Fernanda Barbisan

198 Pages·2017·4.48 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

Fernanda Barbisan

A AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO LÍTIO É INFLUENCIADA POR
FATORES GENÉTICOS, NUTRICIONAIS E FÁRMACOS
ANTIDEPRESSIVOS: ESTUDO IN VITRO

Santa Maria, RS
2017
Fernanda Barbisan

A AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO LÍTIO É INFLUENCIADA POR FATORES
GENÉTICOS, NUTRICIONAIS E FÁRMACOS ANTIDEPRESSIVOS: ESTUDO IN
VITRO

Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal de
Santa Maria (UFSM, RS), como requisito para
obtenção do título de Doutora em
Farmacologia.

Orientadora: Profª Drª Ivana Beatrice Mânica da Cruz
Coorientador: Dr Pedro Antônio Schmidt do Prado Lima

Santa Maria, RS

2017
Ficha catalográfica elaborada através do Programa de Geração Automática da
Biblioteca Central da UFSM, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Fernanda Barbisan

A AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO LÍTIO É INFLUENCIADA POR FATORES
GENÉTICOS, NUTRICIONAIS E FÁRMACOS ANTIDEPRESSIVOS: ESTUDO IN
VITRO

Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal de
Santa Maria (UFSM, RS), como requisito para
obtenção do título de Doutora em
Farmacologia.

Aprovada em 01 de setembro de 2017:

_______________________________________________
Ivana Beatrice Mânica da Cruz, Drª.
(Presidente/orientadora)

_______________________________________________
Maria Amália Pavanato, Drª. (UFSM)

_______________________________________________
Claudia Giuliano Bica, Drª. (UFCSPA)

_______________________________________________
Jacqueline da Costa Escobar Piccoli, Drª. (UNIPAMPA)

_______________________________________________
Melissa Orlandin Premaor Drª. (UFSM)

Santa Maria, RS
2017
DEDICATÓRIA

Ao meu grande incentivador,
minha inspiração,
e minha maior saudade,
meu noninho lindo
Hermes Antônio Lucca.
AGRADECIMENTOS

Ao ser superior que nos guia e protege pelos caminhos da vida.
Ao meu noninho Hermes por todos os ensinamentos, incentivo e pelo exemplo de ser humano
que foste, agora podes me chamar de Doutora Fernanda, como tu gostava. Noninho, siga sempre
ao meu lado, como tu seguistes até aqui.
Aos meus pais, Ione e Vanderlei, e nona Ana, pelo apoio incondicional, paciência e incentivo,
nós sabemos quantas pedras removemos do caminho para chegarmos até aqui.
As minhas tias, que sempre foram muito mais do que isso, pelo apoio, amor, confiança e
motivação incondicional.
A minha irmã Daniela e aos meus primos Laura, Gustavo e Augusto Inácio, o amor e a
admiração de vocês com certeza foi e é pedra fundamental nesta caminhada.
Enfim, família, obrigada por nunca medirem esforços para que eu realizasse meus sonhos!
Aos meus anjos de luz Claudinei Ascoli (in memorian) e Rafael Gobbato (in memorian).
Claudinei, obrigada por ainda criança termos feito o pacto do doutorado, por ter sido
fundamental na minha vinda a Santa Maria e por estar sempre ao meu lado. Rafa queridão, que
saudade de conversar contigo, de ouvir “vai com medo mas vai, brilha muito guria”, sigamos,
conto com teu brilho sempre.
A Ivana Beatrice Mânica da Cruz, que foi orientadora, mãe e amiga, só tenho a agradecer,
agradecer e agradecer por seus ensinamentos (pessoais e acadêmicos), orientações, palavras de
incentivo, puxões de orelha, paciência. Você é um ser humano e uma profissional ímpar não há
palavras para agradecer. Obrigada por tudo, e tu sabes o quanto esse tudo é tudo e infinito.
A Verônica Azzolin, docinho, obrigada por estar comigo nos piores momentos e nos melhores
também, a vida me deu mais uma irmã, e eu sou grata por isso.
A Marcelle Benatti Eickhoff, por ter sido minha base lá no ínicio, lutamos juntas e estamos
colhendo bons frutos.
A Maiquidiele Dal Berto, por todas as conversas, pousos, confidências, senhas e terapias
compartilhadas desde 2012, ao Matheus Marcon pelos mates ao vivo ou “via Whats”.
As gurias de Ronda Alta, em especial a Xanda, e as gurias de Xanxerê (meu quarteto fantástico)
por me incentivarem a chegar até aqui e pelos tantos anos de amizade.
A Cíntia Corte Real, a Jéssica Mota, Eduardo Andrade, pela torcida e parceria sempre.
A Cibele F. Teixeira, ao Gustavo Cardenas Monteiro, ao Moisés H. Mastella, pelo apoio,
amizade, ajuda, pelos inúmeras comidas, dramas e alegrias compartilhadas.
A Andressa Seehaer, a Micheli Jobim, a Thamara Flores, a Neida Pellenz, ao Thiago Duarte,
ao Vitor Bueno, a Dianni Capeleto, Ivo Emílio da Cruz Jung e Vitória Azzolin pelas ajudas,
amizade e torcida sempre.
A “mamis científica” Marta Duarte, por sempre estar disposta a ajudar, sem pedir nada em
troca.
Ao Alencar K. Machado e Eduardo Dornelles por todos os experimentos “vividos”, e bons
momentos compartilhados, pela amizade que criamos e que nos incentiva.
A todos os Ics que passaram pela minha trajetória, são muitos, e todos especiais no seu jeitinho
obrigada pela convivência por crescermos juntos.
Aos alunos de graduação que tive contato durante os períodos de docência do doutorado, a
convivência me fez aprender muito.
A toda equipe Biogenômica, todos vocês foram importantes nessa caminhada e fundamentais
para o meu crescimento profissional e pessoal. Charles Assmann e Beatriz Bonadimann pela
fundamental ajuda durante o desenvolvimento do 1º artigo.
Aos professores de graduação Marco Aurélio Echart Montano e Glauber Wagner por
acreditarem no meu sonho e me propiciarem chegar até o Laboratório de Biogenômica. Glauber
obrigada por estar sempre na retaguarda quando a PCR não dava certo, e eu já não sabia mais
em que variável mexer.
Ao Professor Paulo Bayard, aos Vitor, Werner, Matheus e toda a equipe Biorep, pela paciência
e ajuda sempre que solicitada, por me fazerem sentir “de casa” no Laboratório de vocês.
Ao meu coorientador Pedro Lima, obrigada pelas muitas lições, pelos ensinamentos, por tornar
as coisas mais simples, e por me apresentar esse lindo mundo da neuropsiquiatria.
A equipe UnATI, destacando o Dr. Euler Esteves Ribeiro e Dra. Ednea Maia Aguiar Ribeiro,
obrigada pelas oportunidades, pelo aprendizado e pelo exemplo de luta incansável.
A bolsa Prouni concedida na Graduação pelo mandanto do Presidente Lula, as bolsas de
Mestrado e Doutorado e recursos para desenvolvimento dos projetos concedidos pelo mandato
da Presidenta Dilma. Obrigada pela possibilidade.
Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, e a super secretária Zeli por ser sempre tão
prestativa e solucionar todos os problemas.
EPÍGRAFE

“É melhor tentar e falhar, que se preocupar e ver a vida passar;
é melhor tentar, ainda que em vão, que se sentar fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver ..."
Martin Luther King

“A gente leva da vida, a vida que a gente leva”
Tom Jobim
RESUMO

Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
Centro de Ciências da Saúde
Universidade Federal de Santa Maria

A AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO LÍTIO É INFLUENCIADA
POR FATORES GENÉTICOS, NUTRICIONAIS E FÁRMACOS
ANTIDEPRESSIVOS: ESTUDOS IN VITRO

AUTORA: Fernanda Barbisan
ORIENTADORA: Profª. Drª. Ivana Beatrice Mânica da Cruz
COORIENTADOR: Dr Pedro Antônio Schmidt do Prado Lima

O envelhecimento populacional aumentou a prevalência de doenças crônicas não-transmissíveis, incluíndo
transtornos psiquiátricos como a depressão e transtornos do espectro bipolar (TEBs). Evidências sugerem que tais
transtornos estão associadas a processos crônicos de inflamação e estresse oxidativo. O Lítio, é um dos principais
fármacos da clínica psiquiátrica, e seu principal mecanismo de ação é anti-inflamatório por inibição da enzima
GSK-3β. Entretanto, cerca de 40% dos pacientes não respondem a terapia com Lítio satisfatoriamente. E, essa falta
de resposta pode envolver polimorfismos genéticos, ou ainda interação fármaco-alimento, ou fármaco-fármaco.
Diante disso, nesse trabalho damos ênfase a ação do polimorfismo Val16Ala-SOD2 que causa desbalanço entre
os níveis de Superóxido e peróxido de Hidrogênio e está envolvido com o metabolismo oxidativo e inflamatório.
Moléculas bioativas como xantinas e catequinas presentes nos alimentos, que possuem efeito anti-inflamatório e
antioxidante, e portanto, as mesmas também poderiam influenciar a resposta farmacológica ao lítio. E a interação
lítio- antidepressivos, muitas vezes utilizada em TEBs. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar in vitro a
influência de fatores genéticos, nutricionais e interação farmacológica com antidepressivos na resposta anti-
inflamatória do lítio. Três delineamentos experimentais foram conduzidos. O primeiro trabalho avaliou que a
influência da resposta anti-inflamatória ao Lítio de células mononucleares do sangue periférico (CMSPs) através
de dois estudos complementares. Inicialmente foi conduzido um estudo que buscou confirmar que tal variação
genética poderia causar resposta inflamatória diferenciada avaliando o perfil da imunosenescência destas células.
Para tanto, CMSPs foram obtidas de voluntários com diferentes genótipos Val16Ala-SOD2 e foram cultivadas
durante 15 passagens celulares (60 dias), em condições padronizadas. A cada passagem as CMSPs foram ativados
com fitohemaglutinina (PHA), um antígeno que desencadeia resposta inflamatória. Cada passagem foi iniciada
com uma concentração de 1 x 105 células. A taxa de proliferação celular a cada passagem foi determinada via
ensaio espectrofotométrico do MTT e, eventualmente pela análise do ciclo celular por citometria de fluxo. Também
foram analisados marcadores pró- inflamatórios e marcadores oxidativos. Realizamos um segundo estudo, que
avaliou a influência do polimorfismo Val16Ala-SOD2 na modulação da enzima GSK-3β pelo Lítio através da
análise da expressão gênica via qRT-PCR e dos níveis de proteína via imunoensaio ELISA. Também realizamos
análises com a linhagem comercial de macrófagos RAW 264.7, a fim de confirmar os resultados obtidos em
CMSPs. Para simular o desbalanço S-HP foi utilizado suplementação das culturas com paraquat gerando células
VV-like (com níveis elevados de superóxido) e porfirina gerando células AA-like (com níveis elevados de PH). O
segundo protocolo deste trabalho avaliou o potencial efeito isolado e de uma mistura das xantinas e catequina na
resposta anti-inflamatória do lítio em macrófagos RAW 264.7, através da análise de marcadores oxidativos e
inflamatórios. Por fim, o terceiro protocolo avaliou o efeito da interação entre o Lítio Imipramina, Nortriptilina,
Fluoxetina e Escitalopram também utilizando macrófagos RAW 264.7 como modelo experimental. Neste último
protocolo, foi criado um índice inflamatório (IF) a fim de agregar os resultados obtidos. A fim de validar o IF, foi
conduzida uma análise similar às das células in vitro, em um banco de dados com 154 voluntários. Essa análise
adicional permitiu avaliar a acurácia do IF e sua potencial similaridade com situações inflamatórias que ocorrem in
vivo. Nos estudos in vitro os resultados foram comparados por análise de variância (de um a ou duas vias, conforme
o caso) seguida de post hoc de Dunnet, Tukey ou Bonferroni, conforme o caso. No estudo in vivo foi realizada
uma curva Roc a fim de avaliar se o IF era representativo de um estado inflamatório real. Um padrão de
imunosenescência foi observado em todas as culturas até a 15ª passagem, quando ocorreu uma interrupção no ciclo
celular na fase G0/G1. Entretanto, antes disso, a partir da 10ª passagem celular, ocorreu um estado de hiperativação
inflamatória com altas taxas de proliferação celular e aumento nos níveis das citocinas pró-inflamatórias e dos
marcadores oxidativos. Apesar deste padrão geral, CMSPs AA apresentaram maior intensidade na resposta
inflamatória inicial, enquanto que CMSPs VV tenderam a manter por mais tempo a resposta inflamatória. Portanto,
o conjunto destes resultados corroborou a sugestão de que o desbalanço S-PH tem influência direta na modulação
da inflamação. O segundo estudo do primeiro protocolo observou que, o desbalanço S-PH, tanto geneticamente
determinado pelo polimorfismo Val16Ala-SOD2 quanto farmacologicamente induzido influenciou a resposta anti-
inflamatória do Lítio via modulação da enzima GSK-3β. O desbalanço induziu um efeito anti-inflamatorio mais
intenso do lítio em células AA ou AA-like. No segundo protocolo, que avaliou o efeito de fatores nutricionais na
ação anti-inflamatória do Lítio, especialmente a mistura de xantinas-catequina intensificou a resposta anti-
inflamatória do Lítio via diminuição nos níveis das citocinas pró-inflamatórias, aumento nos níveis da IL-10 e
diminuição de marcadores oxidativos. Por fim, o último protocolo investigou a influência da interação entre o Lítio
e os antidepressivos. O IF foi validado via análise da curva ROC mostrou que o IF é um índice acurado em relação
a inflamação com uma área sobre a curva (AUC) de 0,803 (intervalo de confiança a 95% de 0.715-0,890). Valores
do IF > 2,0 em relação a níveis de Proteína C Reativa > 0.6 μg/mL apresentaram uma sensibilidade de 0,915 e
especificidade de 0,486. Já a interação com antidepressivos, mostrou que quando o Lítio está associado a
Imipramina, ou Nortriptilina ou Fluoxetina, ocorre uma intensificação do efeito anti-inflamação, com uma
diminuição do IF, entretanto a associação com o Escitalopram induz a efeitos pró-inflamatórios, com um aumento
no IF indicando efeito pró-inflamatório desta interação. Em síntese, apesar das limitações metodológicas
relacionadas aos estudos in vitro, o conjunto dos resultados confirmou que o Lítio possui efeito anti-inflamatório
importante, mas que este efeito não é universal, uma vez que ela pode ser influenciado por fatores genéticos,
nutricionais e mesmo pela interação com fármacos antidepressivos. Esses resultados podem ser relevantes na
clínica psiquiátrica.

Palavras-Chave: Polimorfismo Genético. Imunosenescência. Xantinas. Catequinas. Inflamação. Estresse
oxidativo. Depressão. Trantornos do Espectro Bipolar.