Expression of the antifreeze protein gene of a pyrochroid beetle Dendroides canadensis in prokaryote and detection of the protein biological activity

2005·0.31 MB·

by  Zhong-Yuan, Liu

昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&’’(，)（* &）：+,-.+*/ 0112’)()34&-4
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赤翅甲抗冻蛋白基因的原核表达及蛋白生物活性检测
刘忠渊，张富春!，王 芸，吕国栋
（新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 */’’)4）
摘要：根据MCE58EN中序列人工合成赤翅甲 -.&/0’+/.1"$&$/.&1+1的抗冻蛋白基因（$23），将其克隆到载体"M6O3)G3+上，构建
融合表达的重组质粒，转化大肠杆菌 5P&+并进行原核表达。通过优化表达的诱导条件和1Q13R!M6检测，证明人工合成的赤
翅甲抗冻蛋白基因能够特异性地表达，并以可溶性融合蛋白形式存在，相对分子质量约为)’ NQ。抗冻蛋白的生物活性检测
表明，赤翅甲的抗冻融合蛋白能够提高细菌的耐寒能力。
关键词：赤翅甲；抗冻蛋白；原核表达；抗冻活性
中图分类号：S-44 文献标识码：! 文章编号：’)()34&-（4 &’’(）’&3’+,-3’(
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抗冻蛋白（8E@$B#CC9C "#>@C$ED，!HR）又称为热滞 现，抗冻蛋白用以红细胞的低温保存时，保护效率
蛋白（@AC#78% A:D@C#CD$D "#>@C$E，GXR），是一类能抑制 与它们的热滞活性相关（YA8> .# $)<，+--4）。另据
冰晶生长的蛋白质，能在一定程度上降低水溶液的 报道，从黄粉甲 4.&.50+’ (’)+#’0 和云杉卷叶蛾
冰点，并具有热滞活性。抗冻蛋白存在于不同生物 67’0+1#’&.80$ 28(+2.0$&$ 等昆虫中分离的抗冻蛋白活
体中，包括鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌，而鱼类抗 性是鱼类抗冻蛋白或抗冻糖蛋白活性的+’a+’’倍
冻蛋白研究的最多（钟其旺和樊廷俊，&’’&；景晓红 （G:DACEN> .# $)<，+--,；M#8A87 .# $)<，+--,）。
等，&’’&）。抗冻蛋白可在食品的冷冻、储藏、运输 !EF>#BC# 和 Q?78E（&’’’）已从赤翅甲 -.&/0’+/.1
和解冻过程抑制重晶化现象，减少细胞损伤以提高 "$&$/.&1+1 中克隆到了 +/ 种抗冻蛋白基因。由于昆
冷冻食品的质量。抗冻蛋白还可用于人类和动物的 虫抗冻蛋白的多样性暗示了这些抗冻蛋白可能由多
卵、精子、胚胎或肝脏等器官的超低温保存，改善其 基因家族控制编码（!EF>#BC# 8EF Q?78E，&’’’），而且
冷冻质量。M8\#$C%等（&’’/）首次报道了在老鼠的心 这种结构在一定程度上决定了它们产生热滞活性的
脏移植中，用抗冻蛋白低温保藏心脏从而成功地保 潜在机制，抗冻性状往往是多个基因共同作用的结
护了心肌结构。]C%8E$C等（&’’&）研究认为，抗冻蛋 果，因而，单独具有较强抗冻性能的昆虫抗冻蛋白将
白具有稳定膜结构和细胞的功能。进一步研究发 有十分重要的理论研究价值和诱人的应用前景。我
基金项目：国家科技攻关项目（&’’+5!-’+!/&）
作者简介：刘忠渊，男，+-,&年/月生，山东人，硕士，讲师，研究方向为分子生物学及基因工程，6378$%：%9:++4*;+4/<=>7
!通讯作者 !?@A>#B>#=>##CD">EFCE=C，GC%<：*43--+3*(*/&(-；H8I：*43--+3*(*/&(-；6378$%：9B=;IJ?<CF?<=E
收稿日期 KC=C$LCF：&’’)3’+3’)；接受日期 !==C"@CF：&’’)3’43&-
-EG 昆虫学报 )%*!$+*&,&(&-.%!’.+.%! +E卷
们在此基础上，根据抗冻蛋白基因分析，利用 谷胱甘肽 ?*转移酶基因（!?,），所表达的抗冻蛋白
!"#$%#&发表的赤翅甲 !"# 基因序列合成了甲虫抗 与 !?, 形成融合蛋白，因此融合蛋白的纯化参照
冻蛋白基因，以 ’!()*+,*- 为载体构建了融合表达 56%78%9:% 生物技术公司的 !O@C%C6:B#" ?"’6%7BQ" +$
的重组质粒，在大肠杆菌菌株$./-中成功地进行了 的说明书进行。吸取-L== 8.琼脂糖珠悬液，加到I
表达，并对表达产物的生物学活性进行了检测。 8.离心管中；用 + 8.冰冷 -R 5$?缓冲液洗琼脂
糖珠，/ GGGR;，+J离心/ 8:#，重复=次。用超声波
! 材料与方法 破碎仪处理已经诱导表达的细菌，取上清液约 I
8.，加入含有琼脂糖珠和 5$?缓冲液（-S-G .）的
"
!"! 材料 柱子。混匀，+J放置 - 6后用 -R 5$? 清洗琼脂糖
!"!"! 菌株和质粒：大肠杆菌菌株 $./- 和载体 珠I次，加- 8.洗脱缓冲液，混匀放置-GS=G 8:#，
’!()*+,*-为本实验室保藏。 用-LI 8. (’’"#MB7F管收集目的蛋白。
!"!"# 酶及主要试剂：,+ 012连接酶、各种限制性 !"#"& 抗冻蛋白生物活性的检测：取新鲜制备的
内切核酸酶、012 相对分子质量标准物购自 ,%3%4% $./-P’!()*+,*-一级菌液，以 -T的接种比例进行
公司；蛋白质相对分子质量标准物购自华美生物工 二级培养，=<J过夜培养后，菌液稀释- GGG倍，吸取
程公司；谷胱甘肽*琼脂糖树脂为 56%78%9:% 生物技 - GGG .分装到 E个 -LI 8. (’’"#MB7F管中，其中 H
"
术公司产品；其他试剂均为国产分析纯。 个(’’"#MB7F 管中分别加入终浓度为 G、-G、=G、IG、
!"# 方法 <G、>G ;P8.纯化后的抗冻蛋白（经过滤灭菌，以免
"
!"#"! 抗冻蛋白基因的获得：参照!"#$%#&中赤翅 纯化后的抗冻蛋白被细菌污染而影响实验结果），然
甲的 !"# 基因序列（;:：/<=<>=>），由北京 ?@#A:BC"96 后在GJ进行冷处理G 6，/+ 6，+E 6，</ 6，>H 6，-/G 6
公司合成了 =/< A’的 !"# 基因片段，将 !"# 克隆到 和-++ 6，在经过 GJ处理后，立刻分别吸取 -GG .
"
’D0-E*,载体上，构建了重组质粒 ’D0-E*,*%F’；将 菌液在含有氨苄青霉素的.$平板上进行涂板，/EJ
阳性克隆送宝生物工程（大连）有限公司进行序列鉴
倒置培养/+ 6，菌落计数。另外/个 (’’"#MB7F管中
定，以保证 !"# 基因编码序列的准确性。 分别加入终浓度为/GT的甘油和IG ; P8.的牛血
"
!"#"# 原核表达载体 ’!()*+,*-*%F’ 的构建：质粒 清白蛋白（$?2），在 GJ进行冷处理 G 6，/+ 6，+E 6，
的提取、大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转
</ 6，>H 6，-/G 6和-++ 6，吸取-GG .菌液在含有氨
"
化、重组子的筛选及酶切鉴定，均按 ?%8A7BB& 等
苄青霉素的 .$ 平板上进行涂板，/EJ倒置培养
（/GG-）方法进行。用限制性内切酶 $%&4!和 ’!(! /+ 6，进行菌落计数。
酶切大量 ’D0-E*,*%F’，电泳，用回收试剂盒从琼脂
糖凝胶上回收 !"# 基因片段；将质粒 ’!()*+,*- 同 # 结果与分析
样用 $%&4!和 ’!(!双酶切，HIJ，-I 8:#，酶灭活。
用, 012连接酶连接质粒与胶上回收 !"# 基因片
+ #"! 原核表达载体 ’()*+%,+!+-.’的构建与鉴定
段，对重组子筛选及鉴定后得到’!()*+,*-*%F’。
首先用 $%&4!和 ’!(!双酶切 ’D0-E*,*%F’，然
!"#"$ 诱导条件的优化：为使目的蛋白在表达体
后将切下的 !"# 插入到表达载体 ’!()*+,*- 的
系中含量最大，必须对诱导条件进行优化。主要考
虑/个因素：加入 K5,!进行诱导时起始菌体的密
度和加入 K5,!的终浓度，而诱导时间（大于 /LI 6）
对目的蛋白的含量和产率的影响很小（$@7; %#M
D@C6:#;，/GGG）。为了得到较优的诱导条件，采用起
始菌体密度为GL/、GL+、GLI、GL>、-LG（N0 ）共 I 个
HGG
梯度，K5,! 终浓度为 GL/、GLI、GLE、-LG、-LI 88BOP.
共I个梯度，诱导时间均为 + 6，诱导温度为 /+J。
经 ?0?*52!( 和光密度扫描检测后，确定合适的起
始菌体密度和 K5,!浓度。 图- 表达质粒’!()*+,*-*%F’的构建图
!"#"% 融合蛋白的纯化：由于质粒’!()*+,*-带有 U:;V - WB#QC7@9C@7"BFC6""X’7"QQ:B#’O%Q8:M’!()*+,*-*%F’
$期 刘忠渊等：赤翅甲抗冻蛋白基因的原核表达及蛋白生物活性检测 %T%
!"#!!和 $%&!双酶切位点，转化大肠杆菌"#$%，在 <9 为%>$（? 预实验结果）时，诱导表达的蛋白量降
=&&
含有%&& ’()#氨卞青霉素的 #" 平板上筛选重组 为最低。对不同的起始菌体密度而言，诱导表达的
"
子，获得重组表达质粒 *+,-./0.%.12*（图 %）。 蛋白量随着 780+ 的浓度增加而逐渐增加，780+ 的
!"#!!和 $%&!双酶切鉴定阳性克隆，电泳片段大 浓度增至&>? ))@A(#时，诱导表达的蛋白量已达最
小与预期的3$4 5*基因片段一致，其中 %’( 基因与 大；当继续增大 780+的浓度时，诱导表达的蛋白量
+60共阅读框融合，从而形成融合表达载体。 却呈逐渐减少的趋势，这与高浓度 780+对细菌的生
!"! 诱导条件的优化 长有一定的抑制作用相符合（"BC’ 1DE FBG;HD’，
对诱导条件的起始菌体密度和加入 780+的终 $&&&）。当 780+的浓度为 %>& ))@A(# 时，未见蛋白
浓度进行 696.8:+,分析（图 $）。由于每种组合在 表达。通过实验发现<9 为&>?时、780+为&>/，为
=&&
加入 780+后均诱导 / ;，确保了 %’( 能得到最大量 优化的起始菌体密度和 780+终浓度。随着诱导时
的表达。结果显示，随着起始菌体光密度值（<9=&&） 间的增加（$>? ;之内），目的蛋白含量也逐渐增加，
的增大，其诱导表达的蛋白量也逐渐增大，当 <9 当目的蛋白含量增至最大值后（$>? ;之后）就不再
=&&
增至&>?&时，诱导表达的蛋白量增为最大；当<9 增加。通过以上的分析，优化的诱导条件应为：
=&&
继续增大时，诱导表达的蛋白量却逐渐减少，至 <9 为&>?，780+为&>/ ))@A(#，诱导时间为$>? ;。
=&&
图$ 赤翅甲抗冻蛋白表达诱导条件的优化
IH’J $ 0;K@*GH)1AHDEBLGHMKL@DEHGH@D2@CKN*CKOOH@D@21DGH2CKKPK*C@GKHD
%：*+,-./0.%未诱导Q@GHDEBLKE；$：*+,-./0.%用&>?))@A(#780+诱导7DEBLKE5R&>?))@A(#780+；3：*+,-./0.%.12*未诱导Q@G HDEBLKE；
/S4：*+,-./0.%.12*，起始菌体<9 分别为&>$，&>?，&>T，%>&，用&>?))@A(#780+诱导7DEBLKE1G&>$，&>?，&>T，%>&@2G;KOG1CGHD’51LGKCH1A
=&&
<9 5R&>? ))@A(# 780+，CKO*KLGHMKAR；T：*+,-./0.%用&>? ))@A(# 780+诱导 7DEBLKE 5R &>? ))@A(# 780+；U：*+,-./0.%.12*未诱导 Q@G
=&&
HDEBLKE；%&S%/：*+,-./0.%.12*分别用&>$，&>/，&>=，&>T，%>&))@A(#780+诱导7DEBLKE5R&>$，&>/，&>=，&>T，%>&))@A(#780+，CKO*KLGHMKARJ
!"# 表达蛋白的纯化
对所表达的蛋白进行纯化，得到一条抗冻蛋白
融合蛋白条带（图 3），纯化蛋白的浓度约为 &>% ’(
"
)#。
!"$ 抗冻蛋白生物活性的检测
在加入终浓度为&、%&、3&、?&、4&、U& ’()#纯化
"
后的抗冻蛋白，&V冷处理不同时间，$TV倒置培养
$/ ;后，菌落计数结果（3组重复）见表%。为了使实
验的数据满足方差分析的条件，将实验数据做对数
变换（浓度为& ’()#抗冻蛋白的对照组数据除外）
"
后，进行可重复双因素方差分析（表 $）。从方差分
析结果可以看出，浓度与时间差异在#W&>&% 水平
上显著，交互作用也显著，因此，甲虫抗冻蛋白提高 图3 赤翅甲抗冻蛋白的纯化
低温抗性不仅与浓度及时间有关，而且与两者的交 IH’J 3 0;K*BCH2HL1GH@D@21DGH2CKKPK*C@GKHD
%：*+,-./0.%.12*表达总蛋白,N*CKOOKEG@G1A*C@GKHDO；$：纯化的蛋
互作用也有关。
白8BCH2HKE*C@GKHD；3：蛋白质相对分子质量标准8C@GKHD)1CXKCJ
4=: 昆虫学报 01’(2+’-3-)-4.1(!.+.1( ;=卷
表! 不同浓度赤翅甲抗冻蛋白处理不同时间的菌落数
"#$%&! "’&$#()&*+#(,%,-+&.)*&#)&/0+)’/+11&*&-)#-)+1*&&2&3*,)&+-(,-(&-)*#)+,-.+-/+11&*&-))+4&.
处理时间（!） 抗冻蛋白浓度 *+(,$(&#%&)+(+-%(&)-#$$.$/#+&$)(（!01’2）
"#$%&’$(&&)’$ 3 43 53 63 73 83
3 44549:45 44569534 7789:;5 <749453 7==947; =<39<:
:; ;3=94<3 <469=7 675958= 6<49=6 ;7:9;37 63795<=
;= 393 4:69<7 ;5694<4 84395:< 48339:7: :37;9:84
7: 393 4;:9:< =739:4= :7;;976: :=;;97;; ::5;95=
8< 393 :;<94; 47849:48 6<4:9:;:6 <<759:38< :6<49<=5
4:3 393 65:943= 5635958= 4333=9:65 43<7=9:=3= 43<:59447<
4;; 393 =3:94;7 753:94566 4<;<79:<;3 54353956;= 5:6379=78;
表5 赤翅甲抗冻蛋白提高细菌低温抗性方差分析 表达的方式，成功地表达获得了具有活性的抗冻融
"#$%&5 "’&6#*+#-(&#-#%7.+.,1#-)+1*&&2&3*,)&+-1,* 合蛋白。
+43*,6+-8)’&%,0)&43&*#)9*&*&.+.)#-(&,1$#()&*+# 在检测不同浓度的甲虫抗冻蛋白提高细菌低温
差异来源 抗性效果中，浓度与时间是交互作用的，即随着浓度
!! "# $! % % ,#)&
>+?#,$+-@%#)%&)+(
的升高，时间的延伸，存活的菌落数明显增多。如在
浓度*+(,$(&#%&)+( :3A;; < 5A;4 4<:A=<!! 5A37
时间")’$ 4:A67 ; 5A4; 463A47!! 5A<3 83!01’2抗冻蛋白浓度的作用下，从3 !的=<3个单
交互作用B(&$#%,&)+( 7A<3 :; 3A5: 46A4;!! :A37 菌落到4;; !后的 5: 637 个单菌落，菌落数显著增
误差C##+# 4A;< 73 3A3: 加。可以初步说明细菌在抗冻蛋白的保护下，在
总计"+&%D ;:A37 43;
3G，可能依然在繁殖，证明了原核表达的抗冻蛋白
!!"E3A34F
具有强的抗冻保护作用。
在对不同浓度的甲虫抗冻蛋白提高细菌低温抗
实验室常用甘油保存细菌菌种，本研究发现甘
性效果的检测中，从存活菌落数的变化趋势可以看
油保存的菌种在3G冷处理;= !后，:=G培养过夜，
出：细菌在3G冷冻处理 :; !后，对应于不同抗冻
没有菌落出现，如果将其置于 57G培养，就会出现
蛋白的浓度，其存活菌落数呈下降状态；当;= !后，
单菌落；将抗冻蛋白加入，3G冷处理时间越长，
存活菌落数呈上升状态，而且抗冻蛋白的浓度越大，
:=G培养过夜后出现的单菌落越多。这一现象说明
这种趋势越明显。但是对应于没有加抗冻蛋白的对
抗冻蛋白对细菌具有保护作用，能够促使细菌达到
照组，处理 ;= ! 后，未见有菌落出现。在浓度及时
最佳的繁殖状态，也初步表明抗冻蛋白与甘油的作
间交互作用中可以看出，随着浓度的升高，时间的延
用机制是不同的，其作用机制有待于深入研究。
伸，存活的菌落数明显增多。
目前通过抗冻蛋白基因改变动植物抗冻活性的
另外在加入终浓度为 :3H甘油，3G进行冷处
研究，最多使用的是鱼类抗冻蛋白基因，将昆虫抗冻
理不同时间，:=G倒置培养:; !，菌落计数结果是：
蛋白基因通过基因工程的方法获得大量的抗冻蛋
3 !为4 4:79447，:; !为 <359468，;= !后没有菌
白，利用抗冻蛋白就能获得新的有效抗冻技术和产
落出现。将没有长出菌落的平板放在 57G培养过
品。尹明安等（:334）将抗冻蛋白基因整合在 ") 质
夜后又出现了单菌落。加入 63 0 1’2 的 I>J，在
! 粒上，用叶盘法转化郁金香、烟草、油菜等，获得了一
;= !后同样没有菌落出现。
定的抗冻力。此后，通过基因工程方法获得了多种
抗冻植物。由于昆虫抗冻蛋白的活性明显高于鱼类
: 讨论
和植物的抗冻蛋白，其应用前景更广阔。本研究通
过原核表达并证实了昆虫抗冻蛋白的活性，为利用
由于对甲虫抗冻蛋白的研究工作还处于起始阶
昆虫抗冻蛋白基因进行转基因植物和蛋白质工程生
段，因而得到大量纯化的具有天然活性的蛋白对于
产抗冻蛋白产品提供了科学的理论依据。
进一步开展其功能和作用机理的研究是非常重要
的。由于融合蛋白易于纯化和进行检测，所以在大 参 考 文 献（;&1&*&-(&.）
肠杆菌中表达外源蛋白时，最常用的方法是采用融
J(L+#-$# *J，M?’%( NO，:333A BP+D%&)+( %(L ,!%#%,&$#).%&)+( +- ,MQJ
合表达的方式（K+#L &’ ()F，4884），本研究采用融合 ,D+($P$(,+L)(0 %(&)-#$$.$/#+&$)(P +- &!$ /R#+,!#+)L S$$&D$ *&+",-."&/
(期 刘忠渊等：赤翅甲抗冻蛋白基因的原核表达及蛋白生物活性检测 DW$
!"#"$%#&’&! ()*+#",)-.#&%!/012&’),)32，"#：$#%&$’() .8>:218.，V1,TP，G8,-16V，S1>>8;E，Q619.，N6L8,/I，E8,2A，3602
*+,-.，.+/012-3，(444) 5,678999/,:/8-189/61;<,6=808/8,6>6-6+9<,6/812 R，(44() M ;870:219; J6, 9/:L1>1H:/162 6J ;8;L,:289 :/ >6Y
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B,:0:;QM，Q16+OF，S:>T8,UP，V:=1895Q，DCC’) RK<8,:7/1=8:2/1J,88H8 (44D! 抗冻蛋白及其在植物抗冻基因工程中的应用! 西北植物
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