus étudié
(Semenza, 2000).

5
HIF-1α

N N
L L
S S
T T
bHLH
A A
PAS ODD
D D

HIF-1
β

N N

L L
S S
bHLH
T
PAS
A
D

Figure 1 : Structures de HIF-1α et HIF-1β. bHLH : basic Helix-Loop-Helix. TAD:
Transactivation Domain. PAS : Per-ARH-ARNT-Sim, domaine constitué de 2 sous-unités
homologues internes A et B. NLS : Nuclear Localization Domain. La sous-unité HIF-1α (826
acides aminés) est une protéine de 120 kDa qui fait l’objet d’une dégradation en normoxie et
d’une stabilisation en hypoxie via son domaine ODD. La sous-unité HIF-1β ou ARNT (aryl
hydrocarbon nuclear receptor translocator) ne possédant pas de domaine ODD est une
protéine nucléaire exprimée de façon constitutive. Il existe 2 isoformes de HIF-1β (774 et 789
acides aminés c’est-à-dire respectivement 92 et 94 kDa).

Figure 2 : Structure détaillée du gène de HIF-1α. ODDD : Oxygen Dependant Degradation
Domain. TAD : Transactivation Domain. NLS : Nuclear Localization Signal. Le gène codant
pour HIF-1α code chez l’homme pour un ARNm comprenant 15 exons et une protéine de 826
acides aminés (aa.). Les domaines bHLH (17-30 aa.) et PAS (85-298 aa.) permettent la
formation de l’hétérodimère HIF-1α et HIF-1β, et la fixation sur les HRE (hypoxia response
elements, 5’(A/G)CGTG 3’) des gènes cibles. Le domaine PAS est divisé en 2 sous-
domaines, PAS-A (85-158 aa.) and PAS-B (228-298 aa.). HIF-1α fait l’objet de régulation
O -dépendante via des modifications post-traductionnelles sur son domaine ODDD (P402,
2
K532 et P564). Le domaine ODD (401-603 aa.) contenant le N-TAD contrôle la dégradation
de HIF-1α par la voie ubiquitine/protéasome. Le domaine de transactivation (C-TAD) permet
le recrutement de coactivateurs et l’activation de la transcription des gènes cibles. Les signaux
de localisation nucléaire (NLSs) sont situés en N-terminal (17-74 aa.) and C-terminal (718-
721 aa.) de HIF-1α. Le C-NLS est crucial dans l’importation nucléaire de HIF-1α.
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Figure 3 : Régulation de la transactivation et de la stabilisation HIF-1α dépendante de
l’oxygène. En normoxie (à gauche), deux résidus prolines de HIF-1α (P402 et P564) et
l’asparagine (N803) sont hydroxylés respectivement par les PHDs et FIH-1. Ces
modifications post traductionnelles sont dépendantes de la concentration en fer, 2-
oxoglutarate et oxygène. Les protéines HIF-1α hydroxylées vont se fixer au complexe VHL-
E3 ubiquitine ligase menant à leur dégradation par le protéasome. L’acétylation de la lysine
(K532) par ARD1 favorise l’interaction de HIF-1α avec VHL. D’autre part, le recrutement
des coactivateurs comme CBP/p300 est bloqué par l’hydroxylation de N803. En hypoxie (à
droite), les activités des PHDs et de FIH-1 sont inhibées à cause du manque d’oxygène. Ainsi
les prolines et l’asparagine ne seront pas hydroxylées. Donc VHL n’est plus fixée et HIF-1α
est stabilisée. Les protéines HIF-1α stabilisées vont être transloquées dans le noyau et vont se
fixer à HIF-1β. Comme N803 n’est plus hydroxylée, les coactivateurs CBP/p300 vont être
recrutés. L’hétérodimère va se fixer sur une séquence spécifique (HRE) et induire la
transcription des gènes cibles. 2-OG (2-OxoGlutarate), ARD1 (ADP-Ribosylation factor Domain 1), CBP
(CREB Binding Protein), FIH-1 (Factor Inhibiting HIF-1), HIF (Hypoxia-Inducible Factor), HRE (Hypoxia
Response Element), PHD (Prolyl-4-Hydroxylase Domain), Ub (Ubiquitin), VHL (Von Hippel-Lindau)
7
3) Mécanismes de régulation de HIF-1α

a. Dépendant de l’oxygène : Figure 3

i. Condition normoxique

La protéine HIF-1α va être prise en charge par les prolyl hydroxylases (Bruik et al., 2001).
Cette famille d’enzymes contient 3 membres : PHD1 (Prolyl-4-Hydroxylase Domain 1),
PHD2 et PHD3 (Epstein et al., 2001). L’expression de HIF-1α est régulée par les PHDs qui
sont elles même dépendantes de l’oxygène et du fer pour leur activité (Epstein et al., 2001).
HIF-1α va être hydroxylée sur 2 prolines (P) contenues dans le domaine ODD : P402 et P564
(Ivan et al., 2001, Jaakkola et al., 2001). D’autre part, une acétylation sur la lysine (K)
présente dans ODDD en position 532 par la protéine ARD1 (ADP-Ribosylation factor
Domain 1) a été démontrée (Jeong et al., 2002). Ces modifications post-traductionnelles vont
permettre le recrutement de la protéine suppresseur de tumeurs VHL (Von Hippel-Lindau,
Maxwell et al., 1999). VHL fait partie du complexe multiprotéique E3 ubiquitine ligase. HIF-
1α va donc être polyubiquitinylée et sera dégradée très rapidement par le protéasome 26S
(Kallio et al., 1999). La durée de demi-vie de la protéine HIF-1α est inférieure à 5 minutes en
normoxie (Chun et al., 2002).
Les protéines HIF-1α échappant à la dégradation par le protéasome vont être régulées par
l’action d’une seconde enzyme appelée FIH (Factor Inhibiting HIF-1, Mahon 2001, Lando et
al., 2002a). FIH, tout comme les PHDs, utilise l’oxygène comme substrat. HIF-1α va être
hydroxylée sur une asparagine (N) contenue dans le domaine de transactivation (TAD) C-
terminal : N803 (Lando et al., 2002b). HIF-1α va être transloquée dans le noyau via une
protéine chaperonne appelée Hsp90 (Minet et al., 1999). HIF-1α va interagir avec HIF-1β,
l’hétérodimère HIF-1 ainsi formé va se fixer sur une séquence consensus 5’-(A/G)CGTG-3’
du gène cible appelé HRE (Hypoxia Response Element, Semenza et al., 1996). Comme on a
une hydroxylation de N803, les protéines co-activatrices transcriptionnelles p300/CBP ne
vont pas pouvoir interagir avec HIF-1α (Lando et al., 2002a). En condition normoxique, les
PHDs et la FIH, détecteurs d’oxygène, permettent donc de verrouiller la transcription des
gènes cibles de HIF-1.

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Figure 4 : Régulation indépendante de l’oxygène de la synthèse protéique de HIF-1α.
Les facteurs de croissance se lient à leurs récepteurs spécifiques qui ont une activité tyrosine
kinase. Ils vont permettre l’activation des voies de signalisation de la PI3K
(phosphatidylinositol-3-kinase) et/ou des MAPK(mitogen-activated protein kinases). PI3K va
activer par phosphorylation AKT (protéine kinase B) qui elle même va activer mTOR

(mammalian target of rapamycin). Dans la voie des MAPK, ERK est activée en amont par la
MAP/ERK (MEK). A son tour, ERK va phosphoryler MNK. ERK et mTOR phosphorylent la
p70 S6K. Cette dernière phosphoryle la protéine ribosomale S6 entraînant ainsi l’activation
d’eIF-4E (eukaryotic translation initiation factor S6 protein). D’autre part, ERK et mTOR
vont inhiber la protéine 4E-BPI, l’empêchant ainsi de se lier à eIF-4E. Lorsque 4E-BPI se lie
à eIF-4E, elle l’inactive et prévient la traduction cap-dépendante des ARNm. MNK
phosphoryle eIF-4E et stimule directement son activité. L’effet de l’activation de ces voies de
signalisation sous la dépendance de facteurs de croissance est une augmentation de la vitesse
de traduction d’un ensemble d’ARNm dont fait partie l’ARNm de HIF1-α. La protéine est
produite en plus grandes quantités que ne peut en dégrader le système VHL-E3 ubiquitine
ligase-protéasome. Elle s’accumule, gagne le noyau, s’associe avec HIF1-β et va ainsi
pouvoir transactiver ses gènes cibles.
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ii. Condition hypoxique

Dans des conditions hypoxiques, l’action des PHDs et de la FIH qui utilisent l’oxygène
comme substrat sont diminuées voire inhibées. Ainsi les régulations post-traductionnelles
(hydroxylations) de HIF-1α ne sont plus réalisées et VHL ne se fixe plus. HIF-1α ne va donc
plus être dégradée par le protéasome. Il va être transloqué dans le noyau via Hsp90.
L’hétérodimère HIF-1α / HIF-1β va se fixer sur le HRE dans le promoteur des gènes cibles.
Les co-activateurs tels que CBP/p300 (CREB-Binding Protein) vont pouvoir être recrutés et
activer la transcription du gène cible.
Une balance est donc créée entre la stabilisation et la dégradation des protéines HIF-1α dans
les cellules humaines.

b. Indépendant de l’oxygène

Cette régulation est basée sur la stimulation de la croissance cellulaire par des facteurs de
croissance qui permettent l’augmentation de la quantité de protéines HIF-1α (Figure 4). La
régulation de l’expression de HIF-1 par les facteurs de croissance a été démontrée pour la
première fois dans des cellules cancéreuses de prostate, dans lesquelles HIF-1 est exprimé de
façon constitutive même dans des conditions de normoxie (Zhong et al., 1998). On peut citer,
parmi les facteurs de croissance ayant un tel effet, IGF-1 (Insulin-like Growth Factor), IL-1
(InterLeukin-1) et EGF (Epidermal Growth Factor) (Fukuda et al., 2002 ; Stiehl et al., 2002 ;
Jiang et al., 2001).
Lorsqu’un de ces facteurs de croissance se fixe sur son récepteur tyrosine kinase, une ou des
voies de signalisation vont être activées : la voie PI3K (Phosphatidylinositol-3-Kinase) ou/et
de la voie des MAP kinases (Mitogen-Actived Protein kinases). L’activation de l’une ou
l’autre de ces deux voies entrainera l’inhibition de la protéine 4E-BPI et l’activation de eIF-
4E (facteur d’initiation de la traduction). La traduction de l’ARNm de HIF-1α est augmentée,
engendrant une accumulation de protéines HIF-1α. La quantité de protéines HIF-1α est telle
que le système de dégradation VHL-E3 ubiquitine ligase-protéasome est surpassé. Par
conséquent, HIF-1α est transloquée dans le noyau et va activer la transcription des gènes
cibles (Forsythe et al., 1996).

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