Table Of ContentFORSCHUNGSBERICHTE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN
Nr. 2902/Fachgruppe Medizin
Herausgegeben vom Minister fur Wissenschaft und Forschung
Prof. Dr. Hermann Themann
Dr. Martin Fleischer
Dr. Klaus Stahl
RUdiger MeH3
Lehrstuhl fUr Medizinische Cytobiologie
der UniversiHit Munster
Feinstrukturell-morphometrische Untersuchungen
mit dem manuell-optischen
Bildanalysensystem M. O. P. AM 02
der Firma Kontron
Westdeutscher Verlag 1979
AUTORENVERZEICHNIS
Dr. Martin Fleischer
RUdiger MeiO
Prof. Dr. Hermann Themann
Lehrstuhl fUr Medizinische Cytobiologie
der Universitat MUnster
Leiter: Prof. Dr. Hermann Themann
Dr. Klaus Stahl
Medizinische Klinik und Poliklinik
der Universitat MUnster
Direktor: Prof. Dr. Ulrich Gerlach
CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Feinstrukturell-morphometrische untersuchungen
mit dem manuell-o tischen Bildanal sens stem
MOP AM 02 null zwei der Firma Kontron
Hermann Themann ••• - Opladen : Westdeutscher
Verlag, 1979.
(Forschungsberichte des Landes Nordrhein
Westfalen ; Nr. 2902 : Fachgruppe Medizin)
ISBN 978-3-531-02902-3 ISBN 978-3-322-87837-3 (cHook)
DOl 10.1007/978-3-322-87837-3
NE: Themann, Hermann [Mitarb.]
© 1979 by Westdeutscher Verlag GmbH. Opladen
Gesamtherstellung: Westdeutscher Verlag
ISBN 978-3-531-02902-3
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INHALT
1. EINLEITUNG
2. METHODEN 2
2. 1 Bestimmung von Volumen-, Oberfl!chen- und 2
Anzahldichten
2.2 Anzahl-, L!ngen- und Fl!chenmessungen 4
2.3 Apparative Ausstattung und mathematische 7
Verarbeitung der anfallenden Daten
3. ANWENDUNGSBEISPIELE 8
3.1 Tierexperimentelles Material 8
3. 1 • 1 Morphometrische Untersuchung der Galaktosamin 8
hepatitis an Rattenlebern
3.1.2 Feinstrukturelle Ver!nderungen der Rattenleber 10
unterschiedlich alter Tiere nach Applikation
polychlorierter Biphenyle (PCB)
3. 1 .3 Feinstrukturell-morphometrische Untersuchungen 12
von Lebern bei Ratten unterschiedlichen Alters
nach Applikation von technischem Pentachlorphe
nol (PCP)
3.1.4 Der Effekt von Polyenylphosphatidylcholin auf 16
die cholestatische Rattenleber
3. 1 .5 Der EinfluBder Essentiellen Phospholipide 17
"Essentiale" und "N 106" auf den Zellkern der
M!useleber
3.1.6 Die ultrastrukturellen Auswirkungen chronischer 19
Alkoholzufuhr auf die Leberzelle des Goldham
sters
3. 1 .7 Die ultrastrukturellen Auswirkungen chronischer 22
Alkoholzufuhr auf die Skelettmuskelzelle des
Goldhamsters
3.2 Menschliches Untersuchungsgut 24
3.2.1 Morphometrische Untersuchungen an menschlichem 24
Herzmuskelgewebe des linken Ventrikels bei Mi
tralinsuffizienz
3.2.2 Toxisch-nutritiver Leberschaden: alkoholische 24
Hepatopathie.
Feinstrukturell-morphometrische Untersuchungen
an menschlichen Leberbiopsien
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3.2.3 Morphometrische Untersuchungen am Endoplasma- 25
tischen Retikulum der Lebern m!nnlicher Alko
holiker
3.2.4 Quantitative feinstrukturelle Befunde an 27
menschlichen Thrombocyten nach Langzeiteinna~~e
oraler Kontrazeptiva
4. SCHLUSSBETRACHTUNG 30
5. LITERATUR 31
6. TABELLEN UND DIAGRAMME 37
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1. EINLEITUNG
Morphometrisch-stereologische Verfahren haben seit Mitte
der 60er Jahre mehr und mehr Anwendung gefunden bei der
ultrastrukturellen Analyse biologisch-medizinischer Objek
teo Besonders der Schweizer Arbeitsgruppe urn WEIBEL kommt
das Verdienst zu, aus der Minera10gie und Geologie bekannte
Verfahren ftir diesen Bereich nutzbar gemacht zu haben
(s. WEIBEL, 1969).
Dabei werden Anzahl-, Oberflachen- und Volurnenbestirnmungen
an Zellen und intrazellularen Strukturen verschiedener Orga
ne durchgeftihrt. Ziel dieser Verfahren sind reproduzierbare
und objektivierbare Aussagen, die an Hand dieser drei MeB
groBen tiber die untersuchten Objekte gewonnen werden konnen.
Ein bestimmter Funktionsstatus ist durch eine ganze Reihe
von Parametern charakterisiert. So ist etwa eine "normale"
Leber klinisch, biochemisch, makroskopisch und histologisch
erfaBt. Ihre Organstruktur und Zellmorphe prasentiert sich
auch im elektronenmikroskopischen Bild in einer bestimmten,
dazu korrelierenden Weise: Ze11zuordnung, Zellkontakte,
Interzellularraurn, ZellgroBe und -form sowie Anordnung, Gro
Be und Anzahl von Zellorganellen spiegeln - mit einer gewis
sen Schwankungsbreite - den Funktionszustand "Normalitat"
wider. In analoger Weise sind funktionelle Alterationen
oft mit Veranderungen des elektronenmikroskopischen Erschei
nungsbildes vergesellschaftet. Eine Reihe von Noxen ftihrt
z.B. bei Einwirkung auf die Leber zu typischen Scnadigungs
mustern: Veranderungen am glatten und rauhwandigen endoplas
matischen Retikulurn, vermehrte lysosomale Inklusionen, Mito
chondrienlasionen, Vermehrung von Microbodies und Fettein
schltissen usw.
Eine quantitative Erfassung morphol6gischer Veranderungen
erlaubt detailliertere Vergleiche mit den Ergebnissen physio
logisch/klinischer und biochemischer Untersuchungen und ge
winnt auch von daher ihre Bedeutung und Rechtfertigung.
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2. METHODEN
2.1 Bestimmung von V01umen-, Oberflachen und Anzahldichten
Stereologische untersuchungen wollen quantitative Aussagen
Uber eine Struktur in einem komplexen dreidimensionalen
Bezugsraum machen. So sind z.B. die Anzahl der Mitochondrien
pro ml Hepatocyten, die Oberflache der glatt en Membranen pro
cm3 Cytoplasma oder der Volumenanteil von FetteinschlUssen
am ml Hepatocyten bzw. am ml Fettspeicherzelle interessie
rende MeBgroBen. Zuganglich sind bei elektronenmikroskopi
schen untersuchungen nur die jeweils zweidimensionalen Pro
jektionen dieser MeBgroBen. Es ist z.B. umittelbar einsich
tig, daB man aus einem Schnittbild allein und den runden
oder auch elliptischen Anschnittsflachen einiger weniger Mi
tochondrien nicht auf das Volumen dieser Organellen schlie
Ben kann. Dasselbe gilt natUrlich auch fUr die Oberflachen
und Anzahldichte sowie fUr beliebige andere Zellkomponenten.
FUr ein hinreichend groBes Kollektiv von Anschnitten einer
Struktur auf zufallig orientierten Schnittebenen durch das
zu untersuchende Material existieren aber mathematisch for
mulierbare Zusammenhange:
So fand der franzosische Geologe DELESSE schon 1847, daB die
Volumendichte (Vvi) einer Komponente i gleich ist dem Fla
chenanteil an der Einheitsflache, den diese Komponenten im
ebenen Anschnitt einnimmt:
SALTYKOV konnte 1958 nachweisen, daB die Oberflachendichte
SVi einer Komponente i in der dreidimensionalen Testraum
einheit proportional ist zu der mittleren Gesamtlange des
Umfangs aller Profile dieser Komponente in der Einheitsfla
che:
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Die Anzahldichte NVi pro Einheitsvolumen laBt sich nicht
auf einfache Weise mit der Anzahl angeschnittener Profile
NAi auf der gewahlten Einheitstestflache korrelieren. Un
ter einer Reihe von Voraussetzungen lassen sich jedoch
Gleichungen ableiten, die zu gute n und nahezu tibereinstim
menden Ergebnissen ftihren. Die Schnittdicke des Praparates
sollte klein sein gegentiber dem kleinsten Durchmesser der
untersuchten Population~ Forrn- und GroBenverteilung der zu
zahlenden Objekte solI ten bekannt sein. Die gebrauchlichste
Gleichung, die den Zusarnrnenhang zwischen Anzahldichte in dem
Einheitsraum und in der Einheitsflache beschreibt, wurde von
WEIBEL und GOMEZ (1962) angegeben:
K
B
Kist vom Quotienten des dritten und ersten Moments der Gro-
3
Benverteilung der Komponente i abhangig (K = D3 : D1~)'
B ist ein forrnabhangiger Faktor, der vom Achsenverhaltnis
der Anschnittsflachen der Komponente i abhangt. Weitere Glei
chungen zur Anzahlbestimrnung in der Volumeneinheit des Refe
renzsystems, ihre Praktikabilitat und Validitat, sind zusam
menfassend dargestellt und verglichen worden von MAYHEW
(1972) •
Mit VVi = AAi,
.
=!
SVi rr BAi,
3
K
NAi
NVi B ----:l
VVi2
sind die wichtigsten quantitativenRelationen zwischen den
Mittelwerten von MeBgroBen im Einheitsvolumen und ihren zwei
dimensionalen Projektionen auf die (Schnitt-)Ebene angegeben.
Es muB betont werden, daB ihre Gtiltigkeit an Voraussetzungen
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geknlipft ist, die zusammenfassend aufgelistet werden sollen:
1. Die zu untersuchenden Komponenten mlissen homogen im Re
ferenzraum verteilt sein. 1st diese Voraussetzung nicht
erflillt, muB zumindest folgendes gel ten:
1.1 Die Schnittflihrung 5011 zufallig orientiert sein.
2. Die einzelnen Gewebskomponenten mlissen in ausreichender
Zahl vorhanden und einwandfrei zu identifizieren sein.
3. Die Schnittdicke 5011 im Idealfall unendlich dlinn sein.
Sie muB auf jeden Fall klein sein gegenliber dem klein
sten Durchmesser der untersuchten Objektmenge (entspre
chende Korrektur nach HOLMES, 1921). Flir die Praxis be
deutet das, daB sie eine moglichst konstante Dicke von
etwa 50 nm haben 5011.
4. Form-und GroBenverteilung der jeweils betrachteten Kom
ponenten 5011 ten bekannt sein.
5. Die Gewebsentnahme, die Fixation, die Einbettung und die
Schnittanfertigung mlissen strukturerhaltend durchgeflihrt
werden (5. auch WEIBEL, 1969; REITH, 1977; ROHR et al.,
1976). Die drei genannten Gleichungen sind in unterschied
licher Art und Weise robust gegen Abweichungen von diesen
Voraussetzungen.
2.2 Anzahl-, Langen- und Flachenmessungen in der Ebene
Die in der zweidimensionalen Schnittebene durchzuflihrenden
MeBvorgange bestehen aus Anzahl-, Langen- und Flachenmessun
gen.
Eine Anzahlmessung als reiner Abzahlvorgang ist problemlos
und schnell durchzuflihren.
Zur Erleichterung von Langen- und Flachenmessungen wurde auf
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alte und besonders in der Morphometrie zu fruchtbarer An
wendung gekommene Prinzipien zurtickgegriffen, die diese
Messungen zu Punktzahlverfahren vereinfachen.
Grundlage zur Langenbestimmung von Profilumfangen untersuch
ter Komponenten in einer Anschnittsflache bildet das Buffon
sche Nadelprinzip (1777). Es beantwortet die Frage, mit wel
cher Wahrscheinlichkeit Peine zufallig geworfene Nadel der
Lange 1 eine Linienschar aus aquidistanten, im Abstand d be
findlichen Linien schneidet. Buffon gab die Losung dieses
Problems an mit:
P 7~r· l
d
SMITH und GUTTMAN (1953) sowie SALTYKOV (1958) haben auf der
Basis des Buffonschen Nadelprinzips zeigen konnen, daB die
Lange einer Struktur, bezogen auf die Einheitsflache - die
sogenannte "Langendichte" - geschatzt werden kann, indem man
ein Liniengitter tiber die Anschnittsflache legt und die An
zahl der Schnittpunkte der zu messenden Kurve mit den Test
linien auszahlt. Ist IL die Anzahl der Schnittpunkte pro
Einheitslange der Testlinien, so erhalt man folgende Bezie
hung:
y.
2
Ein Verfahren, das die mtihevolle planimetrische Messung einer
Flache ersetzt, geht auf die Methode von ROSIWAL (1898) zu
rUck: Der Flachenanteil einer Komponente in einer Testflache
- AAi - wird durch den Langenanteil geschatzt, den zufallig
auf der Testflache plazierte gerade Testlinien einer Gesamt
lange L innerhalb der betrachteten Komponente einnehmen. Be
zeichnet man diesen Langenanteil mit LL' so erhalt man die
=
Gleichung AAi LL. Die Schatzung des zu bestimmenden Flachen
anteils ist dabei urn so besser, je dichter die Testlinien
plaziert sind.
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GLAGOLEFF (1933) reduzierte den Vorgang der Flachenmessung
auf reines Punktz~hlen, indem er ein regelm~Biges Punktgit
ter tiber die zu messende Flache legte und die Anzahl der
Punkte innerhalb der F1ache (Pp) bestimmte. Er fand heraus.
daB das Verhaltnis von zu messender Flache zur Gesamttest
flache gleich ist dem Quotienten aus der "Trefferanzahl" und
der die Testflache tiberdeckenden Gesamtpunktzahl:
Die dargestellten Punktzahlverfahren sind eigentlich Stich
proben im statistischen Sinne. Entsprechend solI ten sie den
Anforderungen einer strengen Zufalligkeit gentigen. Das be
deutet insbesondere. daB die zur Vernwendung kommenden Test
linienscharen und Gitterpunktnetze eine zufallige Orient ie
rung zu den zu untersuchenden Strukturen auf der jewei1igen
Testflache einnehmen mtissen •. Biologisch-medizinische Objekte
besitzen meist eine inharente Periodizitat bestimmter Sub
strukturen (parallele Anordnung von Myofibrillen bei der
Skelettmuskulatur. typische Schichtung der Epidermis usw.).
Es muB dann darauf geachtet werden, daB die Testsysteme. die
eine hochgradige Anisotropie aufweisen - wie das oft verwen
dete Testliniennetz mit seinen aquidistanten. parallelen Ge
raden oder das bei der Volumenbestimmung gebrauchte regelma
Big aufgebaute Gitterpunktraster - keine Interferenz mit der
Periodik der Komponentenaggregate zeigen.
