Frequency of Environmental Antibiotic Resistance

382 Pages·2015·12.25 MB·English

Frequency of Environmental
Antibiotic Resistance
Baseline prevalence of neomycin phosphotransferase
genes II and III in maize and potato fields,
feed and human bacterial pathogens in Austria
Final Report
Impressum
Eigentümer, Herausgeber und Verleger:
Bundesministerium für Gesundheit (BMG),
Radetzkystraße 2, 1030 Wien
Für den Inhalt verantwortlich:
Dr. Ulrich Herzog (CVO),
Leiter des Bereichs II/3 (BMG)
Autorinnen und Autoren:
Mag. Markus Wögerbauer 1a
Dr. Josef Zeinzinger 1c
DI Johann Steinwider 1a
Dr. Sonja Axmann 1c
Sara Dominques, MSc 3
Mag. Reinhard Fuchs 1a
Dr. Richard Gottsberger 1c
Dr. Johannes Hofrichter 1a
Dr. Peter Hufnagl 1b
Dr. Alexander Indra 1b
Dr. Ian Kopacka 1a
Dr. Christian Kornschober 1b
Dr. Irina Korschineck 4
Dr. Kathrin Pascher 2
Mag. Helga Reisenzein 1c
Mag. Corina Schleicher 1a
DI Michael Schwarz 1a
Priv.-Doz. Dr. Burkhard Springer 1b
Prof. Dr. Franz Allerberger 1b
Prof. Dr. Kaare Magne Nielsen 3
Univ.-Doz. Dr. Klemens Fuchs 1a
Acknowledgments:
Dr. Claudia Mikula 1b
Mag. Dieter Miletich 5
Mag. Heimo Schedl 2
Coverfoto:
© vitstudio – fotolia.com
Erscheinung:
Oktober 2015
ISBN 978-3-902611-99-4
This work was performed from 2010 to 2012 and updated partially in 2013 and 2014 according to
advice from external experts. It was a multidisciplinary attempt combining the expertise of scientists
in medical microbiology, molecular biology, clinical diagnostics, soil ecology, plant health, agriculture,
geoinformatics, and statistics. We thank all our contributors for their efforts and valuable inputs.
__________
1 Austrian Agency for Health and Food Safety (AGES - Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit),
1a Division Data, Statistics and Risk Assessment
1b Division for Human Medicine
1c Division for Food Security
2 University of Natural Resources and Life Sciences Vienna, Department of Integrative Biology and Biodiversity Research,
Institute of Zoology
3 University of Tromsø, Department Pharmacy, 9037 Tromsø, Norway
4 Ingenetix, Vienna
5 Renaturo
Frequency of Environmental Antibiotic Resistance
Executive Summary English
–

The naturally occurring prevalence of two antibiotic resistance marker genes – neomycin
phosphotransferase II and neomycin phosphotransferase III – was determined by TaqMan real time
PCR in three environments - human pathogens, soil, and feed - in Austria.

The clinically relevant environment was represented by an analysis of the nptII/nptIII carrier status of
Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus isolates which were collected prospectively in 2010 and 2011 from
representative clinical laboratories located in all Austrian federal states. Additionally, a strain
repository of Salmonella enterica subsp. enterica isolates collected from 2008 – 2010 at the Austrian
Reference Centre for Salmonella was retrospectively analysed. In total nptII and nptIII resistance
gene prevalence data of more than 10 400 samples were compiled. A single Salmonella strain could
be identified as carrier for nptII. All other isolates were nptII negative. Within a confidence limit of
95% (depicted in brackets) the calculated prevalence of nptII was below 0.70% in Escherichia coli
[0%; 0.70%], and below 0.75%, 0.73%, 0.32%, and 0.058% in enterococci [0%; 0.75%], Staphyloccocus
aureus [0%; 0.73%], Pseudomonas aeruginosa [0%; 0.32%] and Salmonella spp. [0%; 0.058%] isolates,
respectively. For nptIII the prevalence - within a confidence limit of 95% - was below 1.47% in E. coli
[0%; 1.47%], and below 42.4%, 5.02%, 0.32%, and 0.037% with enterococci [32.84%; 42.4%], S.
aureus [1.51%; 5.02%], Pseudomonas aeruginosa [0%; 0.32%], and Salmonella enterica subsp.
enterica [0%; 0.037%] isolates, respectively. The obtained results support – with a high grade of
confidence - the hypothesis of a low prevalence of nptII in the analysed human pathogenic strains
collected representatively all over Austria.

Soil bacterial communities were tested for the prevalence of nptII and nptIII by cultivation-
dependent and cultivation-independent metagenomic approaches analysing 100 composite soil
samples representing 1000 single soil extractions from 50 maize and 50 potato fields. Total soil DNA
analysis revealed 6% of the fields positive for the presence of nptII genes (95% confidence interval
[2.2%; 12.6%]). A mean concentration of 340 nptII gene copies/g soil (minimum: 31 copies/g soil;
maximum: 850 copies/g soil) were detected in these fields. A study published in 2011 by Ma et al. in
Canada attained similar results regarding the low prevalence and the low copy number of nptII in
agricultural soils. 85% of all soil samples were positive for nptIII (95% confidence interval [76.5%;
91.4%]) representing average background loads of 4750 copies/g soil (range: 13 – 61,600 copies/g
soil) of the positively tested fields. Comprehensive supplemental data packages for each test field
were compiled. A strong correlation between fertilization of organic origin and high prevalence of
nptIII was obtained. On average 8.29% of all cultivable bacteria from ten reference fields were
resistant to kanamycin (range: 0.47 – 19.12%). 396 bacterial strains resistant to kanamycin were
isolated and taxonomically characterized, none could be identified as carrier for nptII (95%
confidence interval: [0%; 0.8%]). In a few fields, some strains with potential to cause human disease
(e.g. Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia) were detected. The prevalence of nptIII
positive strains was 1.8% on average ([0%; 3.3%]). Microbial biodiversity of these ten reference fields
was established by pyrosequencing. Between 194 and 268 genera could be identified and their
relative quantities could be established per field. Genera containing human pathogens were present.
Compared to nptIII the naturally occurring background load of nptII resistance genes in agricultural
habitats used for the cultivation of maize and potatoes in Austria was low. To our knowledge this was
the most comprehensive effort to collect resistance gene specific and additional data from soil
environments to date by covering 100 fields of different soil types cultivated with different crops.
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Frequency of Environmental Antibiotic Resistance

The feed/plant environment was represented by maize and potato samples routinely collected for
federal control measurements in Austria. Forty two total DNA extracts were analysed for the
prevalence of nptII and nptIII. None of them were positive for both aminoglycoside
phosphotransferases (95% confidence interval: [0%; 6.9%]). Up to 73.05% of the bacterial population
recovered from maize were resistant to kanamycin, potato associated bacteria showed a maximum
kanamycin resistance of 6.6%. A single bacterial isolate carried nptII (prevalence estimator: 1.1%;
96% confidence interval: [0%; 4,9%]). Although only a small number of bacterial samples was tested
the obtained results support the hypothesis of a low naturally occurring background load of nptII and
nptIII genes in maize and potatoes cultivated and used as feed in Austria during the testing period.

In silico analysis of nptII gene sequences showed no extended regions of DNA similarity with other
aminoglycoside phosphotransferase genes. The identified contiguous stretches of identical sequence
were extremely short. This observation indicates that homologous recombination between nptII and
the other aminoglycoside phosphotransferase genes under investigation will not be the primary
route for the exchange of DNA fragments and sequence evolution. However, a remaining possibility
for exchange of DNA sequences between aminoglycoside phosphotransferase genes is illegitimate
recombination due to identification of regions with microhomologies. Sequence alignments using
standard parameters of the BLAST algorithm did not reveal the presence of nptII mosaic genes of
natural origin in GenBank sequence entries. Data retrieved from the in silico analysis available at the
time of query did not provide substantial support to the hypothesis of an involvement of the nptII
gene in the formation of mosaic genes with altered resistance patterns within the family of
aminoglycoside phosphotransferases. However, there were indications from experiments performed
in the course of the project that nptII containing DNA might recombine with certain aminoglycoside
phosphotransferase genes cloned into Acinetobacter baylyi during natural genetic transformation.
These results could not be confirmed by sequence analysis of the putative target regions.

A computer model simulating the horizontal transfer of plant derived antibiotic resistance genes into
soil bacterial communities expanding pivotal work from Townsend et al. indicates that fixation of the
new trait is a long term process extremely dependent on the selection pressure prevailing in the
respective habitat. Taking plant degradation processes into account the frequency of horizontal gene
transfers plays also a role to a certain extent concerning the fixation of a new phenotype in the
population.

The effects of selection pressure mediated by antibiotics in soils were comprehensively discussed.
Analysis of recent literature revealed that antibiotics at drug concentrations several hundred-fold
below the minimum inhibitory concentrations of susceptible bacteria may select effectively for
resistant bacteria and that low antibiotic concentrations found in natural environments are supposed
to be important for the enrichment and maintenance of resistance in bacterial populations.

Conclusion
The naturally occurring background load of nptII resistance genes in the tested bacterial habitats in
Austria appeared to be low during the testing period. The obtained quantitative results indicated that
the resistance gene pools under investigation were not saturated with nptII gene copies. The
baseline frequency of nptII in these natural habitats was usually distinctly lower compared to the
prevalence of nptIII in the same habitats. In summary the resistance gene pools under investigation
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Frequency of Environmental Antibiotic Resistance
appear to be not saturated but receptive for the input of exogenous DNA carrying aminoglycoside
phosphotransferase (cid:894)3’(cid:895)-IIa gene homologues. A long-term and constant exposure of these habitats
with exogenous nptII carrying DNA might be capable of elevating the abundance of this resistance
determinant in these environments.

Some of the obtained data can be found in the following publication:
Woegerbauer M, Zeinzinger J, Springer B, Hufnagl P, Indra A, Korschineck I, Hofrichter J, Kopacka I,
Fuchs R, Steinwider J, Fuchs K, Nielsen KM, Allerberger F. 2014. Prevalence of the aminoglycoside
phosphotransferase genes aph(3')-IIIa and aph(3')-IIa in Escherichia coli, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subsp. enterica and
Staphylococcus aureus isolates in Austria. J Med Microbiol 63:210-217.
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Frequency of Environmental Antibiotic Resistance
Executive Summary Deutsch
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Die natürlich vorkommende Prävalenz von zwei Antibiotikaresistenzmarkergenen -
Neomycinphosphotransferase II und Neomycinphosphotransferase III – wurde mit TaqMan real time
PCR in den Habitaten „Menschliche Krankheitserreger(cid:862), „Boden(cid:862) und „Futtermittel(cid:862) in Österreich
bestimmt.

In der klinisch relevanten Umgebung wurden folgende humanpathogene Bakterien auf nptII und
nptIII Resistenzgene untersucht, welche prospektiv in den Jahren 2010 - 2011 von klinischen Labors
repräsentativ in allen österreichischen Bundesländern gesammelt wurden: Escherichia coli,
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.
Zusätzlich wurden Salmonella enterica subsp. enterica Isolate der Stammsammlung des
österreichischen Referenzlabors für Salmonella retrospektiv für den Zeitraum 2008 – 2010 analysiert.
Von insgesamt 10 400 auf nptII und nptIII Resistenzgene untersuchten Isolaten wurde ein einzelner
Salmonellenstamm positiv als Träger von nptII getestet. Alle anderen Isolate waren nptII negativ. Mit
einer Sicherheit von 95% war die Prävalenz von nptII bei Escherichia coli niedriger als 0.70% [0%;
0.70%], bei Enterokokken niedriger als 0.75% [0%; 0.75%], bei Staphylococcus aureus niedriger als
0.73% [0%; 0.73%], bei Pseudomonas aeruginosa niedriger als 0.32% [0%; 0.32%] und bei Salmonella
spp. niedriger als 0.058% [0%; 0.058%]. In Klammer ist das 95% Konfidenzintervall angeführt. Bei
nptIII lagen die Prävalenzen – innerhalb eines 95% Konfidenzlimits - bei Escherichia coli unter 1.47%
[0%; 1.47%], bei Enterokokken unter 42.4% [32.84%; 42.4%], bei Staphylococcus aureus unter 5.02%
[1.51%; 5.02%], bei Pseudomonas aeruginosa unter 0.32% [0%; 0.32%] und bei Salmonella enterica
subsp. enterica unter 0.037% [0%; 0.037%]. Die erzielten Ergebnisse bestätigen mit einer Sicherheit
von 95% die Hypothese einer niedrigen Prävalenz von nptII in den repräsentativ in Österreich
gesammelten und analysierten humanpathogenen Bakterienisolaten.

Bodenbakterienpopulationen wurden auf die Prävalenz von nptII und nptIII mit
kultivierungsabhängigen und –unabhängigen metagenomischen Verfahren getestet. Es wurden 100
Bodenmischproben von jeweils 50 Mais- und 50 Kartoffelfeldern untersucht. Insgesamt wurden 1000
Einzelbodenprobenextrakte gezogen. Die Analyse der Gesamt-Boden-DNA zeigte, dass 6% der
Bodenproben positiv auf das Vorhandensein von nptII Genen (95% Konfidenzintervall [2,2%; 12,6%])
waren. Im Mittel konnten 340 nptII Genkopien/g Boden (Minimum: 31 Kopien/g Boden; Maximum:
850 Kopien/g Boden) in den positiv getesteten Feldern detektiert werden. Eine im Jahr 2011
publizierte Studie von Ma et al. in Kanada kommt hinsichtlich der niedrigen Prävalenz und der
geringen Kopienanzahl von nptII in landwirtschaftlich genutzten Anbauflächen zu einem ähnlichen
Ergebnis. 85% aller Bodenproben wurden positiv auf nptIII getestet [76,5%; 91,4%], welche eine
durchschnittliche Hintergrundbelastung von 4750 Kopien/g Boden (Bereich 13 bis 61.600 Kopien/g
Boden) in den positiv getesteten Feldern aufwiesen. Für die einzelnen Felder wurden umfangreiche
Zusatz-Daten gesammelt und ausgewertet. Es wurde eine starke Korrelation zwischen organischer
Düngung und der Prävalenz von nptIII Genen festgestellt. Im Durchschnitt waren 8.29% aller
kultivierbaren Bakterien aus zehn Referenzfeldern resistent gegen Kanamycin (Bereich: 0,47 bis
19,12%). 396 gegen Kanamycin resistente Bakterienstämme wurden isoliert und taxonomisch
charakterisiert. Keiner dieser Stämme konnte als Träger für nptII identifiziert werden (95%
Konfidenzintervall [0%; 0,8%]). Die durchschnittliche Prävalenz der nptIII positiven Stämme betrug
1,8% ([0%, 3,3%]). In einigen Feldern konnten humanpathogene Stämme (z.B. Klebsiella pneumoniae,
Stenotrophomonas maltophilia) identifiziert werden. Weiters wurde die mikrobielle Diversität dieser
zehn Referenzfelder mittels Pyrosequenzierung untersucht. Es konnten zwischen 194 und 268
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Frequency of Environmental Antibiotic Resistance
Gattungen in den Bodenproben identifiziert und ihre relativen Anteile ermittelt werden.
Humanpathogene Gattungen kommen dabei ebenfalls vor. Im Vergleich zu nptIII ist die natürliche
Hintergrundbelastung von nptII Resistenzgenen in für Mais- und Kartoffelanbau genutzten
landwirtschaftlichen Habitaten in Österreich gering. Unseres Wissens war dies der bisher
umfassendste Ansatz, um Daten über die Prävalenz von Resistenzgenen in 100 Bodenproben mit
verschiedenen Bodentypen zu sammeln und mit umfangreichen zusätzlichen spezifischen
Bodendaten auszuwerten.

Das Habitat Pflanze bzw. Futtermittel wird repräsentiert durch Mais- und Kartoffelproben, welche
routinemäßig im Rahmen von Kontrollen des Bundesamtes für Ernährungssicherheit in Österreich
gesammelt werden. Zweiundvierzig Gesamt-DNA-Extrakte wurden auf die Prävalenz von nptII und
nptIII analysiert. Keine Probe war positiv auf eine der beiden Aminoglykosidphosphotransferasen
(95% Konfidenzintervall: [0%; 6,9%]). Bis zu 73,05% der aus Mais gewonnenen Bakterienpopulation
waren resistent gegen Kanamycin, während aus Kartoffeln gewonnene Bakterien eine maximale
Kanamycin-Resistenz von 6,6% aufwiesen. Ein einzelnes Bakterienisolat wurde nptII positiv getestet
(Prävalenz Schätzer: 1,1%; 96%-Konfidenzintervall: [0%, 4,9%]). Obwohl nur eine kleine Anzahl von
bakteriellen Proben getestet wurde, unterstützen die erhaltenen Ergebnisse die Hypothese einer
niedrigen natürlichen Hintergrundbelastung von nptII und nptIII Genen in Mais und Kartoffeln,
welche im Untersuchungszeitraum in Österreich angebaut und als Futtermittel verwendet wurden.

Eine in silico Analyse der nptII Gensequenz mit anderen Aminoglycosidphosphotransferasegenen
zeigt keine ausgeprägten Bereiche mit DNA Ähnlichkeit. Die identifizierten zusammenhängenden
DNA Abschnitte mit totaler Sequenzidentität sind extrem kurz. Das deutet darauf hin, dass homologe
Rekombination zwischen nptII und den anderen untersuchten
Aminoglycosidphosphotransferasegenen nicht der primäre Weg zum Austausch von DNA
Fragmenten und zur Sequenzevolution ist. Es verbleibt jedoch die Möglichkeit eines DNA
Austausches zwischen Aminoglycosidphosphotransferasegenen durch illegitime Rekombination, da
Bereiche mit Microhomologien auftreten. BLAST Sequenzalignments mit Standardparametern zeigen,
dass sich keine nptII Mosaikgene natürlichen Ursprungs in GenBank befinden. Die aus der in silico
Analyse gewonnenen Daten unterstützen nicht wesentlich die Hypothese einer Beteiligung von nptII
an der Bildung von Mosaikgenen mit anderen Aminoglycosidphosphotransferasegenen, die zur
Veränderung des Resistenzmusters führen können. Es gibt jedoch Hinweise aus im Rahmen des
Projekts durchgeführten Experimenten, dass nptII codierende DNA mit ausgewählten
Aminoglycosidphosphotransferasegenen, die zuvor in Acinetobacter baylyi kloniert worden waren,
nach natürlicher genetischer Transformation rekombinieren. Die Ergebnisse konnten durch
Sequenzierung der vermutlichen Zielregionen nicht bestätigt werden.

Ein Computer-Modell zur Simulation des horizontalen Gentransfers von aus Pflanzen freigesetzten
Antibiotikaresistenzgenen auf die Bakteriengemeinschaften im Boden erweitert das Schlüsselwerk
von Townsend et al. und bestätigt, dass die Fixierung eines neu eingebrachten Gens ein langfristiger
Prozess ist, welcher extrem vom Selektionsdruck im jeweiligen Habitat abhängig ist. Bezieht man die
Abbauprozesse von pflanzlichem Material ins Model mit ein, zeigt sich dass auch die Häufigkeit des
horizontalen Gentransfers bei der Fixierung eines neuen Genotyps in einem gewissen Ausmaß eine
Rolle spielt.

Die Wirkung des durch Antibiotika in Böden erzeugten Selektionsdrucks wird umfangreich diskutiert.
Die Analyse aktueller Literatur zeigt, dass Antibiotikamengen, die um das Hundertfache unter den
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Frequency of Environmental Antibiotic Resistance
tatsächlichen minimalen Hemmkonzentrationen von empfindlichen Bakterien liegen, effektiv
resistente Bakterien selektieren und dass diese niedrigen, in natürlicher Umgebung zu findenden
Antibiotikakonzentrationen wichtig für Anreicherung und Erhalt von Resistenzen in
Bakterienpopulationen sind.

Schlussfolgerung
Die natürlich vorkommende Hintergrundbelastung von nptII Resistenzgenen in den in Österreich
getesteten bakteriellen Habitaten scheint niedrig zu sein. Die erzielten quantitativen Ergebnisse
zeigen, dass die untersuchten Resistenzgen-Pools nicht mit nptII Genen gesättigt sind. Die Baseline-
Frequenz von nptII in diesen natürlichen Lebensräumen ist in der Regel deutlich niedriger im
Vergleich zur Prävalenz von nptIII in den gleichen Habitaten. Die Ergebnisse zusammenfassend
betrachtet deuten darauf hin, dass die untersuchten Resistenzgen-Pools nicht mit nptII Genen
gesättigt und daher aufnahmefähig für den Input exogener DNA mit
Aminoglycosidphosphotransferase (3 ')-IIa-Gen Homologen sind. Eine langfristige und konstante
Exposition dieser Lebensräume mit exogener nptII codierender DNA könnte in der Lage sein, die
Häufigkeit dieser Resistenz-Determinante in diesen Ökosystemen zu erhöhen.

Einige der erzielten Ergebnisse sind in folgender Publikation zu nachzulesen:
Woegerbauer M, Zeinzinger J, Springer B, Hufnagl P, Indra A, Korschineck I, Hofrichter J, Kopacka I,
Fuchs R, Steinwider J, Fuchs K, Nielsen KM, Allerberger F. 2014. Prevalence of the aminoglycoside
phosphotransferase genes aph(3')-IIIa and aph(3')-IIa in Escherichia coli, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subsp. enterica and
Staphylococcus aureus isolates in Austria. J Med Microbiol 63:210-217.
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Frequency of Environmental Antibiotic Resistance
Table of Contents and Parts of the Final
Report
The final report for the project
„Frequency of Environmental Antibiotic Resistance - Baseline prevalence of neomycin
phosphotransferase genes II and III in maize and potato fields, feed and human bacterial pathogens
in Austria(cid:863) (Bestimmung der Hintergrundbelastung von natürlichen Habitaten mit
Aminoglykosidphosphotransferase Genen (nptII/nptIII) zur verbesserten Risikoabschätzung von
Antibiotikaresistenzmarkergenen aus gentechnisch veränderten Organismen. FEAR-Projekt BMG-
70420/0089-II/B/9/2010 und BMLFUW Dafne Nr. 100598/1)
contains the following parts:

Part Page
Part A: NptII and nptIII Prevalence in Human Pathogens ...................................................................13
Part B: NptII and nptIII Prevalence in Soil .........................................................................................103
Part C: NptII and nptIII Prevalence in Feed .......................................................................................239
Part D: Mosaic Genes; Selection Pressure; Horizontal Gene Transfer Model ..................................283
Part E: PCR Detection Methods .......................................................................................................364

Each Part is prepared with a separate Table of Contents, List of Tables and Figures, separate Annexes
and a Summary of the respective part of the project.

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Frequency of Environmental Antibiotic Resistance
Abbreviations

Abbreviation Description
µl microliter
µM micromolar
µm micrometer
AGES Austrian Agency for Health and Food Safety - Agentur für Gesundheit und
Ernährungssicherheit
Amk amikacin
APH aminoglycoside phosphotransferases (protein)
ARM antibiotic resistance marker
BIOHAZ EFSA Biohazard Panel
BLAST Basic local alignment search tool
But butirosin
CP crossing point; real time PCR
CFU colony forming unit
ct threshold cycle; real time PCR
CV coefficient of variation
DNA deoxyribonucleic acid
EFSA European Food Safety Authority
EMA European Medicines Agency
FAM fluorescein amidite; 6-FAM phosphoroamidite; real time PCR
g gram
GM genetically modified
GmB gentamicin B
GMO genetically modified organism
HBV hepatitis B virus
HCV hepatitis C virus
HEX hexa-chloro-fluorescein; real time PCR
HGT horizontal gene transfer
HIV human immunodeficiency virus
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