Heterologe Koexpression von humanem Cytochrom P450 1A2 und polymorphen Formen humaner ...

122 Pages·2004·2.03 MB·German

by  Jürgen Scheuenpflug

Technische Universität München
Lehrstuhl für Lebensmittelchemie

Heterologe Koexpression
von humanem Cytochrom P450 1A2 und polymorphen
Formen humaner N-Acetyltransferase Typ-2 in V79
Chinesischen Hamsterzellen zur in vitro-Untersuchung
von Toxizität und Metabolismus von Chemikalien und
Arzneimitteln

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen
Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation

vorgelegt von

Jürgen Scheuenpflug

aus Regensburg

2004

Technische Universität München
Lehrstuhl für Lebensmittelchemie

Heterologe Koexpression
von humanem Cytochrom P450 1A2 und polymorphen Formen
humaner N-Acetyltransferase Typ-2 in V79 Chinesischen
Hamsterzellen zur in vitro-Untersuchung
von Toxizität und Metabolismus von Chemikalien und
Arzneimitteln

Jürgen Scheuenpflug

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität
München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender : Univ.-Prof. Dr. P. Schieberle

Prüfer der Dissertation : 1. apl. Prof. Dr. J. Döhmer
2. Univ.-Prof. Dr. W. Hiller
3. Priv.-Doz. Dr. H. Spielmann, Freie Universität Berlin

Die Dissertation wurde am 01.06.2004 bei der Technischen Universität München eingereicht
und durch die Fakultät für Chemie am 13.07.2004 angenommen.
Meiner Familie
„... and she had never forgotten that, if you drink much from a bottle marked “poison”,
it is almost certain to disagree with you sooner or later.”

Alice`s Adventures in Wonderland, by Lewis Carroll
Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all jenen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben.

An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. J. Döhmer für die Überlassung des Themas, seine
offene, geradlinige und ergebnisorientierte Art, sowie für seine über den Rahmen dieser
Arbeit hinaus gehende Unterstützung danken.

Großer Dank gebührt meinem Betreuer Dr. N. Krebsfänger, welcher mir trotz seiner
immensen Arbeitsbelastung mit fruchtbaren Diskussionen und Ratschlägen, sowie beim
Redigieren der Arbeit zur Seite stand.

Herrn PD Dr. A. Seidel danke ich im Zusammenhang mit der Synthese des
Referenzmetaboliten N-Ac-SMZ und für seine Bereitschaft zur wissenschaftlichen Diskussion
der Arbeit.

Recht herzlich danken möchte ich auch Herrn Prof. Dr. H. Spielmann für sein Interesse am
Fortgang dieser Arbeit, welche von seinem Institut, der ZEBET (Zentralstelle zur Erfassung
und Bewertung zu Alternativen zum Tierversuch), gefördert wurde.

Besonders danke ich unserer Auszubildenden C. Ebel, welche mir bei der praktischen
Durchführung dieser Arbeit durch ihr weit überdurchschnittliches Engagement, ihre
Eigenständigkeit und Lernbereitschaft eine große Hilfe war.

Meinen Kollegen Herrn H. Muschik und W. Mayer danke ich für Ihren Einsatz bei der
Durchführung der LC-MS Analysen.

Einen Dank auch an meine Kollegen Dr. T. Meyer, Dr. S. Janku, A. Bernhardt, K. Gritzko
und J. Michorl für die konstruktive und erfüllende Pionierarbeit beim Laboraufbau.
Für die freundlich-entspannte Atmosphäre danke ich C. Pohl, M. Finelli, N. Herrmann und
auch ganz besonders B. Ammermann, welche sich sehr für mein gesundheitliches
Wohlergehen sorgte – insbesondere wenn es mal wieder "länger" wurde.

Meinem Bruder Joachim und meinen Eltern danke ich über alles Gesagte hinaus.

Diese Arbeit wurde vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) im Rahmen der
wissenschaftlichen Erarbeitung von Tierversuchsersatzmethoden (WK1-1328) gefördert.
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen V

I. Allgemeiner Teil 1

1. Einleitung 1

1.1. Biotransformation und Fremdstoffmetabolismus 1
1.2. Cytochrome P450 2
1.3. Cytochrom P450 1A2 5
1.4. Humane N-Acetyltransferase 9
1.5. Humane N-Acetyltransferase 1 und 2 13
1.6. Bedeutung des NAT2-Polymorphismus 14

2. Aufgabenstellung 20

3. Lösungsstrategie 20

3.1. Konstruktion der rekombinanten Zelllinien 20
3.2. Charakterisierung der neuen Zelllinien 23
3.3. Anwendung der neuen Zelllinien 24

II. Material und Methoden 25

1. Laborgeräte 25

2. Rechner und Software 26

3. Chemikalien 27

4. Enzyme, Antikörper und biologische Materialien 28

5. Mikrobiologisches Material und Methoden 28

5.1. Bakterienstämme 29
5.2. Stammhaltung 29
5.3. Übernachtkultur 30

6. Zellbiologische Materialien und Methoden 30

6.1. Die Zelllinie V79MZ 30
6.2. Verwendete Zelllinien 31
6.3. Kultivieren von V79MZ-Zellen 31
6.4. Ablösen von V79MZ-Zellen mittels Trypsin/EDTA 31
6.5. Passagieren von V79MZ-Zellen 32
6.6. Einfrieren von V79MZ-Zellen 32
6.7. Auftauen von V79MZ-Zellen 32
Inhaltsverzeichnis II
6.8. Herstellen von Zellhomogenat 32

7. Gentechnologische Methoden 33

7.1. Vektoren 33
7.2. hCYP2D6-cDNAs 33
7.3. Primer 34
7.4. Plasmidisolierung aus E. coli 37
7.5. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen 37
7.6. DNA-Agarose-Gelelektrophorese 37
7.7. DNA-Extraktion aus Agarosegelen 37
7.8. Ligation von DNA-Fragmenten 38
7.9. Herstellung kompetenter E. coli 38
7.10. Hitzeschock-Transformation von E. coli 38
7.11. DNA-Sequenzierung 39
7.12. Stabile Transfektion von V79MZ-Zellen 39
7.13. Isolierung genomischer DNA aus V79MZ-Zellen 40
7.14. Isolierung der Gesamt-RNA aus V79MZ-Zellen 40
7.15. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 40
7.16. Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion 44

8. Proteinanalytische Methoden 45

8.1. In situ-Immunfluoreszenz 45
8.2. Proteingehaltbestimmung 45

9. Biokatalytische Methoden 47

9.1. Ethoxyresorufin-O-deethylierung (EROD) 47
9.2. N-Acetylierung von Sulfamethazin 48
9.3. Metabolismus von 2-Aminofluoren 49

10. Toxikologische Methoden 51

9.1. MTT-Test zur Erfassung cytotoxischer Effekte 51
9.2. HPRT-Test zur Erfassung genotoxischer Effekte 52

III. Ergebnisse 54

1. Konstruktion der Zelllinien und Auswahl repräsentativer Klone 54

1.1. Kontroll-Zelllinien V79MZhCYP1A2 und hNAT2*4, *5B, *6A,*13 55
1.2. Koexprimierende Zelllinien V79MZhCYP1A2/hNAT2*4, *5B, *6A, *13 60

2. Transfektion und Auswahl positiver Klone 60
Inhaltsverzeichnis III
3. Charakterisierung der neuen Zelllinien 64

3.1. Nachweis der genomisch integrierten cDNAs 64
3.2. Expressionsnachweis auf mRNA-Ebene : RT-PCR 65
3.3. In situ-Immunfluoreszenz 66

4. Biokatalytische Validierung 67

4.1. 7-Ethoxyresorufin-O-Deethylierung (EROD) 67
4.2. N-Acetylierung 69
4.2.1. N-Acetylierung von Sulfamethazin 72
4.2.2. N-Acetylierung von 2-Aminofluoren 74

5. Toxikologische Untersuchungen 77

5.1. 2-Aminofluoren 77

5.1.1. Metabolismus 77
5.1.2. Genotoxizität 80

5.2. Cytotoxizität oxidativer Haarfarben-Vorstufen 81

IV. Diskussion 84

1. Charakterisierung und Auswahlverfahren 84

2. Molekulare Mechanismen 85

3. Physiologische Relevanz und Vergleich mit anderen Expressions-Systemen 87

4. Metabolische Aktivierung von 2-Aminofluoren 89

5. Toxizität oxidativer Haarfarben-Vorstufen 90

V. Zusammenfassung und Ausblick 92

VI. Literatur 94