Fisiopatología del modelo de Theiler: acciones terapéuticas del cannabidiol y efectos protectores

172 Pages·2012·5.44 MB·Spanish

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Departamento de Fisiología

TESIS DOCTORAL

Fisiopatología del modelo de Theiler: acciones terapéuticas del cannabidiol
y efectos protectores en progenitores de oligodendrocitos

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Miriam Mecha Rodríguez

Directora

Carmen Guaza Rodríguez

Madrid, 2013

© Miriam Mecha Rodríguez, 2012
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Departamento de Fisiología

FISIOPATOLOGÍA DEL MODELO DE THEILER:
ACCIONES TERAPÉUTICAS DEL CANNABIDIOL Y
EFECTOS PROTECTORES EN PROGENITORES DE
OLIGODENDROCITOS

Tesis Doctoral
Miriam Mecha Rodríguez
Madrid, 2012
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Departamento de Fisiología

Fisiopatología del modelo de Theiler: acciones
terapéuticas del cannabidiol y efectos
protectores en progenitores de
oligodendrocitos

Tesis Doctoral
Miriam Mecha Rodríguez
Madrid, 2012
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Departamento de Fisiología

Fisiopatología del modelo de Theiler: acciones
terapéuticas del cannabidiol y efectos
protectores en progenitores de
oligodendrocitos

Memoria presentada por
Miriam Mecha Rodríguez
Para optar al grado de Doctora

VºBº de la Directora:
Dra. Carmen Guaza Rodríguez

Instituto Cajal (CSIC)
A mis mentoras, Carmen y María José, por ayudarme a descubrir una irremediable pasión
por la ciencia.
A mis padres, Teresa y Antonio, por guiarme con su luz desde el asfalto y desde el cielo.
A todos los que me llevan a más real distancia que ningún dios ni hombre.
Yo no soy yo.
Soy todos estos
que van a mi lado sin yo verlos;
que, a veces, voy a ver,
y que, a veces, olvido.
Los que callan, serenos, cuando hablo,
los que perdonan, dulces, cuando odio,
los que pasean por donde no estoy,
los que quedarán en pie cuando yo muera.

(adaptación de un poema de la obra `Eternidades´, de Juan Ramón Jiménez, 1918)
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 3
1.- LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. .......................................................................................... 4
1.1.- Etiología y clasificación. ............................................................................................... 4
1.2.- Patogenia de la Esclerosis Múltiple. ............................................................................. 7
1.3.- Tratamiento de la Esclerosis Múltiple y estrategias terapéuticas. ............................... 13
2.- MODELOS EXPERIMENTALES EN ESCLEROSIS MÚLTIPLE. ............................... 17
2.1.- Encefalitis Autoinmune Experimental . ...................................................................... 17
2.2.- Enfermedad desmielinizante inducida por el virus de Theiler (TMEV-IDD). ........... 18
3.- CANNABINOIDES Y ESCLEROSIS MÚLTIPLE. ......................................................... 20
3.1.- Receptores cannabinoides: distribución y funciones fisiológicas. .............................. 22
3.2.- Mecanismos de transducción de señales. .................................................................... 23
3.3.- Ligandos cannabinoides. ............................................................................................. 24
3.4.- El cannabidiol como posible agente terapéutico. ........................................................ 26
OBJETIVOS ............................................................................................................................... 29
MATERIAL Y MÉTODOS EXPERIMENTALES .................................................................... 32
1.- MATERIAL ....................................................................................................................... 33
1.1- Animales. ..................................................................................................................... 33
1.2.- Reactivos. .................................................................................................................... 33
1.3.- Compuestos. ................................................................................................................ 36
1.4.- Instrumentos. ............................................................................................................... 38
1.5.- Oligonucleotidos. ........................................................................................................ 39
2.- MÉTODOS EXPERIMENTALES .................................................................................... 41
2.1.- Animales. .................................................................................................................... 41
2.2.- Cultivos primarios de oligodendrocitos. ..................................................................... 44
2.4.- Estudios de expresión génica por PCR cuantitativa (qPCR). ..................................... 49
2.5.- Microscopía óptica y confocal. ................................................................................... 51
2.6.- Análisis estadístico. ..................................................................................................... 51
RESULTADOS ........................................................................................................................... 52
1.- Fisiopatogénesis de la encefalomielitis murina por infección con el virus de Theiler como
modelo experimental de Esclerosis Múltiple. ......................................................................... 53
1.1- Caracterización de la evolución histopatológica (activación microglial, grado de
afectación axonal y desmielinización). ............................................................................... 55
1.2- Curso temporal de la expresión génica de marcadores de progenitores de
oligodendrocitos en médula espinal cervical. ...................................................................... 62
1.3- La zona subventricular como nicho neurogénico: proliferación celular, migración y
diferenciación a oligodendrocitos en áreas lesionadas. ....................................................... 64
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2.- Efecto del tratamiento con CBD en la fase crónica (terapéutica) y aguda en el modelo
TMEV-IDD. ............................................................................................................................ 72
2.1- Tratamiento en fase terapéutica. .................................................................................. 74
2.2- Tratamiento en fase inductora. ..................................................................................... 78
3.- Estudio del efecto del cannabidiol en cultivos primarios de progenitores de
oligodendrocitos. ..................................................................................................................... 85
3.1- Efecto del cannabidiol sobre la viabilidad y la proliferación celular en situación basal.
............................................................................................................................................. 86
3.2- Efecto del cannabidiol en condiciones de estrés oxidativo e inflamación. .................. 88
3.3- Efectos del cannabidiol en flujos de calcio. ................................................................. 93
3.4- Efecto del cannabidiol en condiciones de estrés de retículo endoplásmico. ................ 96
DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 101
CONCLUSIONES .................................................................................................................... 121
REFERENCIAS ........................................................................................................................ 123
EPÍLOGO .................................................................................................................................. 141
ANEXOS................................................................................................................................... 144

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INTRODUCCIÓN

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1.- LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE.
El nombre de Esclerosis Múltiple (EM) hace referencia a la definición patológica de la
enfermedad, ya que esclerosis múltiple o esclerosis en placas (del griego skleros – duro
– más el sufijo –osis – de enfermedad) apunta hacia la presencia de cicatrices glióticas
en las áreas en las que se ha eliminado la mielina del SNC, así como al carácter
parcheado y múltiple de las lesiones. Aunque ya han pasado más de 100 años desde que
Charcot, Carswell, Cruveilhier y otros describieran las características clínicas y
patológicas de la EM, esta enfermedad se ha posicionado como la patología inflamatoria
desmielinizante y degenerativa más común del Sistema Nervioso Central (SNC), y el
desorden neurológico más frecuente en adultos jóvenes después de los accidentes de
tráfico (Noseworthy y cols., 2000).
La EM cursa con sintomatología variable, entre la que destaca: espasticidad, debilidad
muscular, temblor, dolor, ataxia, parálisis, fatiga, pérdida progresiva de sensibilidad,
alteración visual, dificultad respiratoria, dificultad de habla, incontinencia urinaria,
disfunción sexual y depresión. Dicha sintomatología puede explicarse en parte por la
aparición progresiva y continuada de placas escleróticas que aparecen mayoritariamente
en el nervio óptico, tronco cerebral, cerebelo y médula espinal, y tanto los síntomas
como la severidad y el curso de la enfermedad varían dependiendo tanto del lugar en el
que se encuentren las placas como del grado de desmielinización y de
neurodegeneración. Además, la evidencia sugiere que el inicio de la sintomatología
sucede tiempo después del comienzo de la enfermedad, y cuando aparecen los síntomas
ya existen signos de atrofia a nivel de SNC.

1.1.- ETIOLOGÍA Y CLASIFICACIÓN.
Si bien hace 170 años desde que se describiese por primera vez la EM, 60 años desde
que se conociese su posible origen autoinmune y 30 desde que se dispone de
tratamientos que intentan limitar o frenar el daño neurodegenerativo que cursa en la
enfermedad, la causa de la EM sigue siendo desconocida y el trabajo epidemiológico
reciente se ha centrado en dos puntos importantes: los factores genéticos y los factores
ambientales.

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