III.Allgemeiner Teil III.2.5. Umsatzbestimmung der enzymatischen Synthese von Glutaryl-7-ACA ...

256 Pages·2006·2.62 MB·German

by  Peter Grundmann

III.Allgemeiner Teil
III.2.5. Umsatzbestimmung der enzymatischen Synthese von Glutaryl-7-ACA
Die von Hydrolasen vermittelten Reaktionen sind in der Regel reversible Gleichgewichtssysteme.
Da Wasser als Solvens meist in erheblichem Überschuß vorliegt, ist die hydrolytische Spaltung von
Bindungen formal der thermodynamisch dominierende Prozeß. Wird der Wassergehalt des
Reaktionssystems erniedrigt, so verschiebt sich die Gleichgewichtslage zur Produktseite. Der
Wechsel des Reaktionsmediums von Wasser zu einem organischen Lösungsmittel bringt eine Reihe
von Veränderungen mit sich, welche meist zu einer Verminderung der Enzymaktivität führen [120].
Diese rühren her von einer Änderung der Dielektrizitätskonstante, einem Wechsel des pH-Profils,
kompetitiver Inhibition der Solvensmoleküle, der Stabilisierung von Wasserstoffbrückenbindungen
etc., was teilweise durch geeignete Maßnahmen kompensiert werden kann [279]. Der Wechsel des
Reaktionsmediums kann aber auch zur Katalyse von Reaktionen führen, die im nativen Milieu nicht
beobachtet werden [119]. So katalysieren etwa die Proteasen Subtilisin und α-Chymotrypsin auch
eine regio- und stereoselektive Umesterung bestimmter Substrate [53],[280].
Die Lösungsmitteltoleranz der GA wurde anhand der PNA-Freisetzung aus Gl-PNA 69 in Wasser-
Lösungsmittel-Gemischen (2 mM) ermittelt. Dabei zeigte sich, daß die GA gegenüber geringen
Mengen der meisten verwendeten Lösungsmittel tolerant ist, jedoch tritt bei Benzylalkohol, n-
Butanol und Pyridin in jedem untersuchten Mischungsverhältnis Denaturierung ein.
Tab. 50. GA-Aktivität in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen, Anteil in (v/v)
Lösungsmittel Lösungsmittelanteil Lösungsmittel Lösungsmittelanteil
10% 30% 50% 10% 30% 50%
Methanol ++ + - Pyridin - - -
Ethanol ++ + - DMF ++ - -
n-Propanol ++ - - N-Methylformamid ++ + -
n-Butanol - - - Formamid ++ - -
i-Propanol ++ - - DMSO ++ ++ -
sek.-Butanol ++ - - Aceton ++ - -
tert.-Butanol ++ ++ - Tetrahydrofuran ++ - -
Benzylalkohol - - - 1,4-Dioxan ++ - -
Ethylenglykol ++ ++ ++ 2-Methoxy-ethanol ++ ++ -
1,2-Propandiol + + + 1,2-Dimethoxy-ethan ++ + -
1,4-Butandiol + + + Acetonitril ++ - -
++ : intensive Gelbfärbung nach 1 h; + : Gelbfärbung nach 1 h; - : keine Gelbfärbung
Zur Ermittlung des Synthese-Potentials der Glutaryl-Acylase wurde die Acylierung von 7-ACA 17
126
III.Allgemeiner Teil
mit verschiedenen Enzympräparationen, Acyldonoren und in unterschiedlichen Reaktionsmedien
untersucht.
O O
H2N S
O O GA HO NH S
+ N OAc
RO X O N OAc
CO2H O
17 18 CO2H
Abb. 123. Enzymatische Synthese von Gl-7-ACA
Während Lipasen und Proteasen in freier Form in organischen Lösungsmitteln aktiv sind [53], wird
die freie PGA durch diese desaktiviert. In immobilisierter Form, als quervernetzte Enzymaggregate
[59] oder als Lyophilisat in Salzen [281] ist sie jedoch auch in organischen Medien aktiv. Durch die
strukturelle Verwandtschaft von PGA und GA war für Letztere ein ähnliches Verhalten zu erwarten.
Studien zur Enzymstabilität unter Prozeßbedingungen zeigen, daß bei pH 7.8 die Halbwertszeit der
PGA mit 108 s (~ 3 Jahre) um zwei Größenordnungen höher liegt als bei der GA mit 106 s. Während
für die GA dieser Wert beim Übergang zu pH 9.0 nur geringfügig abfällt, weist die PGA nur noch
eine Halbwertszeit von 104 s (< 1 Tag) auf [282],[283].
III.2.5.1. Synthesepotential in organischen Lösungsmitteln
Die Untersuchung des Synthesepotentials der GA in organischen Lösungsmitteln wurde
exemplarisch mit DMSO, DMF, Pyridin, Toluol, 1,4-Butandiol, Formamid und Methylformamid
als Reaktionsmedium untersucht, da diese bereits in Protease- und PGA-katalysierten Acylierungen
erfolgreich verwendet wurden [53],[57]. Als Acyldonoren wurden Glutarsäuremonomethylester
(312), Glutarsäure-2,2,2-trifluorethylester (313), Glutarsäuremonoamid (264) und
Glutarsäuredimethylester (388) getestet.
O O O O
F
HO OMe HO O
312 313 F
F
O O O O
HO NH MeO OMe
2
264 388
Abb. 124. Verwendete Acyldonoren
Trifluorethanol als Abgangsgruppe hat sich aufgrund seiner hohen Flüchtigkeit und der dadurch
bedingten irreversiblen Gleichgewichtsverschiebung in enzymatischen Acylierungen bewährt [284].
Die GA wurde in Natriumphosphatpuffer bei pH 8.0 gelöst und lyophilisiert, um den
Ionisationsstatus am pH-Optimum zu erhalten [281]. Als Referenz wurde die gleiche Menge
127
III.Allgemeiner Teil
Albumin aus Rinderserum ebenfalls in Puffer gelöst und lyophilisiert.
Die Proteinlyophilisate und 7-ACA 17 wurden in den jeweiligen Solventien aufgenommen und mit
vier Äquivalenten (bezogen auf 7-ACA) Glutarsäuremonomethylester (312) bzw. Glutarsäure-
2,2,2-trifluorethylester (313) bei Raumtemperatur inkubiert. Der Reaktionsfortschritt wurde
dünnschichtchromatographisch verfolgt.
Für DMSO, DMF, Pyridin, Formamid und Methylformamid zeigte sich, daß die Acylierung von 7-
ACA mit beiden Acyldonoren sowohl in den GA- als auch in den Referenzproben in
vergleichbarem Maße erfolgte, während in Toluol und 1,4-Butandiol keinerlei Acyltransfer zu
detektieren war. Um die Möglichkeit eines basisch katalysierten Acyltransfers zu minimieren,
wurde das Experiment mit bei pH 7.0 lyophilisierten Proteinen wiederholt. Auch hier zeigte sich die
unselektive Acylierung von 7-ACA 17 in GA- und Referenzproben.
Die Verwendung von Glutarsäuremonoamid 264 als Acyldonor mit bei pH 8.0 lyophilisierten
Proteinen und einem proteinfreien Lyophilisat resultierte ebenfalls nicht in einer selektiven
Transaminierung durch die GA. So bleibt zu vermuten, daß der Acyltransfer in den stark polaren
Lösungsmitteln durch die hohe Salzkonzentration an basischen Phosphationen katalysiert wurde.
Zur Eliminierung des Phosphat-Einflusses wurde auf eine kommerziell verfügbare immobilisierte
GA-Präparation zurückgegriffen, bei der als Trägermaterial Eupergit C dient, ein Kopolymer
verschiedener Meth- und Acrylamide. Die immobilisierte GA wurde zunächst mit dem jeweiligen
Lösungsmittel äquilibriert und dann zu einer Mischung von 7-ACA 17 (1 Äq.) und
Glutarsäuremonoamid 264 (4 Äq.) im entsprechenden Lösungsmittel dazu gegeben. Als Referenz
dienten mit reinem Rinderalbumin versetzte Proben. Der Reaktionsfortschritt bei 30°C wurde
mittels HPLC verfolgt.
In den Ansätzen mit Toluol, Pyridin und 1,4-Butandiol als Reaktionsmedium sowie allen
Negativkontrollen konnte keinerlei Syntheseprodukt Gl-7-ACA nachgewiesen werden. Für die
übrigen Reaktionsmedien ist der ermittelte Umsatzverlauf im Folgenden graphisch dargestellt.
128
III.Allgemeiner Teil
30
%] 25
A [ Formamid
C
A 20 Methylformaid
7- DMF
Gl- DMSO
s 15
e
ert
si
eti 10
h
nt
y
S 5
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Zeit [h]
Abb. 125. Verlauf der enzymatischen Acylierung von 7-ACA
Während für DMSO und DMF nur eine geringe Syntheseleistung detektiert wurde, die insgesamt
3% Umsatz nicht übersteigt, so konnte für die Umsetzungen in Formamid und Methylformamid
eine signifikante Menge synthetisierte Gl-7-ACA 18 nachgewiesen werden. Dieser Befund
korreliert mit der Fähigkeit des jeweiligen Lösungsmittels, Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden
zu können. Dies resultiert in einer höheren Flexibilität und damit Aktivität der GA [120].
Die Untersuchung der Syntheseleistung der GA bei der Verwendung von Glutarsäuredimethylester
388 als Acyldonor erfolgte ohne den Zusatz von weiteren Lösungsmitteln. Der Acyldonor ist
zugleich Reaktionsmedium und steht damit nominal im zwanzigfachen Überschuß der
Acylierungsreaktion zur Verfügung. Tatsächlich fungiert jedoch nicht Glutarsäuredimethylester
selbst als Donor, sondern der geringe Anteil an Glutarsäuremonomethylester (312), der durch
unselektive chemische Hydrolyse freigesetzt wird. Die GA wurde jeweils in immobilisierter Form
und als Lyophilisat (pH 8.0) der Suspension von 7-ACA 17 in Glutarsäuredimethylester (388)
zugesetzt. Als Referenzen dienten wiederum entsprechende Albuminpräparationen. Nach 29
Stunden bei Raumtemperatur enthielten die Reaktionsmischungen 4.6% und 1.2% Gl-7-ACA 18,
während in den Referenzproben keine Produktbildung beobachtet werden konnte. Dieser Befund
deckt sich mit den Beobachtungen von Biffi [lit. Gardossi], die in Glutarsäuredimethylester (388)
als Reaktionsmedium die Acylierung von -Aminosäureestern durch die immobilisierte GA von
L
Recordati fanden. Zugleiche zeigt sich auch, daß die GA durch Lyophilisation in Puffern keine
vollständige Desaktivierung erfährt.
129
III.Allgemeiner Teil
III.2.5.2. Synthesepotential in wäßrigen Reaktionsmedien
Die Umkehr der enzymatischen Hydrolyse, d.h. Die kinetisch kontrollierte Synthese in wäßrigen
Medien, ist Thema zahlreicher enzymologischer Studien. In ihrem natürlichen Umgebungsmedium
entfalten Biokatalysatoren ihre höchste Aktivität und es bedarf keiner zusätzlichen Vorkehrungen,
diese zu erhalten. Seit der Entdeckung der enzymatischen Acylierung von 6-APA [285] war speziell
die Synthese von Antibiotika in wäßrigen Medien Gegenstand umfangreicher
Forschungsbemühungen, die schließlich in der erfolgreichen Kommerzialisierung
biotechnologischer Prozesse mündeten. Im Rahmen von kontinuierlichen Bemühungen zur
industriellen Prozeßoptimierungen werden diese weiterhin betrieben [286],[287].
Da die direkte Kondensation von Säure und Amin thermodynamisch äußerst ungünstig ist, erfolgt
die Synthese der Amidbindung durch Acyltransfer mit aktivierten Acyldonoren. Dieser Prozeß wird
von kinetischen und thermodynamischen Faktoren bestimmt. Wasser als Reaktionsmedium
konkurriert mit dem zu acylierenden Nucleophil um den Acyldonor und das acylierte Nucleophil
wird wiederum selbst hydrolysiert. So erfolgt die Produktakkumulation bis zu einem vom
Reaktionssystem bestimmten Maximalwert, um danach durch Produkthydrolyse wieder abzufallen
[288]. Durch eine Reihe von Maßnahmen kann die Produktanreicherung aber nahezu quantitativ
erfolgen und die konkurrierende Hydrolyse weitestgehend unterbunden werden [286].
Die Untersuchung des Synthesepotentials der GA in wäßrigem Medium erfolgte durch Inkubation
von 7-ACA 17 mit unterschiedlichen Mengen an Glutarsäuremonoamid (264) als Acyldonor bei pH
8.0 und Raumtemperatur. Die ermittelten Umsatzwerte sind im Folgenden graphisch
wiedergegeben.
25
20
%]
A [
C
A 15
7-
Gl-
s
e
ert 10
si
eti
h 7.9 Äq. Gl-Monoamid
ynt 5 13.2 Äq. Gl-Monoamid
S
2.5 Äq. Gl-Monoamid
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 180
Zeit [min]
Abb. 126. Gl-7-ACA Synthese in Wasser
130
III.Allgemeiner Teil
Bei der Umsetzung mit 2.5 und 7.9 Äquivalenten Glutarsäuremonoamid (264) erreicht die
Produktkonzentration nach kurzer Zeit jeweils ein Maximum, um danach durch Hydrolyse des
gebildeten Gl-7-ACA 18 rasch wieder abzunehmen. In Gegenwart von 13.2 Äquivalenten
Acyldonor 264 erreicht die Produktkonzentration sehr schnell ihren Maximalwert von circa 20%,
verbleibt aber dann längere Zeit auf diesem Niveau. Die scheinbare weitere Zunahme bei längeren
Reaktionszeiten beruht auf einer Abnahme der 7-ACA-Konzentration durch Hydrolyse zu Deacetyl-
7-ACA (389) (HACA).
O O
H2N S
O O GA HO NH S
+ N OAc
HO NH2 O N OAc
264 CO2H O
17 CO H
2
Gl-7-ACA 18
GA OH-
H2N S
O O
N OH
HO OH O
25
CO H
2
HACA 389
Abb. 127. Synthese von Gl-7-ACA in wäßrigen Medien
Die ausbleibende Abnahme der Gl-7-ACA-Konzentration könnte – neben einer sich
kompensierenden Synthese/Hydrolyse-Situation auf Produktinhibition zurückzuführen sein.
Letztere resultiert aus der fortschreitenden Hydrolyse von Glutarsäuremonoamid (264) zu
Glutarsäure (25), deren zunehmende Konzentration für eine Blockierung der Glutarylbindetasche
des Enzyms sorgt. Die Ausgangskonzentrationen der Edukte betrugen 58 mmol/L für 7-ACA, sowie
153 mmol/L, 458 mmol/L und 763 mmol/L für Glutarsäuremonoamid.
III.2.6. Zusammenfassende Betrachtung
Umsatz und Selektivität von GA-katalysierten Reaktionen konnten mit einer Reihe
unterschiedlicher Analysemethoden bestimmt werden, wobei eine Fokussierung auf
kernresonanzspektroskopische und HPLC-Methoden nahe lag. Die Etablierung eines
azokupplungsbasierten Aktivitätsassays war aufgrund verschiedener Faktoren wenig erfolgreich.
Ein Vergleich der unabhängig voneinander angewendeten Methoden untereinander zeigt eine gute
Korrelation der erhaltenen Ergebnisse, so etwa bei der Umsatzbestimmung der Hydrolyse von N-
Acyl-p-nitroaniliden parallel mittels UV/vis-Spektrometrie und HPLC oder der Ermittlung der
Enantioselektivität der Hydrolyse von 168, 283 und 239 parallel mittels Kernresonanzspektroskopie
131
III.Allgemeiner Teil
und HPLC. Die für Umsatz- und Selektivitätsbestimmung entwickelten HPLC-Methoden
vereinfachen und verkürzen die Analysen im Vergleich zu literaturbekannten Methoden und sind
zudem flexibel in ihrer Übertragung auf zukünftige analytische Herausforderungen.
(-)-Chinin wurde erstmalig erfolgreich zur Ermittlung von Enantiomerenverhältnissen von
Aminosäurederivaten eingesetzt.
Bei der Hydrolyse von chiralen Glutarylamiden zeigt die GA eine Enantiopräferenz für die, auf die
Substituentengröße bezogene, (R)-Konfiguration. Das Reaktionsmedium hat erheblichen Einfluß
auf das Ausmaß der Enantiodifferenzierung, ebenso wie die Präsenz von α-ständigen
Oxyfunktionalitäten. Am Beispiel des Phenylglycinols wurde eine präparative kinetische
Racematspaltung durchgeführt und (S)-Phenylglycinol mit 94% ee erhalten.
In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß die GA in polaren aprotischen
Lösungsmitteln mittels Acyltransfer Gl-7-ACA 18 synthetisiert, und auch in Wasser ein kinetisch
kontrollierter enzymatischer Acyltransfer durch die GA erfolgt.
132
III.Allgemeiner Teil
III.3. Vergleich der Glutaryl-Acylasen verschiedener Hersteller
Enzyme identischer E.C.-Klassifizierung stammen oftmals aus unterschiedlichen
Ursprungsorganismen und weisen daher meist eine unterschiedliche Aktivität und Selektivität bei
der Umsetzung des gleichen Substrats auf. Unter Anderem wurde dies auch am Beispiel der
Penicillin G-Acylasen aus E. coli und Alcaligenes faecalis experimentell demonstriert [46]. Die
ermittelten Daten wiederum wurden im Rahmen eines Homologiemodellings berücksichtigt,
welches illustrierte, daß trotz großer Übereinstimmungen in Sequenz und Struktur der Austausch
weniger Aminosäuren zu stark veränderten Eigenschaften führen kann [31].
Wegen der strukturellen Verwandschaft von PGA und GA ist eine ähnliche Tendenz prinzipiell
auch für solche Glutaryl-Acylasen zu erwarten, die von unterschiedlichen Herstellern in der
biotechnologischen Produktion von 7-ACA verwendet werden. Als eine Kooperation mit Prof. Dr.
S. Riva am ICRM Milano konnten im Rahmen dieser Dissertation vergleichende Untersuchungen
mit den von Recordati und von Roche produzierten Glutaryl-Acylasen durchgeführt werden. Diese
befaßten sich vor allem mit der Ermittlung der Anfangshydrolysegeschwindigkeiten für eine Reihe
verschiedener Substrattypen.
Beide Enzyme werden durch Fermentation aus rekombinanten Stämmen von E. coli gewonnen,
wobei allerdings der Ursprungsorganismus des jeweils für die GA codierenden Gens von den
Herstellern leider nicht offengelegt wurde. Eine Gelelektrophorese zeigt, daß beide Enzyme αβ-
Heterodimere mit praktisch identischen Molekulargewichten sind.
Abb. 128. SDS-PAGE der Glutaryl-Acylasen
133
III.Allgemeiner Teil
III.3.1. Bestimmung der Anfangshydrolysegeschwindigkeit verschiedener Substrate
Die Ermittlung der Anfangshydrolysegeschwindigkeit erfolgt durch Titration der durch die GA
freigesetzten Glutarsäure. Da die enzymatische Hydrolyse der Michaelis-Menten-Kinetik folgt,
erlaubt die festgestellte Hydrolyserate eine quantitative Aussage über die Qualität des Substrats.
Hierzu wurde eine 50 mM wäßrige Lösung des Substrats bei pH 8.0 mit der GA versetzt und der
Verbrauch an Titrationsmedium zur Aufrechterhaltung des pH-Werts über einen Zeitraum von 10
oder 20 Minuten bestimmt [74]. Die erhaltene Hydrolyserate wurde in Relation gesetzt zu der
Hydrolyserate, die aus dem Verbrauch an Titrationsmedium bei der Hydrolyse von Gl-7-ACA 18
ermittelt wurde. Aufgrund der erheblichen Auswirkung von Umwelteinflüssen auf die Titration war
eine Kalibration durch Umsetzung von Gl-7-ACA 18 zu Beginn und Ende jeden eines Meßtages
auszuführen.
III.3.1.1. Hydrolyserate verschiedener N-Acyl-7-aminocephalosporansäurederivate
Bei der Hydrolyse von im Acylteil verschieden substituierten Gl-7-ACA-Derivaten zeigten sich mit
einer Ausnahme nur relativ geringe Unterschiede zwischen den beiden Enzymen. Das Diglykolyl-
Derivat 310 wurde von der Recordati-GA wesentlich langsamer hydrolysiert als durch die Roche-
GA. Da das homologe Thiodiglykolyl-Derivat 309 von beiden Enzymen mit nahezu der gleichen
Geschwindigkeit umgesetzt wird wie Gl-7-ACA 18, muß die verminderte
Reaktionsgeschwindigkeit auf den sehr polaren Sauerstoff in Position 3 der Acylkomponente
zurückgeführt werden, der in der Glutarylbindetasche der Recordati-GA offenbar stärkere repulsive
Wechselwirkungen erfährt. Tendenziell setzt die Roche-GA die verschiedenen N-Acyl-ACAs etwas
schneller um. Dies deutet auf einen geringfügig größeren Durchmesser der Glutaryl-Bindetasche
und damit verminderte sterische (im Fall des Diglykolyl-Derivats 310 zusätzlich hydrophobe)
Restriktionen hin.
Tab. 51. Relative Hydrolyseraten verschiedener N-Acyl-7-ACA-Derivate
Substrat rel. Hydrolyserate [%] Substrat rel. Hydrolyserate [%]
GA Recordati GA Roche GA Recordati GA Roche
HO O HN S 7.1 26.7 HO HN S 26.5 29.3
O O N OAc O Cl O N OAc
O O
COOH COOH
310 311
HO S HN S 95.6 95.5 HO HN S 19.1 20.2
O O N OAc O O N OAc
O O
COOH COOH
309 308
134
III.Allgemeiner Teil
III.3.1.2. Hydrolyserate enantiomerenreiner N-Glutaryl-amide
Die Hydrolyse einiger enantiomerenreiner N-Glutaryl-amide zeigt eine deutliche Präferenz beider
Enzyme für die (R)-Konfiguration bezüglich der Größe der Substituenten am stereogenen Zentrum.
Zudem resultiert aus dem Vergleich der Hydrolysegeschwindigkeiten für ein Enantiomerenpaar ein
Hinweis auf die Enantioselektivität der beiden betrachteten Glutaryl-Acylasen. Die Recordati-GA
weist gegenüber der Roche-GA eine verringerte Aktivität bei der Hydrolyse der (auf die
Substituentengröße bezogenen) (S)-konfigurierten Glutarylamide auf und sollte damit bei einer
kinetischen Racematspaltung deutlich bessere Enantiomerenüberschüsse liefern.
Tab. 52. Relative Hydrolyseraten enantiomerenreiner Glutarylamide
Substrat rel. Hydrolyserate [%] Substrat rel. Hydrolyserate [%]
GA Recordati GA Roche GA Recordati GA Roche
NHGl 1.0 6.3 NHGl 81.7 81.4
CO2Me CO2Me
(R)-283 (S)-283
NHGl 6.1 8.7 NHGl 11.8 9.8
169 170
NHGl 3.9 9.5 NHGl 7.0 10.2
183 184
III.3.1.3. Hydrolyserate racemischer N-Glutaryl-arylglycinmethylester
Die Glutaryl-Derivate von Arylglycinmethylestern wie 285 und 286 stellen eine Gruppe von
Substraten dar, welche von beiden Glutaryl-Acylasen mit hoher Geschwindigkeit umgesetzt
werden. Hierbei zeigte sich die Recordati-GA etwas aktiver als das von Roche produzierte Enzym.
Tab. 53. Relative Hydrolyseraten von N-Glutaryl-arylglycinen
Substrat rel. Hydrolyserate [%] Substrat rel. Hydrolyserate [%]
GA Recordati GA Roche GA Recordati GA Roche
NHGl 77.0 65.9 55.1 47.3
CO2Me
CO2Me S
NHGl
HO 286
285
III.3.1.4. Hydrolyserate racemischer N-Glutaryl-β-arylalaninderivate
Untersuchungen der enzymatischen Hydrolyse von α-Aminosäurederivaten durch die Glutaryl-
135