Fluorinated peptides and functionalized liposomes to target amyloid deposits in Alzheimer's disease

170 Pages·2014·9.15 MB·English

Fluorinated peptides and
functionalized liposomes to
target amyloid deposits in
Alzheimer's disease

Dissertation presented for obtaining the degree of:
Doctor of Philosophy in Chemical and Biological Engineering
by
University of Porto

By
Joana Angélica de Sousa Loureiro

Supervisor:
Maria do Carmo da Silva Pereira
Co-Supervisor:
Sandra Cristina Pinto da Rocha

Porto, 2013

To my family (specially my father),
friends and teachers…

“The mind that opens
to a new idea never
returns to its original size”
Albert Einstein (1879-1955)

i

Acknowledgments
I wish to acknowledge the many people that contributed to this
dissertation and I am grateful to all of them.
My special thanks go to my supervisor Prof. Drª. Maria do Carmo
Pereira for welcomed me as her PhD student. Other distinct thanks goes to
my co-supervisor Drª. Sandra Rocha. Their scientific guidance and support
were fundamental during the course of this work.
I also would like to thank Prof. Dr. Manuel Coelho for him enriching
scientific discussions.
I express my reverence for the work group of my laboratory (no
one mentioned, no one forgotten!). They were always helpful and friendly
which made easier to overcome the difficult and frustrations of being a
PhD student. I really appreciate the brain storming and scientific
discussions. To LEPABE members and staff a special thank for their help
and contribution.
I would like to thank Prof. Dr. Gert Fricker for the opportunity that
he gave me to perform some experiments in their laboratory (in the
Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology, University of
Heidelberg, Heidelberg, Germany) and for his support in the in vitro and in
vivo experiments.
Thanks to Dra. Isabel Cardoso from Institute for Molecular and Cell
Biology (Porto, Portugal) for the help with the cellular assays.
ii

I express my gratitude to all co-authors in this work, in special to
the Prof. Dra. Salette Reis and Dra. Claudia Pinho, who help me in the
liposomes experiments.
I thank Rui Fernandes for his training and support in transmission
electron microscopy experiments and in the cryosections preparation, but
also for his helpful suggestions.
Many thank to my family, in singular to my grandmother Laureta,
and my friends, in special to my great friend Guilherme for all the time that
he spent gave me incentive, my gratefully acknowledgement.
Finally, I offer my regards to my parents, for their always present
support and I also recognize all the efforts they made for me and for
proportionate everything that I have ever done till this present day.
This research work was supported by FCT research project
PTDC/QUI-BIQ/102827/2008 and I am grateful.
iii

Resumo
O péptido beta-amilóide (Aβ) é o principal constituinte das placas
senis que caracterizam a doença de Alzheimer (DA). O péptido com a
sequência de 42 aminoácidos é depositado no cérebro extracelularmente,
o que resulta em morte neuronal. Apesar dos esforços para compreender a
origem da DA e para encontrar tratamentos eficazes, ainda não existe uma
cura para esta doença tão debilitante.
A transição da conformação do péptido Aβ de α-hélice para folhas-β
leva à sua agregação e parece ser um passo crucial na formação de placas
senis. A conformação do péptido determina se os agregados tóxicos serão
formados. Por outro lado, a estrutura do péptido depende do ambiente e
de interacções entre moléculas. Para compreender as alterações e o
processo de agregação do péptido é importante realizar estudos de
interacções do Aβ com diferentes moléculas de tensioactivos.
O presente trabalho descreve o efeito dos tensioactivos carregados
e não carregados na fibrilogénese do Aβ . As interacções péptido–
(1-42)
tensioativo foram caracterizadas através da análise ultra-estrutural, por
ensaios de tioflavina T e pela análise da estrutura secundária. Estes
estudos sugerem que os tensioactivos carregados interagem com o Aβ
(1-42)
através de interacções electrostáticas. No caso das micelas carregadas,
estas tornam o processo de agregação mais lento e estabilizam o péptido
no estado oligomérico. Por outro lado, os tensioactivos não carregados
promovem a fibrilogénese do Aβ . Este estudo contribui para
(1-42)
iv

compreender a agregação de péptidos e selecionar moléculas que sejam
potenciais inibidores da agregação do péptido Aβ .
(1-42)
Três novos péptidos foram concebidos e testados como inibidores
da agregação do Aβ . As sequências são baseadas nos resíduos
(1-42)
hidrofóbicos do Aβ (resíduos de 17-21) e no péptido inibidor LPFFD
(1-42)
(iAβ5). Devido às vantagens que as moléculas fluoradas têm em medicina,
foram adicionados átomos de flúor às sequências. Com o objetivo de
aumentar a biodisponibilidade e a solubilidade destes péptidos, uma
molécula de poli(etileno-glicol) (PEG) foi ligada covalentemente no
terminal-C de cada péptido. Os péptidos fluorados conjugados foram
caracterizados por ionização e dessorção a laser assistida por matriz e a
cinética de agregação do Aβ(1-42) na sua presença foi analisada através
do ensaio de tioflavina T. Para além disso, a morfologia dos agregados foi
observada por microscopia electrónica de transmissão. Os estudos
demonstram que duas sequências de péptidos fluorados conjugados
(LVFFD-PEG e LVFFD-PEG) inibem a agregação do péptido Aβ a
f f (1-42)
baixas concentrações.
Fármacos promissores para o tratamento da DA podem nunca vir a
ser utilizados devido à sua inaptidão em chegar ao cérebro em
concentrações desejadas dado à existência da barreira hemato-encefálica.
Para contornar este problema, foram concebidos e testados lipossomas
peguilados funcionalizados com dois tipos de anticorpos: um que
reconhece o receptor de transferrina (OX -26) e outro que reconhece o
péptido beta amilóide (19B8). Estudos in vivo em ratos demonstraram que
a concentração dos imunolipossomas é substancialmente mais elevada nos
tecidos cerebrais do que a dos lipossomas não-funcionalizados. Este
sistema foi utilizado para encapsular o inibidor LPFFD, demonstrando
assim a sua aplicação como transportador de fármacos para o tratamento
da DA.